專利名稱：一種新的肋脈羊肚菌m8-13液體發酵物在保健品及醫藥開發中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新分離的羊肚菌M8-13及其在醫藥及保健品開發中的應用。
背景技術：
羊肚菌(Morchella sp.)是世界著名的(藥)食用菌，在美國被稱為“陸地魚”， 歐美一些發達國家認為它是人體營養的高級補品。在世界各地均有分布。羊肚菌子實體含有多種化學成分，據分析測定，每IOOg干品羊肚菌中含水分12. 869g，脂肪3. 829g,蛋白質 22. 069g，其中蛋白質含量是木耳的2倍，香菇的1. 5倍(龍正海等，1997)，且極易被人體吸收，這一點是其他高蛋白食品難以比擬的。羊肚菌含有10種氨基酸，特別是人體所必需的氨基酸含量豐富，高出一般食用菌的25% — 40%。羊肚菌中維生素和礦物質元素種類齊全，含量高，含維生素B及煙酸、生物素、 哆醇、葉酸、多種氨基酸等。每100克羊肚菌含礦物質元素鉀2. 89g，磷1. 59g，分別是冬蟲夏草的7倍和4倍鋅的含量是香菇的4. 3倍，猴頭菌的4倍；鐵的含量是香菇的31倍，猴頭菌的12倍(陳向東等，2002)。羊肚菌中還含有鈣、鎂、鈉、鉻等人體所需的元素，尤以有機鍺含量高。多種礦物質的存在，使羊肚菌更顯得身價不凡。國內外的研究主要集中在多糖、氨基酸和脂肪類化合物，另外關于酶、吡喃酮抗生素、無機元素、色素、醇、留醇和皂苷類也有報道1-3。由于羊肚菌的菌絲體不但含有子實體的各種營養物質和活性成分，而且還能較好的保持子實體獨特的風味，并適于工業化發酵生產，所以羊肚菌菌絲體深層發酵研究近年來得到了迅速的發展，開發利用菌絲體、發酵液的報道也很多。深層發酵技術具有易操作、菌絲體增殖快、生產周期短、產量大等優點， 以深層發酵菌絲體和發酵液為主要原料提取羊肚菌各種營養成分和活性成分，可明顯降低成本，提高生產效率。但是，目前國內還沒有成熟羊肚菌菌絲體及多糖等方面的產品上市。羊肚菌營養豐富具有較高的藥用價值，開發出系列保健品將具有廣闊的市場前景。野生羊肚菌資源量有限、人工栽培不成功、野生羊肚菌國際市場供不應求等因素，使羊肚菌價格逐年上漲(達2000元/公斤)。因此，通過羊肚菌發酵開發保健品將為解決人類在免疫機能低下、抗藥性等多方面醫學難題。大型真菌多糖免疫增強機制主要是從免疫器官、免疫細胞和免疫分子各層次刺激巨噬細胞、淋巴細胞、T淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)、殺傷細胞、B細胞，增加他們的數量，增強他們的活性，進而促使免疫系統發揮作用。多糖從免疫器官層次上促進胸腺和脾臟的生長和分化，增加他們的重量，進而促進免疫器官中的T細胞、B細胞和巨噬細胞的數量增加。多糖從免疫細胞層次上促進T細胞、B細胞、單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、殺傷細胞、自然殺傷細胞的成熟、分化和分泌。羊肚菌科(Morchellaceae)，不僅營養豐富，風味獨特，羊肚菌還具有較高的藥效，其菌體內含有大量的多糖等成分，具有較強抗腫瘤作用， 調節免疫功能，抗疲勞，并能減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。由此可見，羊肚菌是是一種具有開發前景的珍稀食用菌，并可出口創匯，其在醫藥、食品、健品、化妝品等領域具有較高的應用價值。羊肚菌含有較高的蛋白質碳水化合物多種氨基酸多種維生素等營養成分；與冬蟲夏草功能相同，是一種不含任何激素無任何副作用的天然補品，常吃不但可提高免疫力，還可消除面部的色斑黃斑雀斑使皮膚變白變嫩[2]。但目前，對羊肚菌有效成分的提取與純化研究尚不夠深入，關于羊肚菌對細菌等的抑制作用基本沒有查到相關報道。現有技術中的問題羊肚菌作為一種珍稀食藥用真菌，其研究仍停留在形態學和生態學水平，對其營養生化特征的研究很少。國內至今沒有對羊肚菌多糖進行過較系統研究。近幾年，國內學者對羊肚菌多糖的研究取得了一定進展。賈建會等[11]以深層發酵的羊肚菌菌絲體和發酵液為主要原料提取羊肚菌多糖，對影響多糖提取率的幾個因素分別進行了對比實驗，并對多糖進行了純化及組分鑒定。魏蕓等[12]從液體深層發酵所得的羊肚菌發酵液中提取了 3 種羊肚菌純多糖，分析了其組分和結構。李群[13]用蒽酮比色法進行了羊肚菌多糖含量的測定，為羊肚菌多糖的深入研究奠定了基礎。而羊肚菌菌絲體在營養成分上與子實體相當[15]。由于羊肚菌不能進行大規模的人工栽培，因此在食用羊肚菌子實體的同時，人們更側重于羊肚菌菌絲體的發酵研究。1958年J. Sguest首次在發酵罐內培養羊肚菌菌絲球，并進行了 25000加侖的生產試驗，上世紀60年代以來，美、法等國開始大規模生產其菌絲體，用以制造調味品，其產品深受消費者的歡迎。目前[14]國外已經能夠進行500L以下規模的發酵生產，并出現了專門適于羊肚菌發酵的設備。我國研究雖然較為滯后，目前仍處于中小試階段，但近年來研究取得了較大的進展。人們對羊肚菌液體菌種、液體培養基進行了廣泛的研究劉士旺等[16] (1998)探索了羊肚菌液體培養條件并篩選了培養基，趙良啟等[17](1999)通過搖瓶正交試驗研究了尖頂羊肚菌液體發酵的合適條件。而今，人們都致力于尋找羊肚菌菌絲的最優發酵條件，以求羊肚菌菌絲產量達到更高，使效益更高。
發明內容
在實踐中已經證明，只有獲得較高活力、生產性能優良的菌株，才有可能實現成功發酵和生產，降低生產成本。通過自然選育淘汰活力差、發酵能力弱的菌株，為進一步菌株改良和發酵生產打下一個堅實的起點和基礎。因此，本發明從菌種選育著手，主要對本實驗室已有的M株羊肚菌進行產多糖和菌絲體干重的初步篩選。從菌種方面的優勢作為以后大規模發酵生產的前提，旨在提高胞外多糖量的同時生物量也達到較高水平。在一個實施方案中，本發明提供了一種肋脈羊肚菌(M0rChellaC0Stata)M8-13，其保藏號為CGMCC3899。在另一個實施方案中，本發明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13用于發酵生產肋脈羊肚菌菌絲體的用途。在另一個實施方案中，本發明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備保健品中的用途。優選地，其中所述保健品用于降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強免疫功能、抗疲勞，以及減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。在另一個實施方案中，本發明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備用于治療疾病藥物中的用途。優選地，其中所述疾病包括腫瘤、高血脂、免疫功能失調。在另一個實施方案中，本發明提供了一種用所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體發酵生產真菌多糖的方法，包括
(1)發酵培養所述肋脈羊肚菌M8-13的孢子；(2)離心沉淀步驟(1)的發酵液中多糖；(3)提取并純化步驟O)中沉淀的多糖。優選地，其中步驟(3)的提純方法為水提醇沉法。在另一個實施方案中，本發明提供了所述肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在用于抑菌的藥物的制備中的用途，優選地，其中所述細菌為金黃色葡萄球菌。
圖1示出了羊肚菌M8-13子實體(左)及培養的菌絲體(右)。圖2示出了羊肚菌M8-13固體培養物(左)及M8-13胞內物質對金黃色葡萄球菌的抑制(中)，對照菌株(右)。圖3示出了 M8系列羊肚菌生物量的比較，小寫字母表示5%差異顯著水平，大寫字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯。圖4示出了 M8系列羊肚菌第5天產胞外多糖的比較，小寫字母表示5%差異顯著水平，大寫字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異顯
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者O圖5示出了 M8和M9系列羊肚菌第5天產胞內多糖的比較，小寫字母表示5%差異顯著水平，大寫字母表示差異顯著水平；相同字母表示差異不顯著，不同字母表示差異
顯者ο
具體實施例方式本發明的菌株的篩選、鑒定、多糖的測定篩選、抗菌活性的篩選等都是在中國，青海西寧，青海大學謝占玲教授的實驗室中進行的。羊肚菌是世界著名的野生食(藥)用菌， 肉質脆嫩鮮美、營養和藥用價值極高，故在食品、醫藥、保健、化妝品等領域顯示出極大的開發潛力。近年來，由于人工砍伐森林、水土流失、鼠害、人類的過度活動及對經濟利益追逐等，青藏高原羊肚菌資源急劇減少。本發明的發明人收集并成功分離純化青藏高原羊肚菌屬M株分離株純培養物 (分別屬黃羊肚菌和黑羊肚菌涵蓋了 5-6個種)，試驗菌株:M8和M9系列菌由青海大學生物科學系微生物實驗室2008年5月和2009年5月從青藏高原采羊肚菌分離得到。發明人還選用羊肚菌51009 (Morchella esculenta 51009，中國農科院)菌株做對照。實施例1羊肚菌的收集將采集自青藏高原的羊肚菌表面處理干凈，用95 %的乙醇擦拭后，放于干凈的平皿或廣口瓶中，置于烘箱中40°C下，待孢子大量彈出后，挑取其孢子，在PDA(土豆20%、蔗糖2%、瓊脂1. 5-2%, pH自然)平板上劃線。25°C培養一天后用顯微鏡觀察，待觀察到有單個孢子萌發后，再將萌發處的培養基切下轉移于另一 PDA平板上。保存在PDA斜面培養基中。發明人對這些菌株進行液體培養，所有菌株都先在PDA固體培養基上活化，液體發酵培養基(KH2PO4 0. 1%,MgSO4 0. 1%，蔗糖2%，蛋白胨0. 5%)，再其轉到150mL三角瓶裝的液60mL的液體發酵培養基中，在25°C下、lOOr/min的條件下進行培養。
在所培養的M株羊肚菌中，對其生物量、胞外多糖及其對應黃色葡萄球菌的抑制作用進行研究。通過對其形態學特征的分析(子實體的形態特征，例如菌絲體的寬度和生長習性)及它的ITS序列，鑒定菌株肋脈羊肚菌(Morchella Costata)M8-13。對23株羊肚菌進行了胞內和胞外抗菌實驗篩選，供試菌種為乳酸大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌；并用蒽酮硫酸法測定了 23株羊肚菌的菌絲體胞內多糖含量。實施例2篩選生物量及胞外多糖產量高的菌株將斜面液體石蠟封存的菌種轉接至PDA固體培養基上，25°C下恒溫光照培養，其中M8系列和M51009培養5天。在PDA培養基中進行菌種活化后，再將其轉到150mL三角瓶裝液60mL的液體發酵培養基中，每種菌株做3個平行對照，25°C和lOOr/min的條件下進
行培養。(1)胞外多糖的沉淀分別將培養到第3天、第4天、第5天的羊肚菌發酵液吸出4mL，以3500r/min離心 15min，每個離心管吸3mL上清液，加入9mL無水乙醇，_10°C沉淀M小時。(2)胞外多糖的測定將沉淀的多糖以3500r/min離心15min，棄上清，加入3mL蒸餾水在60°C水浴中溶解，稀釋30倍，配成多糖溶液，用蒽酮硫酸法測定多糖，取多糖溶液2mL，置于冰水浴5min 后，在冰水浴中加蒽酮顯色劑(蒽酮&S04=lg 500mL，待蒽酮溶解后即成)6mL，混勻， 沸水浴15min，然后再次置于冰水浴中5min，室溫下平衡lOmin，使用UV-9200紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器公司)在620nm處比色，結果如圖4所示。葡萄糖標準曲線方程為:y = 9. 5256x-0. 0027 (R2 = 0. 9993)表1菌株的胞外多糖含量
菌株編號胞外多糖(g/L)
M8-10.272
M8-20.265
M8-90.264
Γ_οο Μ8-140.256
Μ8-110.254
Μ8-70.243
Μ510090.240
Μ8-50.236
Μ8-130. 194
Μ8-3_0. 125_(3)菌絲體干重的測定將發酵8天的發酵液以紗布過濾以獲得菌絲體，用蒸餾水反復沖洗3次，置烘箱中 55°C下烘至恒重，稱重，結果如圖3所示。表2菌株的菌絲體干重處理菌絲體干重均值(g/L)
權利要求
1.一種肋脈羊肚菌(Morchella Costata)M8-13，其保藏號為 CGMCC3899。
2.權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13用于發酵生產肋脈羊肚菌菌絲體的用途。
3.權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備保健品中的用途。
4.權利要求3所述的用途，其中所述保健品用于降血脂、抑氧化、抗輻射、抗腫瘤、增強免疫功能、抗疲勞，以及減輕癌癥患者放化療引起的毒副作用。
5.權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在制備用于治療疾病藥物中的用途。
6.權利要求5所述的用途，其中所述疾病包括腫瘤、高血脂、免疫功能失調。
7.一種用權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體發酵生產真菌多糖的方法， 包括(1)發酵培養權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13的孢子；(2)離心沉淀步驟(1)的發酵液中多糖；(3)提取并純化步驟中沉淀的多糖。
8.權利要求7所述的方法，其中步驟(3)的提純方法為水提醇沉法。
9.權利要求1所述的肋脈羊肚菌M8-13或其菌絲體在用于抑菌的藥物的制備中的用途。
10.權利要求9所述的用途，其中所述細菌為金黃色葡萄球菌。
全文摘要
本發明涉及一種新分離的羊肚菌(Morchella)M8-13及其在醫藥及保健品開發中的應用。
文檔編號A61P31/04GK102174414SQ20101062298
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者戚永躍, 謝占玲 申請人:青海大學