4′-甲氧基-7-羥基異黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應用及其制備方法

專利名稱：4′-甲氧基-7-羥基異黃酮在制備抗腫瘤藥物中的應用及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤化合物的制備方法及包含該抗腫瘤化合物的藥物在制備抗腫瘤藥物方面的應用，特別涉及一種來源于熊膽的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮作為核受體小分子調節劑的制備方法及在抗腫瘤藥物中的應用，屬于醫藥技術領域。
背景技術：
腫瘤(Tumor)是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的新生物。一般認為，腫瘤細胞是單克隆性的，即ー個腫瘤中的所有瘤細胞均是ー個突變的細胞的后代。一般將腫瘤分為良性和惡性兩大類。所有的惡性腫瘤總稱為癌癥(cancer)。瘤細胞具有異常的形態、代謝和功能，并在不同程度上失去了分化成熟的能力。腫瘤生長旺盛，并具有相対的自主性，即使致瘤因素已不存在，仍能持續性生長，提示腫瘤細胞的遺傳異常可以傳給子代細胞。每個腫瘤細胞都含有引起其異常生長的基因組的改變。腫瘤性增生不僅與機體不協調，而且有害。核受體(NR，Nuclear Receptor)是ー類介導類固醇激素、維生素以及脂肪酸衍生物等生物學作用的細胞內蛋白質，是真核細胞轉錄因子成員中最大的ー個基因家族，是預防、治療癌癥、腫瘤的理想靶點藥物，核受體以一種配體依賴的調控模式參與正常細胞或癌細胞的許多不同的生物學過程，參與細胞増殖、分化、凋亡、免疫、代謝等人體幾乎所有的生理過程，人類許多疾病的發生均可能與其異常調控有關。因此，該基因家族被認為是發現和開發預防與治療癌癥、腫瘤藥物的ー個理想的靶點。核受體被認為是繼細胞跨膜受體、激酶之后最重要的分子靶點。據2002統計， 美國百強處方藥中有16種藥物是針對核受體，其中包括Wyeth Ayerst, Glaxo Wellcome, SmithKline Beecham，Lilly和Roche等著名制藥公司。針對核受體靶點家族已成功開發了許多藥物，并在臨床上廣泛用于治療癌癥、糖尿病、心血管疾病以及腦癡呆等各種疾病，例如用于治療前列腺癌的針對雄性激素受體(AR)的Casodex ；用于治療心臟衰竭的針對皮質激素受體(MR)的Aldactone ；用于治療糖尿病的針對過氧化物酶體增生受體(PPAR)開發的藥物Avandia ；用于治療痤瘡的針對維甲酸受體(RAR)的Accutane以及廈門大學張曉坤教授開發用于治療皮膚癌的針對視黃醇受體(RXR)的專利藥Targretin等等。Nur77是ー種類固醇_甲狀腺激素_類維生素A類轉錄因子，由于其配體并未被鑒定確認，因此被稱作孤兒核受體。孤兒受體Nur77又稱為TR3或NGFI-B，是核受體超家族的中藥成員，是ー種立刻早起基因，其表達可以被血清、生長因子、十四烷酰佛波醋酸酷-13(TPA)以及鈣信號迅速誘導。Nur77是ー種細胞存活因子，可以介導多種存活信號通路，包括蛋白激酶A、蛋白激酶C、MAPK和NF-κ B通路；Nur77也是ー種促凋亡因子，它可以對多種凋亡因子，如鈣離子載體、佛波酯、鎘等做出應答。目前研究表明Nur77雖然通常情況下存在于細胞核中，但在某種情況下，也能轉
3移到線粒體中，并引起線粒體膜的滲透性變化，最終導致細胞凋亡。最近發現，一直被認為是通過誘導凋亡前期基因來誘導凋亡的轉錄因子P53也可以從細胞核轉移到線粒體，并同 ー種熱休克蛋白Hsp70相互作用。Nur77作為p53對線粒體的特異性靶標，可以防止抗凋亡蛋白Bcl-2阻止線粒體膜的滲透性變化，從而促進凋亡的發生，導致細胞死亡。同樣，在某種情況下，Nur77又可以通過對線粒體的局部作用來完成類似于其它因子的凋亡前期功能，在受到凋亡誘導劑刺激后，Nur77從細胞核移位至細胞質，并與線粒體膜發生結合，導致細胞色素c釋放，從而啟動凋亡過程。同吋，Nur77還能夠與另ー細胞核內受體視黃醇X受體(RXRs)結合成異源ニ聚體并移位到細胞質，作用于線粒體上的Bcl-2，使后者從抗凋亡分子轉化為促凋亡分子，從而促進凋亡的產生。最新研究表明來源于Nur77的ー個9個氨基酸序列的小肽片段NuBCP-9及其對映體，可以直接作用于Bcl-2，通過改變Bcl-2的構象， 將Bcl-2由抗凋亡蛋白轉變為促凋亡蛋白。這ー研究結果表明作用于Nur77的小分子化合物很有可能通過這ー機制發揮獨特的抗癌作用。對核受體TR3誘導表達用于疾病預防和治療的研究目前主要有申請號為 200810027772.9的中國發明專利申請公開具有誘導核受體TR3表達的強心苷類化合物，該強心苷類化合物具有以下通式其中=R1為CH3、CHO或CH2OH ；も為H或OH ；民為H或OH ；R4為糖類所組成的直鏈糖鏈或支鏈糖鏈。該強心苷類化合物，能夠誘導核受體TR3表達，從而可以作為誘導劑應用于制備預防和治療癌癥、肝炎、動脈粥樣硬化等藥物；申請號為200810200713. 7的專利申請公開了一種用于制備治療癌癥的藥物--紫草素衍生物，該藥物以孤兒受體Nur77作為作用靶點，該紫草素衍生物通過作用于孤兒受體Nur77，誘導腫瘤細胞凋亡，達到治療癌癥的目的。

發明內容
本發明的目的在于提供一種來源于熊膽的具有核受體調節作用的化合物異黃酮， 其制備方法及其在抗腫瘤藥物中的應用。為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種核受體Nur77的誘導劑4'-甲氧基-7-羥基異黃酮的制備方法，包括依次進行的步驟1)對熊膽粉進行提取處理，制得熊膽醇提物，其中提取溶劑為甲醇或乙醇ツ)對熊膽醇提物依次進行大孔樹脂柱分離、硅膠柱層折，反相硅膠柱層折，即得。
其中，步驟1)中所述提取溶劑甲醇或乙醇的體積與熊膽粉的重量之比為 8-16 1，即當熊膽粉的重量(干重)為Ikg吋，甲醇或乙醇的體積為8-16L;當熊膽粉的重量(干重)為Ig吋，甲醇或乙醇的體積為8-16ml。特別是，步驟1)中所述熊膽醇提物按照如下步驟制得將熊膽粉加入到甲醇或乙醇中，攪拌，接著進行超聲提取，然后過濾，收集濾液，濾液干燥，即得。特別是，超聲提取的時間為30-60min。特別是，采用超聲提取熊膽粉2-3次，每次提取溶劑甲醇或乙醇的體積與熊膽粉的重量之比為4-8 1，即當熊膽粉的重量(干重)為Ikg吋，甲醇或乙醇的體積為4-8L ； 當熊膽粉的重量(干重)為Ig吋，甲醇或乙醇的體積為4-8ml。其中，步驟2)中所述大孔樹脂柱分離包括如下步驟A)向熊膽醇提物中加入蒸餾水，溶解，制成熊膽水溶液；B)將熊膽水溶液上大孔樹脂柱，進行梯度洗脫，分離，其中流動相依次為蒸餾水、 質量百分比濃度為40-70%的乙醇溶液，分別收集洗脫液；C)將流動相為質量百分比濃度為70%的乙醇溶液的洗脫液蒸干，得到熊膽樹脂柱分離物。特別是，步驟A)中熊膽醇提物與蒸餾水的重量體積比為1 7-10，優選為 1 8-9。其中，步驟B)中采用D101、D-201、AB-8或HP-20型非極性大孔吸附樹脂中的ー種進行所述的大孔樹脂柱梯度洗脫，優選為HP-20型大孔樹脂。特別是，步驟B)中所述大孔樹脂與所述熊膽醇提物的重量之比為10-40 1，優選為14-15 1 ；所述大孔樹脂柱分離過程中的流動相依次為蒸餾水，質量百分比濃度為 20%、40%、70%的乙醇溶液。尤其是，還包括在以流動相為質量百分比濃度為70%的乙醇溶液進行洗脫后，在以質量百分比濃度為95%的乙醇溶液繼續洗脫。特別是，所述大孔樹脂柱的柱直徑與柱高之比為1 1-10，優選為1 2-3。特別是，步驟B)中所述各流動相的體積與熊膽醇提物的重量之比分別為 60-90 1，即當熊膽醇提物重量(干重)為Ikg吋，流動相的體積為60-90L，當熊膽醇提物重量(干重)為Ig吋，流動相的體積為60-90ml，優選為65-70 1。其中，步驟幻中所述硅膠柱層析包括如下步驟A)將經過大孔樹脂柱分離后得到的熊膽樹脂柱分離物，拌入硅膠，干燥得到硅膠層析樣品；B)將硅膠層析樣品置于硅膠柱頂部，以體積之比為99 1-1 1的氯仿-甲醇溶液為洗脫劑，進行硅膠柱梯度洗脫，收集洗脫液；C)收集體積比為1 1的氯仿-甲醇混合溶液為洗脫劑的洗脫液，蒸干，即得熊膽硅膠柱層析物。特別是，步驟A)中所述熊膽樹脂柱分離物與硅膠的重量比為1 1-5;所述拌樣硅膠為60-100目硅膠。特別是，步驟B)中所述硅膠柱中吸附劑硅膠與熊膽樹脂柱分離物的重量之比為 5-30 1，優選為15-20 1，進ー步優選為20 1 ；所述硅膠柱中的吸附劑硅膠的粒度為200-300目；硅膠柱的柱直徑與柱高之比為1 2-10，優選為1 7。其中，步驟B)中所述的洗脫劑為體積之比依次為99 1、95 5、9 1、3 1、 1 1的氯仿-甲醇混合液。特別是，每個洗脫梯度的洗脫劑體積與熊膽樹脂柱分離物的重量之比為 130-150 1，即當熊膽樹脂柱分離物重量(干重)為Ikg吋，流動相的體積為130-150L，當熊膽樹脂柱分離物重量(干重)為Ig吋，流動相的體積為130-150ml。其中，步驟幻中所述反相硅膠柱層析過程中的填料為十八烷基硅烷鍵合硅膠 (ODS)；特別是，填料十八烷基硅烷鍵合硅膠與硅膠柱層析物的重量之比為8-35 1，優選為10-20 1，進ー步優選為15 1。其中，所述反相硅膠柱層析過程中流動相為甲醇水溶液，其中，甲醇與水的體積之比為2 8-9 1，優選為3 7-8 2，進ー步優選為6.5 3.5。本發明另一方面提供一種按照上述方法制備而成的核受體Nur77的誘導劑 4'-甲氧基-7-羥基異黃酮。本發明又一方面提供ー種4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在制備誘導核受體Nur77 表達的誘導劑中的應用。其中，4'-甲氧基-7-羥基異黃酮作為誘導劑在制備預防和治療與核受體Nur77 相關的人類疾病的藥物中的應用。特別是，4'-甲氧基-7-羥基異黃酮作為誘導劑在制備預防和治療癌癥、腫瘤藥物中的應用。特別是，所述的癌癥、腫瘤選自白血病、急性粒細胞性白血病、結腸癌、乳腺癌或宮頸癌。其中，本發明藥物由4'-甲氧基-7-羥基異黃酮和藥學上可接受的輔料組成；通過ロ服、舍下、經皮、肌肉、皮下、皮膚黏膜、靜脈途徑給藥。特別是，藥物按照常規方法制成的散剤、片劑、膠囊劑、丸剤、栓劑、滴丸劑、腸溶齊U、注射劑、糖漿劑、乳剤、混懸劑、錠劑、膏劑、噴霧劑等劑型，用于制備Nur77的誘導劑及制備預防和治療與核受體Nur77相關疾病，如抗癌癥藥物、抗腫瘤藥物。ロ服給藥可制成片劑、散剤、顆粒劑、膠囊劑等常用劑型，至少需要一種賦形劑，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羥甲基纖維素等，除了這些賦形劑以外，還可以使用硬脂酸鎂、月桂醇硫酸鈉、滑石粉等作為潤滑剤；糊精、結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠等作為粘合剤；馬鈴薯淀粉、羥己基纖維素作為崩解劑。此外還可以制成糖漿劑、乳劑、混懸劑等，對于這些劑型，可以加入矯味劑、矯臭劑等。外用劑型包括栓劑、軟膏劑、外用散剤、噴霧劑、灌腸劑、乳劑等，對于軟膏劑，選用水、脂肪、脂肪油、羊毛脂、凡士林、甘油、蜂蠟、石蠟、液體石蠟、樹脂等組成的疏水性基質或親水性基質等在內的添加剤。制成注射劑時，一般是用注射用蒸餾水、生理鹽水、葡萄糖水溶液、直射用植物油、 丙ニ醇、聚乙ニ醇等，必要時還可以加入適宜的等張劑、助溶劑、抗氧化劑、防腐劑等。本發明的優點表現如下1、本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮能夠顯著上調Nur77mRNA的表達，其對Nur77mRNA轉錄水平的影響與佛波酯(TPA)的相似，可作為作為核受體Nur77表達的誘導劑。2、本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在低濃度(ΙΟμπιοΙ/L)下即可強烈誘導 Nur77蛋白的表達，使Nur77蛋白的表達顯著提高，說明4'-甲氧基-7-羥基異黃酮可以有效誘導Nur77蛋白的表達，具有成為核受體調節作用的新型抗腫瘤藥物的潛力。3、本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對Nur77蛋白表達量隨藥物濃度的増大而増大，并且4‘-甲氧基-7-羥基異黃酮在有效濃度范圍內對Nur77蛋白的表達表現出很好的量效關系。4、本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮抗癌的效果顯著，對HCT-8結腸癌細胞、 MCF-7乳腺癌細胞和Hela宮頸癌細胞具有很好的選擇性細胞毒性作用，對HCT-8結腸癌細胞的半抑制濃度(IC5tl)為12. 5 μ M ；對MCF-7乳腺癌細胞的半抑制濃度(IC5tl)為8. 3 μ M ； 對Hela宮頸癌細胞的半抑制濃度(IC5tl)為1. 59 μ Μ。5、本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對腫瘤的抑制效果顯著，促使腫瘤細胞的凋亡，腫瘤抑制率達到51 %以上。因此，由于核受體Nur77的表達與多種人類疾病相關，因此，本發明的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮可以作為誘導劑應用于制備治療和預防與核受體Nur77相關的人類疾病的藥物。


圖1是4 ‘-甲氧基-7-羥基異黃酮對核受體Nur77的mRNA表達的凝膠電泳圖；圖2是4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對核受體Nur77蛋白質表達的凝膠電泳圖；圖3是不同濃度的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對核受體Nur77蛋白質表達的凝膠電泳圖。附圖標記說明1.空白對照；2.陽性對照(TPA)；3.4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶液(濃度4.4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶液(濃度5.4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶液(濃度
具體實施例方式本發明的主要藥效學試驗方法及結果如下試驗例1 -甲氧基-7-羥基異黃酮對核受體Nur77的調節作用1. 1材料與儀器實驗細胞人HCT-8結腸癌細胞實驗儀器細胞培養箱美國Thermo公司離心管比利時Orange Scientific公司一次性培養皿及6孔培養板比利時Orange kientific公司1μ mol/L)； :10ymol/L)； 100μ mol/L)ο
濕式轉移槽 Millipore超純水儀 PCR儀
凝膠成像系統主要試劑
単體化合物4'-甲氧基-7-羥基異黃酮(實施例1制備得到)； HCT-8人結腸癌細胞； 佛波酯(TPA)(美國!Iomega公司)
DMEM培養基、trizol裂解劑、隨機六聚體引物(Random hexamer primer) ,5X反拽緩沖液(Reaction buffer)、逆轉錄 _ (RevertAid M-Mulv Reverse Transcriptase)、 RNA 酶抑制劑(Ribolock Ribonuclease inhibitor)、dNTP 混合物，蛋白標記(Marker), 6 X Loading buffer (均購 _ Invitrogen 公 ロコ)；胰酶消化液，青霉素，鏈霉素，溴化乙啶(EB)，瓊脂糖，苯甲基磺酰氟(PMSF)， 0. 05%胰蛋白酶；β -actin 3'端及5'端引物、Nur773'端及5'端引物(廈門閩博生物技術有限公司)胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司提供，使用前于56°C滅火30min)；DEPC水(用于RNA提取時各種塑料用品的浸泡及RNA溶解)；PCR 試劑盒(Fermentas 公司)；Quick Start Bradford Dye Reagent, IX 試劑盒(BIO-RAD 公司)ECL化學發光檢測試劑盒(購自Thermo公司)rTaq 酶(TaKaRa 公司)；緩沖液及其他溶液1)緩沖液a. PBS :137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl, lOmmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4 用鹽酸調節pH至7. 4。b. 50XTAE :2mol/L Tris ；1. Omol/L NaAc ；0. 5mol/L EDTA(pH 8. 0)。c. 6XDNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液0. 25%溴酚蘭；30%甘油水溶液。幻RIPA細胞裂解液50mmol/L Tris_cl(pH7. 4) ； 150mmol/L NaCl ；lmmol/L EDTA ；1% Triton ；
1 % NaDoC ；0. 1 % SDS ； lmmol/L PMSF ；5 μ g/ml Aprotenin ；5 μ g/ml Leupeptasin03)蛋白質電泳相關試劑a.分離膠用 Tris 緩沖液1. 5mol/L，ρΗ8· 8 ；b.積層膠用 Tris 緩沖液:lmol/L, pH 6. 8 ；c. 2XSDS 凝膠加樣緩沖液100mmol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，200mmol/L ニ硫蘇糖醇(DTT)，4% SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油，10% β-巰基乙醇；d.電泳緩沖液=Tris-Hcl 3. 03g ；甘氨酸18. 77g ；SDS Ig溶于IOOOmL蒸餾水中；e.電轉液Tris 3. 03g，甘氨酸14. 4g，溶于900mL蒸餾水中，再加入IOOmL甲醇；f. IXTBST :10mmol/L Tris-HCl (pH 7. 5), 150mmol/L NaCl,0. 1% Tween-20 ；g.封閉液5% (ff/V)脫脂奶粉溶于1 X TBST中。1.2實驗方法及結果1. 2. 14'-甲氧基-7-羥基異黃酮對Nur77dmRNA表達的影響采用RT-PCR進行分析。RT-PCR是將RNA的反轉錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結合的技木。 首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。(一)配制4'-甲氧基-7-羥基異黃酮及陽性對照佛波酯(TPA)溶液將上述制備的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶解于ニ甲基亞砜(DMS0)，制成濃度為lmmol/L UOmmol/L及IOOmmol/L的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶液；將陽性對照佛波酯(TPA)溶于DMS0，制得濃度為100 μ g/mL的佛波酯溶液。(ニ)HCT-8人結腸癌細胞培養將液氮凍存HCT-8人結腸癌細胞于37°C迅速解凍復蘇，孵育于含10%胎牛血清， 100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素的DMEM培養基中，在37°C、5% CO2培養箱中培養。傳代時吸去培養液，PBS洗2次，加適量胰酶消化液，在培養箱中靜置2-5min，顯微鏡下觀察細胞變圓后，用添加胎牛血清的DMEM培養基終止胰酶的消化，將消化液用移液槍加入1. 5mL離心管中，SOOrpm離心％iin，吸去上清液后，加入DMEM培養液，用移液槍吹成單細胞懸液，即 HCT-8人結腸癌單細胞懸液。(三)4'-甲氧基-7-羥基異黃酮誘導HCT-8細胞Nur77mRNA的表達1、細胞培養將HCT-8人結腸癌單細胞懸液分傳至6孔板，至細胞生長到大約占孔板底面積的 80%吋，吸去培養液，換上2ml新鮮的DMEM培養基(胎牛血清的含量為10% )，分別加入 2 μ L濃度為lmmol/L和lOmmol/L的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮溶液，37°C，5% CO2培養箱中培養他；同時，以加入2 μ Lニ甲基亞砜(DMSO)溶液作為空白對照，以加入2μ L 100 μ g/ mL的TPA溶液作為陽性對照。2、總RNA的提取1)將培養的各HCT-8細胞培養液吸去上清液后，加入600 μ 1 Trizol裂解劑，反復吹打至細胞脫落，得到細胞裂解物，將細胞裂解物轉移到1.5mL EP管中。2)室溫(25°C)下放置5min后，加入150 μ 1氯仿，蓋緊EP管，用カ搖晃15s，再于室溫下放置:3min后在4°C，12000g離心15min，吸取上層水相至另ー EP管中。3)向上述上層水相中加入0. 5mL異丙醇，于室溫下放置IOmin后，于4°C，12000g 離心lOmin，倒掉離心上清液，RNA沉于離心管底。4)向底部沉淀RNA的EP離心管中加入ImL 75%的乙醇，用移液槍輕輕吹打RNA 沉淀，使RNA沉淀懸浮于乙醇中，然后在4°C，SOOOg離心5min，倒掉上清液，將沉淀于室溫下晾干lOmin，得到RNA樣品。5)向RNA樣品中加入30μ L DEPC水，在55°C下恒溫水浴lOmin，使沉淀溶解，測定 RNA溶液的OD值，計算RNA溶液的濃度，即得到4'-甲氧基-7-羥基異黃酮、空白對照及陽性對照誘導HCT-8細胞后細胞的RNA溶液。3、RNA 反轉錄1)向各個PCR管內加入2μ 1上述濃度為750ng/y 1的RNA溶液，再向各個PCR管中加入1μ 1隨機六聚體引物(Random hexamer primer)及DEPC水，使各個PCR管中溶液總體積為12μ 1，將各PCR管低速離心幾秒，使混合液混勻；2)將上述各PCR管放入70°C水浴中，5min后取出，立即放于冰上，低速離心混勻；3)于冰上，向各個PCR管中依次加入5X反應緩沖液4μ 1，RNA酶抑制劑 (Ribolock Ribonuclease inhibitor, 20u/μ 1) 1 μ 1 及 dNTP 混合物(IOmM) 2 μ 1，低速離心幾秒后，室溫放置5min ；4)向上述各個PCR管中加入逆轉錄酶(RevertAid M-Mulv Reverse Transcriptase) 1 μ 1，使各PCR反應的反應總體積均為20 μ 1 ；5)將上述各反應體系于室溫(25°C )下放置lOmin，再于42°C水浴60min ；6)將上述反應各體系于70°C下水浴IOmin終止反應，然后立即放在冰上冷卻，即得到4'-甲氧基-7-羥基異黃酮ひ讓は/し川讓は/！入空白對照及陽性對照誘導!!^^ 細胞后細胞的DNA溶液；各DNA溶液均于_20°C進行保存。4、引物設計1)從基因庫中查找人類基因Nur77的序列，其在基因庫中人類基因Nur77的登錄號為 NM_00213。2)通過PCR引物設計軟件Primer Premier 5. O尋找基因Nur77的保守序列。3)運用PCR引物設計軟件Primer Primer 5. O設計如下四個引物5 ‘ Nur77 (目的片段)TCATGGACGGCTACACAG-----------18bp3 ‘ Nur77 (目的片段)GTAGGCATGGAATAGCTC-----------18bp5' β-actin(內參)CTAAAACTAC-------------------IObp3' β-actin(內參)TATATTAATA-------------------IObp5、PCR 反應1)將所有下述參與PCR反應的溶液解凍后，混勻；2)將PCR反應溶液按照下述體積依次加入PCR管中，所有操作均在冰上進行DEPC 水10. 3μ1IOXbuffer2. 5 μ 1
10
dNTP混合物2.,0μ 1
3' Nur770.,5μ 1
5' Nur770.,5μ 1
β -actin30.5 μ 1
β -actin50.5 μ 1
rTaq 酶0.,2μ 1最后，再向各？0 管中分別加入上述濃度分別為1レ11101/し1(^11101/1的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮、空白對照及陽性對照誘導HCT-8細胞后細胞的DNA溶液3 μ 1，使各 PCR管中總體積20 μ 1。3)將上述PCR管低速離心幾秒后放入PCR儀中，設定PCR儀程序如下95°C，5min變性94 °C，30s退火55°C，30s延伸72°C，30s72°C, IOmin循環次數30即得到各PCR產物。6、凝膠電泳檢測將上述各PCR產物用瓊脂糖膠進行電泳分析，結果如圖1。由圖1可見， 在ΙΟμπιοΙ/L濃度下，4'-甲氧基-7-羥基異黃酮可顯著上調Nur77mRNA的表達，其對 Nur77mRNA轉錄水平的影響與陽性對照TPA (lOOng/mL)的相似，提示4'-甲氧基-7-羥基異黃酮為核受體Nur77的誘導劑。1. 2. 24'-甲氧基-7-羥基異黃酮對Nur77蛋白質表達的影響采用蛋白質印跡(Western Blotting)方法進行蛋白質分析。Western Blotting，又稱蛋白質印跡，與Southern印跡雜交或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，“探針”是抗體， “顯色”用標記的ニ杭。經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體(例如硝酸纖維素膜 NC膜)上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。(一)HCT-8人結腸癌細胞培養將HCT-8人結腸癌細胞孵育于含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素的DMEM培養基中，在37°C、5% CO2培養箱中培養。傳代時吸去培養液，PBS洗2次，加適量胰酶消化液，在培養箱中靜置2-5min，顯微鏡下觀察細胞變圓，用添加胎牛血清的DMEM培養基終止胰酶的消化，將消化液用移液槍加入1. 5mL離心管中，SOOrpm離心％iin，吸去上清液后，加入含10%胎牛血清DMEM培養液，用移液槍吹成單細胞懸液。(ニ)4'-甲氧基-7-羥基異黃酮誘導HCT-8細胞Nur77蛋白的表達1、細胞培養
將上述培養的HCT-8單細胞懸液分傳至6孔板，至細胞生長到大約占孔板底面積的80%吋，吸去培養液，換上2ml新鮮的含有0. 5%胎牛血清的DMEM培養基，分別加入2 μ L 濃度為lOmmol/L的4'-甲氧基-7-羥基異黃酮，37 °C，5% C02培養箱中培養他；同吋，以加入2 μ LDMSO作為空白對照。2、細胞收集將上述培養的細胞用4°C的緩沖液PBS洗三次，加入ImL含lmmol/L苯甲基磺酰氟 (PMSF)的PBS，將細胞收集到1. 5mL離心管中，于4°C，2000rpm離心lOmin，倒掉上清液。3、細胞裂解向每個離心管中加入40 μ L RIPA細胞裂解液裂解30min，其間，在振蕩器上每隔 5min振蕩10s，然后在4°C，12000rpm離心lOmin，收集上清液，即蛋白樣品。4、蛋白濃度的測定按照BIO-RAD 公司的 Quick Start Bradford Dye Reagent，1 X 試劑盒的說明測定上述各蛋白樣品的濃度。5、蛋白凝膠電泳按照各蛋白樣品的濃度換算后，分別取50μ g蛋白樣品，加入等體積的2XSDS上樣緩沖液(含10% β-巰基乙醇)，100°C煮lOmin，離心后于TriS-甘氨酸緩沖液中進行電泳(80V，過分離膠后100V)，其中，每板電泳加入5μ L蛋白標記(Marker)。6、電轉移用與蛋白電流凝膠同樣大小的PVDF膜(提前用無水甲醇浸泡lmin)和濾紙預先浸于電轉液中，PVDF膜貼于膠后，趕盡氣泡，兩面覆蓋濾紙，趕盡氣泡，按膜朝正極的順序裝于電轉槽中，加入電轉液和冰袋，于4°C冰箱中進行電轉移(100V，60min)。7、抗原抗體反應1)封閉將電轉移后的PVDF膜于含5%的脫脂牛奶的TBST緩沖液中室溫封閉 lh；2) 一抗反應將封閉后的PVDF膜封于雜交袋中，按0. lmL/cm2加入ー抗 anti-Nur77 (Santa Cruz 公司，濃度 1 1000)于 4°C 搖床上過夜；3) c. ニ抗反應將PVDF膜于TBST緩沖液中搖洗3次，每次5min，之后在相應的ニ 抗(山羊抗兔ニ抗，濃度1 10000，Santa Cruz公司)中室溫孵育lh。8、ECL化學發光檢測倒掉ニ杭，用TBST緩沖液洗膜，室溫搖洗三次，毎次5min，蛋白面朝上，置于保鮮膜中，將ECL化學發光檢測試劑盒的A液和B液以1 1(V/V)混和，于暗室中，按 0. 05-0. lmL/cm2的量滴加于膜表面，孵育lmin，用濾紙吸去多余液體，封好膜后，立即于暗室中曝光，顯影，結果如圖2、3。由圖2可知，4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在lOymol/L濃度下即可強烈誘導Nur77 蛋白的表達。在ΙΟμπιοΙ/L濃度下，即可使Nur77蛋白的表達顯著提高，說明4'-甲氧基-7-羥基異黃酮可以有效誘導Nur77蛋白的表達，具有成為核受體調節作用的新型抗腫瘤藥物的潛力。由圖3可知4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在ΙΟμπιοΙ/L和ΙΟΟμπιοΙ/L的濃度條件下可明顯誘導Nur77蛋白的表達，且Nur77蛋白表達量隨藥物濃度的増大而增大；而4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在1 μ mol/L的濃度條件下誘導Nur77蛋白的表達并不明顯， 這些結果顯示4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在有效濃度范圍內對Nur77蛋白的表達表現出很好的量效關系。試驗例-甲氧基-7-羥基異黃酮的體外抑瘤實驗采用MTT法測試4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對腫瘤細胞的抑制作用。選融合度在80 %，對數期生長的細胞，用胰酶消化，轉移，離心，去上清液，用新配制的含10% FBS(滅活的胎牛胎血清)的DMEM培養液混懸。各種細胞儀1. OX IO4萬/孔接種于96孔培養板，均同時依次加入5個不同稀釋度的待篩樣品藥液，每個稀釋度重復3 個孔，同時平行做相同濃度的溶劑對照和不加藥的陰性對照，37°C培養72小吋，MTT染色， DMSO脫色，測定OD57tl,計算腫瘤生長抑制率頂(％ )，其中頂=(空白OD平均值-給藥組OD平均值)/空白OD平均值X 100%試驗結果如表1所示，4'-甲氧基-7-羥基異黃酮對人體的10種腫瘤細胞非小肺癌細胞H-460，A549與Calu_6 ；前列腺癌細胞LNCaP ；乳腺癌細胞MCF-7 ；結腸癌細胞 SW-480、HCT-8、HCT-116 ；宮頸癌細胞Hela ；肝癌細胞H印G2的増殖具有不同程度的抑制作用。表14'-甲氧基-7-羥基異黃酮的體外抑瘤實驗數據
權利要求
1.一種核受體Nur77的調節劑4'-甲氧基-7-羥基異黃酮的制備方法，包括依次進行步驟1)對熊膽粉進行提取處理，制得熊膽醇提物，其中提取溶劑為甲醇或乙醇；2)對熊膽醇提物依次進行大孔樹脂柱分離、硅膠柱層析、反相硅膠柱層折，即得。
2.如權利要求1所述的制備方法，其特征是步驟2)中采用D101、D-201、AB-8或HP-20 型非極性大孔吸附樹脂中的一種進行所述的大孔樹脂柱分離。
3.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征是步驟幻的所述硅膠柱層析過程中硅膠與熊膽醇提物經過大孔樹脂柱分離后制得的熊膽樹脂柱分離物的重量之比5-30 1。
4.如權利要求1或2所述的制備方法，其特征是步驟2)的所述反相硅膠柱層析過程中填料十八烷基硅烷鍵合硅膠與經硅膠柱層析制得的熊膽硅膠柱層析物的重量之比 8-35 1。
5.ー種4'-甲氧基-7-羥基異黃酮在制備誘導核受體Nur77表達的誘導劑中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征是在制備預防和治療與核受體Nur77相關的人類疾病的藥物中的應用。
7.如權利要求5所述的應用，其特征是在制備預防和治療癌癥、腫瘤藥物中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特征是所述的癌癥、腫瘤選自白血病、急性粒細胞性白血病、結腸癌、乳腺癌或宮頸癌。
9.如權利要求7所述的應用，其特征是藥物由4'-甲氧基-7-羥基異黃酮和藥學上可接受的輔料組成。
10.如權利要求7所述的應用，其特征是藥物是通過ロ服、舍下、經皮、肌肉、皮下、皮膚黏膜、靜脈途徑給藥。
全文摘要
本發明涉及誘導核受體Nur77表達的異黃酮類化合物4′-甲氧基-7-羥基異黃酮的制備方法及其應用。本發明所述的4′-甲氧基-7-羥基異黃酮化合物，能夠誘導核受體Nur77表達，從而可以作為誘導劑應用于制備預防和治療癌癥、腫瘤等藥物。
文檔編號A61K31/352GK102584767SQ20111000310
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月7日 優先權日2011年1月7日
發明者何加友, 吳華, 吳德培, 張曉坤, 曾錦章, 羅強, 陳麗玲, 陳志鴻, 陳海峰 申請人:福建歸真堂藥業股份有限公司