專利名稱：聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及一種聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖 制劑及其制備方法。
背景技術：
人體的許多生理功能和生理、生化指標，如血壓、胃酸分泌、某些激素的分泌等，呈 生物節律變化，許多疾病的發作、癥狀的加重與緩解等也都有其自身的規律性，如支氣管哮 喘、心肌梗塞、心絞痛、風濕性疾病、胃潰瘍、糖尿病、注意力缺陷綜合癥、血膽固醇過多、高 血壓等。傳統的緩、控釋制劑在較長時間內維持了血藥濃度，延長了藥物的療效，比起普通 制劑對臨床治療有更積極的作用。但是緩、控釋制劑也逐漸暴露出它的弊端，在治療期間， 受體長期與藥物相互作用而脫敏，耐藥性增加，治療作用降低，并且藥物毒副作用大，首過 效應導致生物利用率低。脈沖釋藥系統很好的解決了這些問題，它根據人體生物節律的變 化特點，按照生理和治療的需要定時、定量的釋放藥物。它與按零級釋藥的控釋制劑不同， 其目的不是維持穩定的血藥濃度，而是按照時辰藥理學的原理適時地釋放藥物，給藥后有 一個沒有藥物釋放的“時滯”期，按預定時間和治療劑量單次或多次釋放藥物。現階段的脈 沖釋放按照觸發釋放的機制主要分為兩種形式外界因素觸發式和程序設定式兩種釋藥系 統。其中，前者又可以分為兩類，一類是利用生物化學機制觸發，例如血糖水平控制胰島素 的釋放；炎癥部位高濃度的羥基和透明質酸酶使得抗炎藥物釋放等等。另一類是利用物理 化學機制觸發，包括磁場、電場、輻照、超聲、溫度變化等等。后者是不需要外界因素觸發的 脈沖傳遞系統，藥物的釋放只取決于制劑內部結構和材料的性能，根據目標釋放模式有目 的的選擇材料，合理設計給藥載體結構，使藥物釋放按照預設的步驟，自動的、有序的進行。 從病人的依從性角度考慮，程序設定式的釋藥方式具有明顯的優勢。程序設定式釋藥體系按照其設計機理又可分為以下幾種類型體系降解形成的脈 沖釋藥(水凝膠自發降解型；酶降解型)；膨脹壓形成的脈沖釋藥(滲透泵脈沖釋藥系統、 包衣脈沖系統和定時脈沖塞膠囊等)；體系降解和膨脹壓共同形成的脈沖釋藥。具體分析 各類型脈沖釋藥體系的優勢和不足(1)體系降解形成的脈沖釋藥體系其原理是利用高分子材料的體積溶蝕或表面 溶蝕，通過改變高分子材料的組成和性質可以調節脈沖釋藥的“時滯”長短。其缺點在于時 滯后釋放時間過長，傳統水凝膠溶脹速度較慢，吸收水的時間需要幾小時甚至幾天。雖然慢 的溶脹對于許多應用是有利的，但在脈沖釋藥體系中需要高分子網絡在設定程序的時滯后 能很快地溶脹。(2)膨脹壓形成的脈沖釋藥體系包衣型和溶蝕塞型脈沖制劑的體內時滯主要受 到與消化液接觸時間的影響。(3)體系降解和膨脹壓共同形成的脈沖釋藥體系結合了體系降解形成的脈沖釋 藥和膨脹壓形成的脈沖釋藥兩種脈沖體系的優勢，既能夠通過高分子自發降解可控性好的 特點來改善脈沖“時滯”的精確控制，又能夠通過膨脹壓體系脈沖釋放發生后釋放響應快的特點來解決脈沖釋放時間的問題。體系降解和膨脹壓共同形成的脈沖釋藥體系的典型釋放模式，是由可降解的殼聚 糖衍生物微凝膠作為“核”，脂質或高分子作為“包衣”，水可以自由通過該包衣層，而微凝膠 的降解產物(降解的高分子片斷)不能通過，隨著微凝膠中高分子的不斷降解，體系內部膨 脹壓不斷增加，到達臨界狀態，“包衣”層被脹破，形成脈沖釋藥，國外近年來已出現“體系降 解和膨脹壓共同形成的脈沖釋藥體系”的研究，但主要是以脂質包衣為主。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制 劑及其制備方法，該脈沖制劑以聚電解質為包衣層，是一種體系降解和膨脹壓共同作用的 脈沖制劑，不需要外界觸發釋放，在給藥后，經過一個藥物不釋放的時滯期后，藥物大量釋 放。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現本發明聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑是由自膨脹微凝膠核和聚電 解質包衣層組成，其中，自膨脹微凝膠核主要由殼聚糖和海藻酸鈉組成，聚電解質包衣層是 由4-苯乙烯磺酸鈉層和聚烯丙基胺鹽酸鹽層交替組成。聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠的粒徑大小也會影響藥物的釋放時滯，如果粒 徑過大，粒子表面張力過小，釋放時滯太短；粒徑過小，粒子表面張力過大，在殼聚糖海藻酸 鈉結構降解坍塌之前，聚電解質包衣層不能脹破，無法形成脈沖釋放，所以本發明的聚電解 質包衣微凝膠的粒徑應在100nm-600 μ m范圍內。上述脈沖制劑的自膨脹微凝膠核是由殼聚糖0. 1 0. 5g、海藻酸鈉60 lOOmg、 氯化鈣1 4g、藥物200 800 μ g溶于l(Mml去離子水中制備而成。優選的，前述自膨脹微凝膠核是由殼聚糖0. 2g、海藻酸鈉80mg、氯化鈣2g、藥物 400 μ g溶于l(Mml去離子水中制備而成。前述脈沖制劑中的包衣4-苯乙烯磺酸鈉層是將自膨脹微凝膠核或微凝膠制劑 (指包裹了一層或多層聚電解質包衣層的微凝膠核)置于含4-苯乙烯磺酸鈉0. 2 aiig/ ml、氯化鈉7. 313 117mg/ml的去離子水溶液中吸附而成。優選的，4-苯乙烯磺酸鈉層是將自膨脹微凝膠核或微凝膠制劑置于含4-苯乙烯 磺酸鈉lmg/ml、氯化鈉29. 25mg/ml的去離子水溶液中吸附。前述脈沖制劑中的包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層是將自膨脹微凝膠制劑置于含聚烯 丙基胺鹽酸鹽0. 2 2mg/ml、氯化鈉7. 313 117mg/ml的去離子水溶液中吸附而成。優選的，聚烯丙基胺鹽酸鹽層是將自膨脹微凝膠制劑置于含聚烯丙基胺鹽酸鹽 lmg/ml、氯化鈉29. 25mg/ml的去離子水溶液中吸附。前述脈沖制劑所用到的殼聚糖的相對分子量為20 700kd。優選的，殼聚糖的相對分子量為lOOkd。前述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑的制備方法，包括如下步驟(1)配制殼聚糖-氯化鈣溶液取殼聚糖分散于去離子水中，完全溶解后加入氯化 鈣，調節PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液將海藻酸鈉加入去離子水中，水浴加熱溶解，將藥物用去離子水溶解，按比例將海藻酸鈉溶液和藥物溶液混合，使之均勻互溶，備用；(3)微凝膠核心的制備將含藥物的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入殼聚 糖-氯化鈣溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不溶于水的微凝膠，固化完全后，取出靜電 場，繼續磁力攪拌，使微凝膠充分固化，濾出微凝膠，去離子水洗滌，4°C保存備用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層取4-苯乙烯磺酸鈉和氯化鈉溶于去離子水中，放入 微凝膠，在60 100W功率超聲條件下使4-苯乙烯磺酸鈉通過靜電力作用均勻吸附在微凝 膠表面，濾出微凝膠，去離子水洗滌，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽和氯化鈉溶于去離子水中， 放入微凝膠，在60 100W功率超聲條件下使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力作用均勻吸附 在微凝膠表面，濾出微凝膠，去離子水洗滌，即可；(6)重復步驟(4)和( ，即得聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑。上述技術方案中，微凝膠核心可降解，自身具有膨脹性，可產生足夠的膨脹壓；聚 電解質包衣層是有一定滲透性的半透膜，水等小分子可以通過，高分子的降解產物及藥物 不能通過，同時它有一定的機械性能，但當內部膨脹壓足夠大時，可以脹破。與現有技術相比，本發明提供的脈沖制劑以聚電解質為包衣層，是一種體系降解和 膨脹壓共同作用的脈沖制劑，不需要外界觸發，釋放完全依賴制劑自身結構和高分子材料的 性質，而且時滯可控性強，在給藥后，經過一個藥物不釋放的時滯期后，藥物大量釋放，時滯后 期的釋放速度也可以根據制劑物料配比進行調控，可以滿足各種治療的需要。經實驗驗證，本 發明脈沖制劑的組織刺激性小，安全性良好，該制劑所用材料價廉易得，核心粒徑精確可控， 而且殼聚糖海藻酸鈉微凝膠帶有一定的PH敏感性，使制劑的釋放行為更加靈活可控。
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的粒徑分布圖和粒子表面電位 圖；圖2是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的掃描電鏡圖；圖3是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的激光共聚焦顯微鏡圖；圖4是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的體外釋放過程激光共聚焦顯 微鏡圖；圖5是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的體內釋放過程激光共聚焦顯 微鏡圖；圖6是本發明的自膨脹微凝膠核心的膨脹度變化圖；圖7是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的體外釋放曲線圖；圖8是本發明的聚電解質逐層組裝自膨脹微凝膠的組織刺激性實驗結果圖；圖9是本發明的聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠的粒徑分布圖；圖10是本發明的聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠的透射電鏡圖。
具體實施例方式儀器和材料
FITC_dextran(2000kD)，美國 sigma 公司；聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH) (56kD)，美國sigma公司；聚4-苯乙烯磺酸鈉(PSS) (70kD)，美國sigma公司；海藻酸鈉(ALG)(化學純)，國藥集團化學試劑有限公司；殼聚糖(CHI)(食品級)，浙江金殼生物有限公司；氯化鈉(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈣(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；高壓靜電場微膠囊成型裝置，上海理工大學；Masersizer 2OOO (英國馬爾文公司)Zetasizer nano ZS(英國馬爾文公司) 實施例1制備聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑(1)制備殼聚糖-氯化鈣溶液取相對分子量為IOOkd的殼聚糖粉末0. 2g，分散于 IOOml去離子水中，滴加濃鹽酸至殼聚糖完全溶解，加入氯化鈣粉末2g，用稀鹽酸調節溶液 PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液取海藻酸鈉粉末80mg，加入3ml去離子水中，在 50°C水浴中加熱，使其溶解，得到海藻酸鈉溶液，取400 μ g藥物，溶于Iml去離子水中得到 藥物溶液，將兩種溶液混合后，劇烈渦旋，使之均勻互溶，得到含藥物的海藻酸鈉溶液；(3)微凝膠核心的制備(參考文獻高壓靜電場制備微膠囊的研究，李保國，華澤 釗，劉占杰.[J].上海理工大學學報，2000，22 (3) :189-193.中的方法)將含藥物的海藻酸 鈉溶液吸入注射器中，調節高壓靜電場微膠囊成型裝置電壓為35KV，自動注射器的速度為 30mm/h。自動注射器以該速度將含藥物的海藻酸鈉溶液在電場力的作用下克服粘滯力和 表面張力，呈一定粒徑的液滴滴入殼聚糖氯化鈣混合溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸鈣殼聚糖微凝膠。待海藻酸鈉全部成凝膠后，關閉高壓電場，繼續磁力攪拌 15min，使微凝膠固化充分。用篩網濾出微凝膠后，用去離子水洗滌，4°C保存備用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層(參考文獻Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B.G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control IedRelease, 2006,116(2) : 159-169.)取 4-苯乙烯磺酸鈉 IOmg 和氯 化鈉四2. 5mg溶于IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使4-苯乙烯磺酸鈉 通過靜電力的作用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多 余的4-苯乙烯磺酸鈉聚電解質，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽IOmg和氯化鈉四2. 5mg溶于 IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力的作 用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多余的聚烯丙基胺 鹽酸鹽聚電解質，即可；(6)重復步驟⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚電解質層數，即得。經過模型藥物的體外釋放實驗表明，本發明制劑的模型藥物釋放時滯在2 5小 時，時滯后迅速釋放量可達80 %左右，使用高壓靜電場成囊裝置控制粒徑，使粒徑均勻，表 面張力大小相差不大，粒子釋放時滯基本一致。
同樣，以下實施例2和3所得到的聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑具 有組織刺激性小，安全性良好的優點。實施例2本實施例制備聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑如下(1)制備殼聚糖-氯化鈣溶液取相對分子量為700kd的殼聚糖粉末0. Ig,分散于 IOOml去離子水中，滴加濃鹽酸至殼聚糖完全溶解，加入氯化鈣粉末lg，用稀鹽酸調節溶液 PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液取海藻酸鈉粉末60mg，加入3ml去離子水中，在 50°C水浴中加熱，使其溶解，得到海藻酸鈉溶液，取800 μ g藥物，溶于Iml去離子水中得到 藥物溶液，將兩種溶液混合后，劇烈渦旋，使之均勻互溶，得到含藥物的海藻酸鈉溶液；(3)微凝膠核心的制備(參考文獻高壓靜電場制備微膠囊的研究，李保國，華澤 釗，劉占杰.[J].上海理工大學學報，2000，22 (3) :189-193.中的方法)將含藥物的海藻酸 鈉溶液吸入注射器中，調節高壓靜電場微膠囊成型裝置電壓為35KV，自動注射器的速度為 30mm/h。自動注射器以該速度將含藥物的海藻酸鈉溶液在電場力的作用下克服粘滯力和 表面張力，呈一定粒徑的液滴滴入殼聚糖氯化鈣混合溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸鈣殼聚糖微凝膠。待海藻酸鈉全部成凝膠后，關閉高壓電場，繼續磁力攪拌 15min，使微凝膠固化充分。用篩網濾出微凝膠后，用去離子水洗滌，4°C保存備用；使用高壓 靜電場成囊裝置控制粒徑，使粒徑均勻，表面張力大小相差不大，粒子釋放時滯基本一致。(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層(參考文獻Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control IedRelease, 2006,116(2) : 159-169.)取 4_ 苯乙烯磺酸鈉 20mg 和氯 化鈉1170mg溶于10ml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使4-苯乙烯磺酸鈉 通過靜電力的作用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多 余的4-苯乙烯磺酸鈉聚電解質，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽2mg和氯化鈉73. 13mg溶于 IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力的作 用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多余的聚烯丙基胺 鹽酸鹽聚電解質，即可；(6)重復步驟⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚電解質層數，即得本實 施例所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑。實施例3本實施例制備聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑如下(1)制備殼聚糖-氯化鈣溶液取相對分子量為20kd的殼聚糖粉末0. 5g，分散于 IOOrnl去離子水中，滴加濃鹽酸至殼聚糖完全溶解，加入氯化鈣粉末4g，用稀鹽酸調節溶液 PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液取海藻酸鈉粉末100mg，加入3ml去離子水中，在 50°C水浴中加熱，使其溶解，得到海藻酸鈉溶液，取200 μ g藥物，溶于Iml去離子水中得到 藥物溶液，將兩種溶液混合后，劇烈渦旋，使之均勻互溶，得到含藥物的海藻酸鈉溶液；
(3)微凝膠核心的制備(參考文獻高壓靜電場制備微膠囊的研究，李保國，華澤 釗，劉占杰.[J].上海理工大學學報，2000，22 (3) :189-193.中的方法)將含藥物的海藻酸 鈉溶液吸入注射器中，調節高壓靜電場微膠囊成型裝置電壓為35KV，自動注射器的速度為 30mm/h。自動注射器以該速度將含藥物的海藻酸鈉溶液在電場力的作用下克服粘滯力和 表面張力，呈一定粒徑的液滴滴入殼聚糖氯化鈣混合溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸鈣殼聚糖微凝膠。待海藻酸鈉全部成凝膠后，關閉高壓電場，繼續磁力攪拌 15min，使微凝膠固化充分。用篩網濾出微凝膠后，用去離子水洗滌，4°C保存備用；使用高壓 靜電場成囊裝置控制粒徑，使粒徑均勻，表面張力大小相差不大，粒子釋放時滯基本一致。(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層(參考文獻Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control ledRelease，2006，116 O) :159-169.)取 4-苯乙烯磺酸鈉 2mg 和氯 化鈉73. 13mg溶于IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使4-苯乙烯磺酸鈉 通過靜電力的作用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多 余的4-苯乙烯磺酸鈉聚電解質，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽20mg和氯化鈉1170mg溶于 IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力的作 用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多余的聚烯丙基胺 鹽酸鹽聚電解質，即可；(6)重復步驟⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚電解質層數，即得本實 施例所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑。實施例4本實施例制備聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑如下(1)制備殼聚糖-氯化鈣溶液取相對分子量為20kd的殼聚糖粉末0. Ig,分散于 IOOrnl去離子水中，滴加濃鹽酸至殼聚糖完全溶解，加入氯化鈣粉末lg，用稀鹽酸調節溶液 PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液取海藻酸鈉粉末60mg，加入3ml去離子水中，在 50°C水浴中加熱，使其溶解，得到海藻酸鈉溶液，取800 μ g藥物，溶于Iml去離子水中得到 藥物溶液，將兩種溶液混合后，劇烈渦旋，使之均勻互溶，得到含藥物的海藻酸鈉溶液；(3)微凝膠核心的制備(參考文獻高壓靜電場制備微膠囊的研究，李保國，華澤 釗，劉占杰.[J].上海理工大學學報，2000，22 (3) :189-193.中的方法)將含藥物的海藻酸 鈉溶液吸入注射器中，調節高壓靜電場微膠囊成型裝置電壓為95KV，自動注射器的速度為 30mm/h。自動注射器以該速度將含藥物的海藻酸鈉溶液在電場力的作用下克服粘滯力和 表面張力，呈一定粒徑的液滴滴入殼聚糖氯化鈣混合溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸鈣殼聚糖微凝膠。待海藻酸鈉全部成凝膠后，關閉高壓電場，繼續磁力攪拌 15min，使微凝膠固化充分。用篩網濾出微凝膠后，用去離子水洗滌，4°C保存備用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層(參考文獻Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a,Journal of Control ledRelease，2006，116 O) :159-169.)取 4-苯乙烯磺酸鈉 2mg 和氯 化鈉73. 13mg溶于IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使4-苯乙烯磺酸鈉 通過靜電力的作用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多 余的4-苯乙烯磺酸鈉聚電解質，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽2mg和氯化鈉73. 13mg溶于 IOml去離子水中，放入微凝膠，80W功率超聲15min，使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力的作 用充分均勻吸附在微凝膠表面，用篩網濾出微凝膠，去離子水洗滌，去除多余的聚烯丙基胺 鹽酸鹽聚電解質，即可；(6)重復步驟⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚電解質層數，即得本實 施例所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑。采用實施例1 4的方法制備本發明的脈沖制劑，進行如下的實驗驗證一、粒徑及表面電位的測定將微凝膠核分散在去離子水中，用Masersizer2000*ktasizer nano M分別測 得未包衣聚電解質微凝膠的粒徑和zeta電位，在聚電解質逐層吸附過程中，每吸附一層聚 電解質，同步測量一次微凝膠粒徑及電位，得到自組裝微凝膠在制備過程中的粒徑變化及 電位變化。結果顯示，實施例1 3未包衣的殼聚糖-海藻酸鈉微凝膠的平均粒徑是 409. 18士6.47μπι(η = 3)，如圖I(A)所示，而且粒徑分布范圍較窄。由于聚電解質層有一 定的厚度，(PSS/PAH) 3包衣微凝膠脈沖制劑的平均粒徑是452. 90士2. 71 μ m(n = 3)，如圖 KB)所示。在逐層包衣過程中，粒子表面電位交替變化如圖1 (C)所示。實施例4中在制備時上調高壓靜電場壓力，可以得到粒徑較小的粒子，用 ktasizernanc^S測得平均粒徑為152. 9士3. 51nm，如圖9所示。取一定量包衣微凝膠置于 銅網上，用吹風機吹干表面水分后，在透射電鏡下觀察形態，如圖10所示。二、掃描電鏡觀察分別取一定量殼聚糖-海藻酸鈉微凝膠核心和聚電解質包衣微凝膠，用濾紙擦干 表面多余水分之后，放在樣品板上，在掃描電鏡的低真空模式下觀察，得到未包衣微凝膠 (如圖2㈧所示)和聚電解質包衣微凝膠(如圖2(B)所示)的完整形態。分別取一定量空白微凝膠和空白聚電解質包衣微凝膠，用梯度乙醇-水溶液(乙 醇/水30% 100% )逐一浸泡10min，4°C自然揮干乙醇，將樣品涂于樣品板上，噴金粉后， 在掃描電鏡的高真空模式下觀察，得到未包衣微凝膠(如圖2(C)所示)和包衣微凝膠(如 圖2 (D)所示)的表面形態。未包衣微凝膠和包衣微凝膠的形態較圓整，由于微凝膠內部是液態結構，所以在 真空狀態下，微凝膠表面會因為少量失水而皺縮。但是聚電解質包衣層有一定的機械強度， 相比未包衣微凝膠，更好的保持了球體的圓整性。并且包衣前后，微凝膠的表面形態也發生 了變化。三、激光共聚焦顯微鏡觀察取少量載FITC-dextranQOOOkD)的微凝膠，用 PSS 和 PAH-RBITC 包衣至(PSS/ PAh-RBITO2，滴加到直徑3. 5cm的塑料培養皿上，置于共聚焦顯微鏡下觀察，藥物在微凝膠中的分布比較均勻，聚電解質均勻吸附在微凝膠核心的表面，并沒有侵染到核心內部，如圖 3所示。四、釋體外放全過程取少量載FITC-dextranQOOOkD)的微凝膠，用 PSS 和 PAH-RBITC 包衣至(PSS/ PAH-RBITC)2，用濾紙擦干表面水分后，置于直徑3. 5cm的塑料培養皿中，滴入少量PBS溶液 (用NaOH調至pHll)，固定于37°C恒溫槽中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察變化，并且拍攝變 化的全過程。如圖4所示(Al A6)，激光共聚焦顯微鏡視野下，聚電解質包衣微凝膠逐漸膨脹， 粒徑增大(Al Α； )(選擇任意兩個包衣微凝膠粒子，粒徑變化由477 μ m增大到515 μ m，另 一個由352 μ m到404 μ m)，脹破包衣層(A4)，藥物大量釋放出來腳，最后微凝膠失去圓整 形態，結構坍塌(A6)。符合體系降解和膨脹壓共同形成的脈沖釋藥系統的理論釋放機制。五、體內釋放全過程將(PSS/PAH)4包衣的殼聚糖海藻酸鈉微凝膠在紫外燈下輻照15min后，均勻分散 于滅菌的細胞用PBS中。用脫毛膏將小鼠的側腹部脫毛后，分別取0. 2ml包衣微凝膠注射 于小鼠兩側腹部皮下。在lh、3h、4h后，各處死一只小鼠，立即取下包圍在微凝膠周圍的皮 下組織，做冷凍切片，切成8 μ m的薄片后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察聚電解質包衣微凝 膠變化過程。他后處死一只小鼠，取下包圍在微凝膠周圍的皮下新鮮組織，放于4 %多聚甲 醛中4°C條件下保存Μι。組織以梯度濃度的乙醇溶液脫水后，切成4μπι薄片，DAPI染色， 加一滴抗熒光淬滅劑，石蠟包埋后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察藥物的釋放情況，如圖5所
7J\ ο圖5中可見，聚電解質逐層組裝的微凝膠經小鼠皮下注射后，初期(Ih)基本保持 圓整形態；3h后包衣微凝膠開始變形，但是聚電解質膜結構仍然保持完整，藥物仍然儲存 在制劑內部；4h時，包衣微凝膠已經開始破裂，并有少量藥物釋放，所以推測體內時滯應該 在池至4h之間出h后，藥物幾乎全部釋放，聚電解質層破裂，包衣微凝膠結構徹底坍塌，藥 物釋放到皮下組織中。六、殼聚糖-海藻酸鈉微凝膠核心的膨脹性能測定將制備好的新鮮未包衣微凝膠分散于去離子水中，取出一部分，立即用激光粒度 儀測其粒徑，得到未包衣微凝膠的原始粒徑Ltl;用篩網(106μπι)將剩余微凝膠收集起來， 濾去水分，在50ml離心管中，用PBS (ρΗ 7.4)溶液重新分散，置于37°C水浴搖床中，分別于 lh、2h、;3h將其取出部分測其粒徑Ln，計算得(LnZltl) X 100%，得到粒徑變化的百分比，各處 方平行三份，以時間為橫坐標，粒徑變化的百分比為縱坐標作圖，如圖6所示。七、本脈沖制劑的體外釋放實驗將新鮮包衣微凝膠用濾紙吸干水分后，精密稱取一定量(每個處方稱取的包衣微 凝膠質量盡可能的接近，避免包衣微凝膠膨脹后的體積影響釋放液的體積，導致累積釋放 量計算不準確)，置于50ml離心管中，用移液管取7ml PBS (ρΗ 7. 4)，將離心管放于37°C水 浴搖床中，在設定時間點將離心管取出，待大部分微凝膠沉降后，取上清液0. 7ml，同時補足 新鮮PBS釋放液0. 7ml。將樣品在15000rpm速度下離心5min，取上清液0. 6ml，用熒光分光 光度計檢測吸光度A，計算累積釋放量，各處方平行三份，以時間為橫坐標，累積釋放量為縱 坐標作圖，如圖7所示。
本發明制劑(PSS/PAH)4包衣微凝膠的釋放時滯為2. 35h左右，時滯后0. 95h釋放 量達到80% ； (PSS/PAH)6包衣微凝膠的釋放時滯為4. 15h左右，時滯后1. 52h釋放量達到 80%。八、組織刺激性試驗將制備的新鮮載FITC-dextran包衣微凝膠在紫外燈下輻照15min后，均勻分散于 滅菌的細胞用PBS中。用脫毛膏將小鼠的側腹部脫毛后，取0. 2ml包衣微凝膠注射于小鼠 側腹部皮下，在他后處死一只小鼠，立即取下包圍在微凝膠周圍的皮下組織，放于4%多聚 甲醛固定液中4°C條件下保存24h后，組織依次以梯度濃度的乙醇溶液脫水，然后切成4 μ m 薄片，蘇木精-伊紅(HE)染色，石蠟包埋后于光學顯微鏡下觀察。同時，取另一只小鼠注射 生理鹽水作為對照組，結果如圖8所示。A2是已經破裂的包衣微凝膠，此時藥物已經釋放。注射制劑部位的皮下細胞(Al) 與注射生理鹽水的皮下細胞(B》相比，未出現任何異常，給藥部位周圍組織未出現組織損 傷和壞死，也沒有炎癥反應以及血管增生，說明制劑安全，生物相容性好。以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能 因此而理解為對本發明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發明的保護范 圍。因此，本發明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所述制劑是由自膨 脹微凝膠核和聚電解質包衣層組成，其中，自膨脹微凝膠核主要由殼聚糖和海藻酸鈉組成， 聚電解質包衣層是由4-苯乙烯磺酸鈉層和聚烯丙基胺鹽酸鹽層交替組成。
2.按照權利要求1所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所 述自膨脹微凝膠核是由殼聚糖0. 1 0. 5g、海藻酸鈉60 lOOmg、氯化鈣1 4g、藥物 200 800 μ g溶于l(Mml去離子水中制備而成。
3.按照權利要求2所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所 述自膨脹微凝膠核是由殼聚糖0. 2g、海藻酸鈉80mg、氯化鈣2g、藥物400 μ g溶于l(Mml去 離子水中制備而成。
4.按照權利要求1所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所 述4-苯乙烯磺酸鈉層是將自膨脹微凝膠核或微凝膠制劑置于含4-苯乙烯磺酸鈉0. 2 2mg/ml、氯化鈉7. 313 117mg/ml的去離子水溶液中吸附而成。
5.按照權利要求4所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所 述去離子水溶液中含4-苯乙烯磺酸鈉lmg/ml、氯化鈉29. 25mg/ml。
6.按照權利要求1所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于聚 烯丙基胺鹽酸鹽層是將自膨脹微凝膠制劑置于含聚烯丙基胺鹽酸鹽0. 2 ang/ml、氯化鈉 7. 313 117mg/ml的去離子水溶液中吸附而成。
7.按照權利要求6所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于所 述去離子水溶液中含聚烯丙基胺鹽酸鹽lmg/ml、氯化鈉29. 25mg/ml。
8.按照權利要求1至3任一項所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特 征在于所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑粒徑為IOOnm 600 μ m ；殼聚糖 的相對分子量為20 700kd。
9.按照權利要求8所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑，其特征在于殼 聚糖的相對分子量為lookd。
10.權利要求1至9任一所述聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑的制備方法， 包括如下步驟(1)配制殼聚糖-氯化鈣溶液取殼聚糖分散于去離子水中，完全溶解后加入氯化鈣， 調節PH至1.2，備用；(2)配制含藥物的海藻酸鈉溶液將海藻酸鈉加入去離子水中，水浴加熱溶解，將藥物 用去離子水溶解，按比例將海藻酸鈉溶液和藥物溶液混合，使之均勻互溶，備用；(3)微凝膠核心的制備將含藥物的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場作用下滴入殼聚 糖-氯化鈣溶液中，在磁力攪拌作用下固化成不溶于水的微凝膠，固化完全后，取出靜電 場，繼續磁力攪拌，使微凝膠充分固化，濾出微凝膠，去離子水洗滌，4°C保存備用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸鈉層取4-苯乙烯磺酸鈉和氯化鈉溶于去離子水中，放入微凝 膠，在60 100W功率超聲條件下使4-苯乙烯磺酸鈉通過靜電力作用均勻吸附在微凝膠表 面，濾出微凝膠，去離子水洗滌，即可；(5)包衣聚烯丙基胺鹽酸鹽層取聚烯丙基胺鹽酸鹽和氯化鈉溶于去離子水中，放入 微凝膠，在60 100W功率超聲條件下使聚烯丙基胺鹽酸鹽通過靜電力作用均勻吸附在微 凝膠表面，濾出微凝膠，去離子水洗滌，即可；(6)重復步驟(4)和(5)，即得聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑。
全文摘要
本發明公開了一種聚電解質逐層組裝的自膨脹微凝膠脈沖制劑及其制備方法，所述制劑是由自膨脹微凝膠核和聚電解質包衣層組成，粒徑為100nm～600μm，其中，自膨脹微凝膠核主要由殼聚糖和海藻酸鈉組成，聚電解質包衣層是由4-苯乙烯磺酸鈉層和聚烯丙基胺鹽酸鹽層交替組成，是一種體系降解和膨脹壓共同作用的脈沖制劑，釋放完全依賴制劑自身結構和高分子材料的性質，而且時滯可控性強，在給藥后，經過一個藥物不釋放的時滯期后，藥物大量釋放，經實驗驗證，本發明脈沖制劑的組織刺激性小，安全性良好，該制劑所用材料價廉易得，核心粒徑精確可控，而且殼聚糖海藻酸鈉微凝膠帶有一定的pH敏感性，使制劑的釋放行為更加靈活可控。
文檔編號A61K47/32GK102058518SQ20111000845
公開日2011年5月18日 申請日期2011年1月15日 優先權日2011年1月15日
發明者俞媛, 劉俊杰, 劉青鋒, 周閨臣, 孫治國, 張磊, 張翮, 鄒豪, 鐘延強, 陳琰, 高靜, 魯瑩, 黃景彬 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學