專利名稱：一種阿霉素緩釋納米顆粒及其制備方法
技術領域：
本發明涉及以所用的非有效成分為特征的醫用配制品，具體涉及持續釋放型阿霉素藥物。
背景技術：
阿霉素是一種蒽環類抗腫瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，從而阻止腫瘤細胞的生長，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。對急性白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其它各種癌癥都有療效。目前臨床給藥多為靜脈滴注，但阿霉素不能透過血腦屏障，且靜注后該藥迅速分布全身，有強烈的毒副作用，主要表現在心臟毒性，輕者表現為心律失常，重者出現進行性心肌病變而發生充血性心力衰竭；致白細胞和血小板減少，骨髓抑制；毛發脫落；消化道反應，惡心、食欲減退；藥物溢出血管外可引起組織潰瘍及壞死。這些毒副作用限制了阿霉素在臨床化療的廣泛應用，盡管用藥劑量很大，能達到病灶部位發揮療效的比例卻很低。為降低其毒性、提高療效，阿霉素新劑型的研究成為亟待解決的問題。公開號CN101234205A的專利申請公開了一種“具有靶向功能的高分子阿霉素鍵合藥納米膠囊”，該納米膠囊由兩種聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物混合組裝而成，其中一種嵌段共聚物的聚乳酸鏈端接有阿霉素，在納米膠囊中的摩爾比例為98%-70%;另一種嵌段共聚物的聚乙二醇鏈端接有乳糖，在納米膠囊中的摩爾比例為2-30%。上述專利申請所述方案中，連接在聚乳酸鏈段上的阿霉素處于膠囊內核，受聚乳酸和聚乙二醇的雙重保護，具有緩釋功能；連接在聚乙二醇鏈端的乳糖處于膠囊外層，具有靶向功能，使納米膠囊優先進入攜帶乳糖受體的細胞。但是，由于所述的聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物不僅分子量較大而且是一種鏈狀結構，因此絕大部分的鏈段是，一頭纏繞包埋在納米顆粒的內部，另一頭顯露在納米顆粒的表面。那么，當阿霉素顯露在納米顆粒的表面時就失去了緩釋作用，當乳糖基團被纏繞包埋在納米顆粒的內部時就不具有靶向功能。此外，由于聚乳酸的乳酸分子間是由一個分子-OH與另一個分子的-COOH脫水縮合而成的，而這種酯鍵相連相對于阿霉素與聚乳酸之間的酰胺鍵連接較脆弱，在生物降解的過程容易出現斷鏈，此時的阿霉素上往往會連著一段聚乳酸而影響藥效。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種阿霉素靶向緩釋納米顆粒，該納米顆粒具有靶向控釋效果好的優點。本發明解決上述問題的技術方案如下所述一種阿霉素緩釋納米顆粒，該納米顆粒按質量百分比包括阿霉素6-16%和黃瓜花葉病毒83-93%，其中所述的阿霉素經黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白表面的微孔透過所述衣殼蛋白吸附在黃瓜花葉病毒的RNA上。本發明所述的阿霉素緩釋納米顆粒還可以進一步改進成具有靶向功能的緩釋納米顆粒，該改進的緩釋納米顆粒還包括質量百分比為1-2%的靶向基團葉酸，所述的葉酸鍵接在黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白的表面。上述技術方案中，所述的阿霉素可以是阿霉素同分異構體或阿霉素衍生物；所述的黃瓜花葉病可采用植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取得到，具體提取方法可參照 Howard Scott 所公開的方法實施(Howard Scott,Purification of Cucumber Mosaic Virus, Virology,1963，20，103-106.)。上述阿霉素緩釋納米顆粒的制備方法由以下步驟組成(1)按植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取黃瓜花葉病毒，然后將其加入到穩定液中，使黃瓜花葉病毒在穩定液中的重量濃度為0. 5-5mg/mL，得到含黃瓜花葉病毒緩沖液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的重量濃度為0. 10-1. 25mg/mL，得阿霉素溶液；C3)將所制得的含黃瓜花葉病毒緩沖液與阿霉素溶液按1 1的體積比混合， 2-8°C下溫浴12-16小時；然后用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得阿霉素緩釋納米顆粒；上述步驟(1)和(3)中所述的穩定液由乙二胺四乙酸與PH6-8的緩沖液組成，且乙二胺四乙酸在穩定液中的重量濃度為1. 5-;3mg/mL。上述具有靶向功能的緩釋納米顆粒的制備方法由以下步驟組成(I)將葉酸和分別為葉酸5-10倍質量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于反應溶劑中，并使葉酸在反應溶劑中質量濃度為 0. 5-lmg/mL，室溫下反應4小時，得經活化的葉酸溶液；其中，所述的反應溶劑為體積比是穩定液DMSO = 4:1的混合溶液；(II)取上述阿霉素緩釋納米顆粒的制備方法中所制得的阿霉素緩釋納米顆粒加入穩定液重懸，使載有阿霉素的黃瓜花葉病毒在穩定液中的濃度為0. 5-5mg/mL，加入等體積的步驟⑴所制得的葉酸溶液，2-8°C下溫浴反應12-16小時，用質量濃度為10% 40% 的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取葉酸修飾的載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶， 最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得具有靶向功能的緩釋納米顆粒；上述步驟(I)和(II)所述的穩定液由乙二胺四乙酸與pH 6-8的緩沖液組成，且乙二胺四乙酸在穩定液中的濃度為1. 5-;3mg/mL。本發明所述的阿霉素緩釋納米顆粒可按常規的方法制成注射劑和各種口服制劑， 以治療惡性腫瘤。當將本發明所述的具有靶向功能的緩釋納米顆粒制備成注射劑時，治療惡性腹水可采用腹腔內注射給藥，治療實體腫瘤可局部注射給藥。由于黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白為一種具有一定的剛性的自然分子支架，平均粒徑 29nm(粒徑分布觀_30歷)，其表面還密布有微孔，因此利用正負電荷的吸引作用，阿霉素很容易透過所述的衣殼蛋白物理吸附或嵌合在黃瓜花葉病毒的RNA上。在所述正負電荷的吸引和衣殼蛋白保護的雙重作用下，不僅阿霉素不會在黃瓜花葉病毒的RNA上脫落，而且大大延緩了阿霉素的釋放速度。此外，相較與現有技術，不會出現鍵接藥物粘連斷鏈的高分子聚合載體的技術問題，因此可完全保持阿霉素的藥理活性不受損。
由于葉酸的分子體積小且葉酸受體的親和力高，而腫瘤組織上葉酸受體密度又顯著高于正常組織，因此，本發明的進一步改進方案將葉酸鍵合在所述緩釋納米顆粒表面，賦予了所述緩釋納米顆粒的靶向功能，通過葉酸受體介導的內吞通路，葉酸鍵合的緩釋納米顆粒內的阿霉素被腫瘤選擇性地吸收，顯著降低了阿霉素的毒副作用。尤其是，本發明所述的黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白為一種具有一定的剛性的自然分子支架，且其球狀的三維空間結構的表面密布有氨基基團，因此，當葉酸分子的羧基基團被活化后，便很容易密集且均勻地鍵接于黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白的表面，在“集束效應”的作用下，所述緩釋納米顆粒在腫瘤組織上的富集效果得以進一步提高。以下通過釋藥實驗和療效及毒性對比實驗來進一步說明本發明所述阿霉素緩釋納米顆粒所能達到的技術效果。一、釋藥實驗1、實驗藥品樣品取實施例1所得阿霉素緩釋納米顆粒，加水使阿霉素在水中的濃度為 100μ g/mL0對照品取阿霉素用水稀釋成100 μ g/mL。2、實驗方法取樣品50 μ L置于透析管中；取25mL pH為7. 4的PBS溶液為透析介質，將透析管放入透析介質中，于37°C下以100轉/分鐘攪拌透析；以1-8小時的時間間隔，每次定時取 200uL透析液，采用熒光分光光度法測定透析液中所釋放的阿霉素含量。取對照品50 μ L采用上述相同透析和測定方法進行釋藥實驗。上述樣品和對照品的阿霉素釋放曲線如圖3所示。由圖3可見，所述對照品在4小時內就爆性發釋放50%，持續釋放僅為M小時，而所述樣品的持續釋放時間長達5天以上，療效持久，不需要頻繁間斷給藥。二、心肌細胞毒性實驗1、實驗藥品樣品取實施例1所得阿霉素緩釋納米顆粒，加水使阿霉素在水中的濃度為 100 μ g/mLO對照品取阿霉素用水稀釋成100 μ g/mL。2、實驗方法取小鼠心肌細胞加入到20%胎牛血清的DMEM培養液中，調整小鼠心肌細胞至 1. 5X IO4個/mL ；將所配制的小鼠心肌細胞培養液接種于共聚焦培養皿中，每孔2mL，于 37°C,5% CO2及飽和濕度下培養M小時。將共聚焦培養皿的加樣孔分成樣品組和對照組， 每組設5個復孔；往樣品組的每個加樣孔中加入IOOuL樣品，于37°C、5% CO2及飽和濕度下繼續培養3小時。同樣，往對照組的每個加樣孔中加入50 μ L對照品，以同樣的條件繼續培養3小時。細胞培養3小時后，移除細胞培養液，用PBS液洗滌細胞三次后，用90%乙醇固定20分鐘，再用PBS液洗滌細胞三次，接著用DAPI液染細胞核，再用PBS液洗滌細胞三次， 置于共聚焦顯微鏡下觀察，實驗結果見圖4。由圖4可見，對照品中游離阿霉素大量進入小鼠心肌細胞核中(左圖)，與DAPI的藍色熒光疊加使細胞核呈紫色；與對照品相比，樣品中的黃瓜花葉病毒納米顆粒(右圖)顯著減少了阿霉素在心肌細胞核中的聚集，從而減少了心臟毒性。
三、藥效學實驗1、實驗藥品樣品取實施實例4所得具有靶向功能的緩釋納米顆粒，加水稀釋至阿霉素在水中的的濃度為450-550ug/mL。對照品市售的阿霉素注射劑。2、實驗方法取體重為18-22g/只的小鼠18只，將含0VCAR-3瘤細胞數為5*106個/mL的無菌生理鹽水200 μ L注射至裸鼠腹腔進行接種，構建惡性卵巢癌腹水瘤模型，18天后腹水瘤便形成。將18只上述惡性卵巢癌腹水瘤小鼠隨機均分為陰性對照組、治療組和對照組；其中， 陰性對照組，不給藥，治療組按5mg/kg給以樣品，對照組按5mg/kg給以阿霉素注射液劑。給藥間隔為5天后，定期測量小鼠腹圍，結果如圖6所示。由圖6可見，樣品對卵巢癌細胞0VCAR-3細胞系腹水瘤模型有較好抑瘤作用。
圖1為用黃瓜花葉病毒構建靶向控釋體系示意圖。圖2為蔗糖密度梯度離心對照圖，其中，左圖為黃瓜花葉病毒，右圖為包裹阿霉素的黃瓜花葉病毒。圖3為用透析法測定本發明所述阿霉素緩釋納米顆粒釋放的曲線圖。圖4為小鼠心肌細胞毒性實驗的共聚焦顯微照片，其中，左圖為阿霉素的毒性實驗結果，右圖為阿霉素緩釋納米顆粒的毒性實驗結果。圖5為飛行時間質譜圖，其中，A圖為黃瓜花葉病毒的飛行時間質譜圖，B圖為本發明所具有靶向功能的緩釋納米顆粒的飛行時間質譜圖。圖6本發明所具有靶向功能的緩釋納米顆粒抑制裸鼠0VCAR-3腹水瘤的效果曲線圖。
具體實施例方式實施例1 首先將乙二胺四乙酸溶于IOmM pH 7. 4的Tris緩沖液中，準備好乙二胺四乙酸濃度為2. 8mg/mL的穩定液后按以下步驟進行操作(1)按公知的植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取黃瓜花葉病毒，然后將其加入到穩定液中，使黃瓜花葉病毒在穩定液中的濃度為5mg/mL，得到含黃瓜花葉病毒緩沖液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的濃度為1. 25mg/m L，得阿霉素溶液；(3)將含黃瓜花葉病毒緩沖液和阿霉素溶液各ImL在4°C下混合溫浴14小時；然后用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得阿霉素緩釋納米顆粒。為了使公眾進一步理解上述步驟(3)中所述蔗糖溶液進行密度梯度離心的作用和效果，本發明人將上述步驟(3)的離心管與采用同樣的方法密度梯度離心黃瓜花葉病毒溶液的離心管放在一起拍攝了一張照片(見圖2)。實施例2 首先將乙二胺四乙酸溶于IOmM pH6的磷酸鹽緩沖液中，準備好乙二胺四乙酸濃度為ang/mL的穩定液后按以下步驟進行操作(1)按公知的按植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取黃瓜花葉病毒，然后將其加入到穩定液中，使黃瓜花葉病毒在穩定液中的濃度為^ig/mL，得到含黃瓜花葉病毒緩沖液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的濃度為0. 5mg/mL,得阿霉素溶液；(3)將含黃瓜花葉病毒緩沖液和阿霉素溶液各2mL在2°C下混合溫浴16小時；然后用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得阿霉素緩釋納米顆粒。實施例3 首先將乙二胺四乙酸溶于IOmM pH8. 0的Tris緩沖液中，準備好乙二胺四乙酸濃度為1. 6mg/mL的穩定液后按以下步驟進行操作(1)按按公知的植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取黃瓜花葉病毒，然后將其加入到穩定液中，使黃瓜花葉病毒在穩定液中的濃度為2. %ig/mL，得到含黃瓜花葉病毒緩沖液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的濃度為0. ang/mL，得阿霉素溶液；(3)將含黃瓜花葉病毒緩沖液和阿霉素溶液各ImL在8°C下混合溫浴12小時。然后用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得阿霉素緩釋納米顆粒。實施例4 1.具有靶向功能的緩釋納米顆粒的制備將乙二胺四乙酸溶于10mM，pH7. 4的Tris緩沖液中，制得乙二胺四乙酸濃度為 2. 8mg/mL的穩定液，備用；取穩定液，加入1/4穩定液體積的DMSO得到反應溶劑，備用；將5mg葉酸和50mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽及50mg N-羥基琥珀酰亞胺溶于5mL反應溶劑中，室溫下反應4小時，得經活化的葉酸溶液；取實施例1所制得的阿霉素緩釋納米顆粒4. 56mg加入穩定液4mL重懸，加入上述活化的葉酸溶液4mL，5°C下溫浴反應14小時后，用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取葉酸修飾的載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得具有靶向功能的緩釋納米顆粒。2.具有靶向功能的緩釋納米顆粒中葉酸、阿霉素和黃瓜花葉病毒含量的測定(1)葉酸含量測定精密稱取0. 0020g葉酸對照品，在IOmL容量瓶中用IOmM pH6. 8磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度，配制成200 μ g/ml的葉酸對照品貯備液。分別取上述對照品儲備液0. ImL, 0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 75mL、lmL 置 IOmL 容量瓶中，用 10mM，pH6. 8 磷酸鹽緩沖液定容搖勻，配成濃度分別為1、2、4、6、8、10、15、20μβ/πι1的對照品溶液。以10mM，pH6. 8磷酸鹽緩沖液為參比，用1厘米石英池在360nm處分別測定每一份對照品溶液的吸光度，然后以吸光度Y對濃度X進行線性回歸，得回歸直線方程為Y = O. 0120X+0. 0521，R2 = 0. 9962。取所得具有靶向功能的緩釋納米顆粒^ig為樣品，溶于4mL IOmM pH6. 8的磷酸鹽緩沖液中，用1厘米石英池在360nm處測得其吸光度值為0. M41，再根據回歸直線方程計算出樣品中的葉酸含量為16μ g/mg。(2)阿霉素含量測定精密稱取0. 0020g阿霉素對照品，在IOmL容量瓶中用IOmM pH6. 8磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度，配制成200 μ g/ml的阿霉素對照品貯備液。分別取上述對照品儲備液
0.ImL,0. 2mL、0. 3mL、0. 4mL、0. 5mL、0. 75mL、lmL 置 IOmL 容量瓶中，用 IOmM pH6. 8 磷酸鹽緩沖液定容搖勻，配成1、2、4、6、8、10、15、20μβ/πι1的對照品溶液。以10mM，pH6. 8磷酸鹽緩沖液為參比，用1厘米石英池在495nm處分別測定每一份對照品溶液的吸光度，然后以吸光度Y對濃度X進行線性回歸，得回歸直線方程為Y = O. 0134X+0. 0696，R2 = 0. 9916。取所得具有靶向功能的緩釋納米顆粒Img為樣品，溶于IOmL 10mMpH6. 8磷酸鹽緩沖液中，用1厘米石英池在495nm處測得吸光度值為0. 2572，再根據回歸直線方程計算出樣品中的阿霉素含量為140 μ g/mg。(3) Lowry法黃瓜花葉病毒含量測定用美國Pierce公司的改良Lowry蛋白定量試劑盒中的標準蛋白為對照品，并其按照說明書進行實驗操作配制標準蛋白濃度范圍為10-1500yg/ml的一系列濃度不同的對照品溶液，用1厘米石英池在750nm處分別測定每一份對照品溶液的吸光度，然后以吸光度 Y對濃度X進行線性回歸，得回歸直線方程為Y = O. 0016X+0. 1871，R2 = 0. 9807。取所得具有靶向功能的緩釋納米顆粒Ojrng溶于0.4mL IOmM pH6. 8磷酸鹽緩沖液中，加入2mL試劑盒中的改性Lowry試劑后混勻，室溫下靜置10分鐘；接著加入0. ImL試劑盒中1. ON酚試劑混勻，室溫下靜置30分鐘；用1厘米石英池在750nm處測得吸光度值
1.5311，再根據回歸直線方程計算出樣品中的黃瓜花葉病毒含量為840μ g/mg.。將上述質量比折算成質量百分含量可見本例中所得具有靶向功能的緩釋納米顆粒中，阿霉素的質量含量為14%，葉酸的質量含量為1.6%，黃瓜花葉病毒的質量含量為 84%。3.飛行時間質譜分析為進一步確證葉酸鍵接在黃瓜花葉病毒上，本例按下述方法進行黃瓜花葉病毒飛行時間質譜分析將具有靶向功能的緩釋納米顆粒重懸于水中，調節其中黃瓜花葉病毒的濃度為lmg/mL，取M μ L與6 μ L6M的鹽酸胍水溶液混勻，用Ziptipei8脫鹽后直接用質譜基質液洗脫，進行質譜分析，所得譜圖見圖5。由圖5可見，黃瓜花葉病毒衣殼蛋白亞基的質荷比m/z為M140(見A曲線)，而葉酸修飾后黃瓜花葉病毒衣殼蛋白亞基質荷比m/z為 M563(見B曲線)，確證葉酸鍵接在黃瓜花葉病毒衣殼蛋白亞基上。實施例5 將乙二胺四乙酸溶于pH6. O的磷酸鹽緩沖液中，制得乙二胺四乙酸濃度為2mg/mL的穩定液，備用；取穩定液，加入1/4穩定液體積的DMSO得到反應溶劑，備用；將％^葉酸和32mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽及32mg N-羥基琥珀酰亞胺溶于5mL反應溶劑中，室溫下反應4小時，得經活化的葉酸溶液；取實施例2所制得的阿霉素緩釋納米顆粒6mg加入穩定液3mL重懸，加入上述活化的葉酸溶液中加入3mL，2°C下溫浴反應16小時后，用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取葉酸修飾的載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得具有靶向功能的緩釋納米顆粒。將所得到的具有靶向功能的緩釋納米顆粒采用與實施例4同樣的方法進行進行紫外-可見分光光度分析，測得其中，含阿霉素11%，黃瓜花葉病毒87 %，葉酸1. 3 %。實施例6 將乙二胺四乙酸溶于pH8. 0的Tris緩沖液中，制得乙二胺四乙酸濃度為1. 6mg/mL 的穩定液，備用；取穩定液，加入1/4穩定液體積的DMSO得到反應溶劑，備用；將3mg葉酸和15mg 1_(3_ 二甲基氨基丙基)_3_乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽及15mg N-羥基琥珀酰亞胺溶于5mL反應溶劑中，室溫下反應4小時，得經活化的葉酸溶液；取實施例3所制得的阿霉素緩釋納米顆粒^ig加入穩定液ImL重懸，加入上述活化的葉酸溶液中加入lmL，8°C下反應12小時后，用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取葉酸修飾的載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得具有靶向功能的緩釋納米顆粒。將所得到的具有靶向功能的緩釋納米顆粒采用與實施例4同樣的方法進行進行紫外-可見分光光度分析，測得其中，含阿霉素7 %，黃瓜花葉病毒92 %，葉酸1. 1 %。
權利要求
1.一種阿霉素緩釋納米顆粒，該納米顆粒按質量百分比包括阿霉素6-16%和黃瓜花葉病毒83-93%，其中所述的阿霉素經黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白表面的微孔透過所述衣殼蛋白吸附在黃瓜花葉病毒的RNA上。
2.根據權利要求1所述的一種阿霉素緩釋納米顆粒，其特征在于，所述的緩釋納米顆粒還包括質量百分比為1-2%的靶向基團葉酸，所述的葉酸鍵接在黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白的表面。
3.一種制備權利要求1所述阿霉素緩釋納米顆粒的方法，該方法由以下步驟組成(1)按植物病毒學方法從感染黃瓜花葉病毒的黃瓜葉中提取黃瓜花葉病毒，然后將其加入到穩定液中，使黃瓜花葉病毒在穩定液中的重量濃度為0. 5-5mg/mL，得到含黃瓜花葉病毒緩沖液；(2)取阿霉素加水溶解，使阿霉素在水中的重量濃度為0.10-1. 25mg/m L，得阿霉素溶液；(3)將所制得的含黃瓜花葉病毒緩沖液與阿霉素溶液按1 1的體積比混合，2-8°C下溫浴12-16小時；然后用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得阿霉素緩釋納米顆粒；上述步驟(1)和(3)中所述的穩定液由乙二胺四乙酸與pH6-8的緩沖液組成，且乙二胺四乙酸在穩定液中的重量濃度為1. 5-;3mg/mL。
4.一種制備權利要求2所述阿霉素緩釋納米顆粒的方法，該方法由以下步驟組成(I)將葉酸和分別為葉酸5-10倍質量的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳酰二亞胺鹽酸鹽及N-羥基琥珀酰亞胺溶于反應溶劑中，并使葉酸在反應溶劑中質量濃度為 0. 5-lmg/mL，室溫下反應4小時，得經活化的葉酸溶液；其中，所述的反應溶劑為體積比是穩定液DMSO = 4:1的混合溶液；(II)取權利要求3所制得的阿霉素緩釋納米顆粒加入穩定液重懸，使載有阿霉素的黃瓜花葉病毒在穩定液中的濃度為0. 5-5mg/mL，加入等體積的步驟(I)所制得的葉酸溶液， 2-8°C下溫浴反應12-16小時，用質量濃度為10% 40%的蔗糖溶液進行密度梯度離心，用長針頭吸取葉酸修飾的載有阿霉素黃瓜花葉病毒區帶，最后用穩定液洗滌，離心分離，收集沉淀物，冷凍干燥即得具有靶向功能的緩釋納米顆粒；上述步驟(I)和(II)所述的穩定液由乙二胺四乙酸與PH6-8的緩沖液組成，且乙二胺四乙酸在穩定液中的濃度為1. 5-;3mg/mL。
全文摘要
本發明涉及一種阿霉素緩釋納米顆粒，該納米顆粒按質量百分比包括阿霉素6-16％和黃瓜花葉病毒83-93％，其中所述的阿霉素經黃瓜花葉病毒的衣殼蛋白表面的微孔透過所述衣殼蛋白吸附在黃瓜花葉病毒的RNA上。本發明所述的阿霉素緩釋納米顆粒不僅大大延緩了阿霉素的釋放速度，而且鍵接靶向基團葉酸后可進一步提高所述緩釋納米顆粒在腫瘤組織上的富集效果。
文檔編號A61K31/704GK102335139SQ20111030397
公開日2012年2月1日 申請日期2011年10月8日 優先權日2011年10月8日
發明者曾慶冰 申請人:南方醫科大學