專利名稱：一種寡肽a及其抗菌應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗菌肽及其應用，尤其涉及一種寡肽A及其抗菌應用，屬生物醫學技術領域。
背景技術：
目前，因抗菌藥物的泛濫使用，產生了一些新的問題，如出現的相應耐藥性致病株，即產生了細菌的耐藥性，而致病菌的耐藥性已經日益嚴重地威脅著人類的健康和疾病臨床治療。因此，尋找全新類型的抗菌藥物已成為解決耐藥性問題又一對策。抗菌肽是指分布于生物體內具有抵御外界微生物侵害、清除體內突變細胞的一類小分子多肽，根據肽中氨基酸的數量的不同，一般將由兩個氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽等，一直到九肽；也有文獻把由2 10個氨基酸組成的肽稱為寡肽；或稱為短肽。與抗生素不同，抗菌肽是特定基因編碼的產物，它通過破壞細胞膜通透性使細胞內容物外流，最終導致細菌死亡。因此它不會使細菌產生抗藥性， 因而避免了超級細菌的產生。近年來，肽在人體中的作用已引起科學界的高度重視。隨著醫學及生化技術的發展，多肽類藥物將成為21世紀重要的診斷、監測、預防和治療藥。因此，針對日益突出的細菌的耐藥性問題，開發具有顯著抑菌活性的寡肽即多肽藥物，具有重要意義。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種寡肽A及其抗菌應用。本發明所述的寡肽A，其特征在于寡肽A是SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，具體是:Gly Lys Ala Phe Val Lys Lys0本發明所述寡肽A在制備抗細菌藥物中的應用。本發明提供的寡肽A具有顯著的抑菌功能，同時對正常細胞無毒性。功能實驗顯示本發明所述寡肽A抗菌譜廣，無論是對革蘭氏陽性菌、還是對革蘭氏陰性菌，都具有明顯地抑制作用，而且對真菌的抑制作用也很顯著。提示其在抗細菌藥物開發和應用方面有重要價值。進一步的功能實驗顯示本發明的寡肽A對細菌的抑制作用在IOmin之內就開始發揮，20min后抑制率即可達75%以上，40min后就可達到90%以上。本發明的寡肽A不僅抗菌作用強，而且穩定性好，在100°C煮沸IOmin后，不僅活性還能保持80%，而且在酸、堿的環境中還能發揮其良好的抑菌作用。本發明提供的寡肽A合成方便，且不需任何修飾連接即具有抑菌功能，同時對正常細胞無毒性，為抗細菌藥物的開發提供了基礎。鑒于上述寡肽A的性質和功能，本領域普通技術人員可以利用分子生物學技術， 根據氨基酸與密碼子的對應關系反推出核酸序列作為功能基因，用于制備轉基因動物或植物以表達功能蛋白，以進一步用于藥物的開發和臨床治療。
具體實施例方式實施例1本發明所述寡肽A的設計與合成1、依據目前國際主要抗菌肽數據庫(http //www. imtech. res. in/raghava/ antibp/ ；http//aps.unmc. edu/AP/main. php ；http//www. bbcm. univ. trieste. it/ ； http://penbase. immunaqua. com/)中登陸的抗菌肽的序列，分析其一級結構與活性的對應關系，設計人工寡肽序列。2、利用蛋白質分析數據庫http://WWW. expasy. org/分析已知活性的多肽序列與設計的寡肽序列的二級結構的相似度，結合其它物理化學參數預測進行設計序列的修正。3、將設計的人工寡肽序列送至生物公司合成或利用自動多肽合成儀合成序列。 HPLC檢測純度要大于96%，同時通過質譜檢測確定多肽合成質量。樣品以凍干狀態保存。4、對合成后的寡肽進行抑菌功能檢測篩選。5、通過功能檢測，最終獲得具有抑菌功能的寡肽序列，命名為寡肽A，其氨基酸序列具體是:61y Lys Ala Phe Val Lys Lys0實施例2利用液體生長抑制法檢測本發明所述寡肽A的抑菌活性2. 1材料、試劑1)本發明所述寡肽A由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，氨芐青霉素 (Amp)為solarbio公司產品，一次性濾器，為美國PALL公司產品，其它藥品試劑為國產分析純。2)選用革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subti lis (Ehrenberg) Cohn)、 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus Rosenbach)、藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、藤求菌(Sarcina ureae)、蘇云金芽子包桿菌(Bacillus thuringiensis) > 巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)；革蘭氏陰性菌大腸桿菌(Escherichia coli)、 弧菌(Vibrio)、肺炎克氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、變形桿菌(Proteus)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)；真菌
病鐮刀菌(Fusarium solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、瓜類炭疽病菌 (Colietetrichum lagenarium)、蘋果炭疽病菌(Gloeosporium album)棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)進行測試。
上述菌株均購自生物公司。3)封閉液0. 4% BSA(w/v),0. 02%冰醋酸，配制后過濾除菌。4) PB 液體培養基(PH7. 4-7. 6)胰蛋白胨(Tryptone)10g/L氯化鈉(NaCl)5g/L。2. 2 實驗1)向無菌96孔酶標板的孔中加入200 μ L封閉液，室溫封閉24h。2)用PB液體培養基過夜培養上述各種細菌，轉培養使細菌處于對數生長期，然后用PB培養基調整菌液0D_約為0. 002 ；備用。
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3)酶標板棄去封閉液，每孔加90 μ L步驟幻所述菌液，再加入用10 μ L無菌水配好的各種濃度梯度(濃度范圍lmg/mL 80mg/mL)的本發明所述寡肽Α。陰性對照為90 μ L 菌液+10 μ L無菌水；陽性對照為90 μ 1菌液+10 μ L濃度為0. 25mg/mL氨芐青霉素溶液(終濃度為 0. 025mg/mL,約 62 μ M)。4)將加好菌液和藥品的酶標板置于搖床，IOOrpm恒溫培養。分別在培養后 0h、3h、12h、15h、Mh、36h，用 BIOTEK ELX800 酶標儀測定每孔的 630nm 吸光值(OD63tl)。5)利用SigmaplotlO和Excel軟件分析處理數據。結果表明，本發明的寡肽A對無論是對G+菌、還是對G_菌都能被它很好地抑制，而且對真菌的抑制作用也不錯；15mg/mL 60mg/mL濃度范圍內，濃度越大抑菌效果越明顯。 提示其在抗細菌藥物開發和應用方面有重要價值。實施例3以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。質量濃度為40mg/mL的本發明寡肽A，分別在作用大腸桿菌(Escherichia coli) IOmin, 20min, 30min, 40min, 50min, 60min 禾口 90min 后涂板。大腸桿菌抑制曲線顯示本發明的寡肽A對細菌的抑制作用在IOmin之內就開始發揮，20min后抑制率即可達75%以上，40min后就可達到90%以上。實施例4以大腸桿菌(Escherichia coli)為指示菌。將本發明的寡肽A溶液(40mg/mL)分成8份，分別于100°C加熱Omin，lmin，^iin, 4min,8min, 15min, 20min, 40min后進行抑菌實驗，每個加熱時間做3個平行組，同時做空白
對照組。結果顯示本發明的寡肽A在100°C加熱Smin后，其抑菌活性基本上沒有變；但隨著加熱時間的延長，抑菌活性有所降低，到15min時活性降低了約50% ；接近20min時，本發明的寡肽A活性幾乎全部喪失；不過加熱時間在IOmin以內，抑菌活性保持80%以上。
權利要求
1.一種寡肽A，其特征在于所述寡肽A是SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
2.權利要求1所述寡肽A在制備抗細菌藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種具抑菌活性的寡肽A，它具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本發明還公開了所述寡肽A在制備抗細菌藥物中的應用，實驗證實本發明的寡肽A抗菌譜廣，無論是G+菌、還是G-菌，都具有明顯地抑制作用，而且對真菌的抑制作用也很顯著，提示其在抗細菌藥物開發和應用方面有重要價值。
文檔編號A61K38/08GK102363627SQ201110358310
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月12日 優先權日2011年11月12日
發明者常宏文, 張尚立, 張恒, 王麗, 王萍 申請人:山東大學