專利名稱：金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及金針菇可皂化提取物及其制備方法；本發明進一步涉及所述可皂化提取物的藥物組合物；本發明還涉及所述可皂化提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
腫瘤是當今世界上危害人類健康的最嚴重疾病之一，世界各國的專家學者都在積極研究尋找治療腫瘤的方法和藥物，尤其對食用菌中抗腫瘤物質的研究十分活躍，有關這方面的動物實驗及初步臨床觀察表明食用菌中的多糖和某些蛋白對動物移植腫瘤有較強的抑制作用，能增強機體的免疫功能，減輕放療、化療的毒性反應。金針菊Flammulirm velutipes (Curt. :Fr.) Sing.，又名金錢菌、樸菇、 冬菇、毛柄金錢菌，屬真菌門(Buwcoia)，擔子菌亞門(Basidiomyco tina)，層菌綱脅膨/70 /^< ((95·)，傘菌目(Agaricales) ，口蘑禾斗{Tricholomataceae), !K'j^MM (Flammulina)、或金錢菌屬、Collybia)，是中外著名的食用菌之一，也是當今市場上十分走俏的天然保健食品之一。金針菇廣泛分布于中國、日本、俄羅斯西伯利亞和小亞西亞以及歐洲、北美洲、澳大利亞等地。在我國，北起黑龍江，南至廣東，東起福建，西至四川的廣大區域內，均有金針菇分布k郭美英主編，《中國金針菇生產》，北京:中國農業出版社， 2000.)。金針菇作為一種食用菌不僅營養豐富，而且富含多種活性物質。從上世紀七十年代起，日本、美國等國學者已經開始對金針菇進行抗腫瘤方面的基礎研究，隨后引起了國際研究學者的廣泛興趣。研究表明，其活性成分主要為蛋白質和多糖類成分。蛋白質類包括 Flammulin, Velutin, Flammin和Velin等四種核糖體失活蛋白、真菌免疫調節蛋白、金針菇毒素、火菇素、火菇蛋白原、酶和凝集素等(Maruyama H.，Ikekawa T., International Journal of Medicinal Mushrooms, 2007，9(2): 109-122. Ken ji, F., Michika, H.， Sadaki, A.，et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2008，72 (12): 3107—3113.)。多糖類包括SFA1、胞外多糖、FVP2、PA3DE和PA5DE等 ψ. Y. K. Leung, K. P. Fung, Y. Μ. Choy, Immunopharmacology, 1997，35: 255-263. K. S. Shin, K. W. Yu, H. K. Lee 1，et al, Food TecAnoL Biotechnol., 2007，)。這些成分具有抗腫瘤，抗病毒， 抗蟲，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒(HIV)，降低血清膽固醇，降壓，提高機體免疫力等廣泛藥理活性。特別是抗腫瘤作用研究得最多，對肉瘤-180、艾氏腹水瘤等均有抑制作用。其機理被認為是免疫調節作用，即在機體免疫功能受損的情況下，能夠增強T細胞功能，激活淋巴細胞及吞噬細胞，促進抗體產生，并能夠誘導干擾素-Y、腫瘤壞死因子-α的產生，它對腫瘤的抑制生長作用是通過恢復和提高整個機體的免疫能力。此外，曹培讓等從金針菇深層發酵菌絲體中分得5種化臺物大豆異黃酮，染料木素，6-甲氧基大豆素，腺苷，腺嘌呤〈曹培讓，王淑芳，徐貴祥，等.中草藥，1992, 23(10):況1 )。陳智毅等采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法(HS-SPME-GC-MS) 測定金針菇中的揮發性成分，得到5種酯類成分，4種醛類成分，烯烴、醇類、呋喃類各1種 (J東智毅，劉學銘，施英，等.食用菌學報，2009，16(1), 7J-75)。汪金玉等采用水蒸汽蒸餾法提取金針菇中揮發性成分，應用GC-MS法分離出30個組分，并鑒定出苯乙醛、鄰苯二甲酸異丁酯、鄰苯二甲酸丁酯、軟脂酸、軟脂酸乙酯、亞麻酸等6個組分(J王金玉，陳康，林勵，箏.時珍國醫國藥，2008，19(5), 1145-1146.、。Lee等從金針菇中測定出 C10:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2 六種脂肪酸的含量、KJ Lee，IJ Yun, KH Kim, et al, Journal of Food Composition and Analysis, 24 (2011) 175-178.)。然而，未見上述物質的藥理學或生物活性研究的報道。康潔等對金針菇菌絲體95%乙醇提取物的化學成分進行了研究，共得到20余個化合物，包括7個留體、3個氨基酸、3個環二肽類化合物、2個黃酮、2個核苷類化合物、2個多元醇類化合物、1個倍半萜、一個神經酰胺。其中17個化合物為首次從金針菇發酵菌絲體中得到。單體化合物藥理篩選結果表明麥角留醇和鳥嘌呤核苷有較強的抑制乙酰膽堿酯酶的作用，而甘露醇和核糖醇有較強的改善東莨菪堿所致小鼠學習記憶障礙的作用〈康潔. 構菌，海漆和蒙桑化學成分及生物活性研究[D]，北京沖國協和醫科大學，2006. ) 0中國專利申請031323 . 3《富鍺金針菇多糖及其制法和用途》，200610036622. 5 《一種高活性金針菇多糖-肽-Fe2+鰲合物及其制備方法》，200810222271. 6《一種金針菇提取物及其獲得方法與應用》以及200910010576. 5《重組金針菇免疫調節蛋白的制備方法及應用》涉及了金針菇功效及用途，但都是關于金針菇中蛋白質或多糖類物質，未涉及可皂化類成分。經查閱國內外文獻，有關金針菇可皂化成分的研究較少，特別是在抗腫瘤藥用方面，目前尚未見到有關金針菇可皂化成分抗腫瘤作用研究與應用方面的報道。
發明內容
本發明的目的之一是，提供一種金針菇抗腫瘤可皂化提取物及其制備方法。本發明的目的之二是，提供一種以所述可皂化提取物為有效成分的藥物組合物。本發明的目的之三是，提供所述可皂化提取物在制備抗腫瘤及相關藥物中的應用。本發明的技術方案如下
一種金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物，它是金針菇子實體經醇溶液提取，濃縮提取液，用水分散后用低極性非質子有機溶劑萃取，回收低極性非質子溶劑后，加堿的醇溶液進行皂化，皂化液回收醇溶劑后加水分散，經低極性非質子有機溶劑萃取，經低極性非質子有機溶劑萃取后的皂化液用鹽酸酸化至PH=1_2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取， 萃取液回收溶劑后得到的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。一種制備上述金針菇具有抗腫瘤作用的可皂化提取物的方法，它包括如下步驟 步驟1.將金針菇子實體粉碎后用70%-95%的乙醇回流提取，冷卻，過濾，濃縮提取液
得浸膏；
步驟2.將步驟1的浸膏加水分散，用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液蒸餾回收溶劑后，加堿的乙醇溶液加熱回流皂化，冷卻；
步驟3.將步驟2的皂化液蒸餾回收乙醇，加水后用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取后的皂化液加鹽酸酸化至pH=l_2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液回收溶劑后即得金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。具體的操作可以是一種制備上述金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物的方法，它包括如下步驟 步驟1.將金針菇的子實體粉碎，用生藥量1 10倍的70%_95%的乙醇溶液提取三次， 合并提取液，回收溶劑得浸膏；
步驟2.浸膏加水分散，用1 10倍體積的低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液蒸餾回收溶劑后，加濃度為lmol/L的堿的乙醇溶液加熱回流進行皂化；
步驟3.皂化液回收乙醇后加水分散，經1 10倍體積的低極性非質子有機溶劑萃取， 萃取后的皂化液用鹽酸酸化至PH=I 2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液回收溶劑后即得金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。；
上述的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物的方法，所述的低極性非質子有機溶劑是乙醚或乙酸乙酯。本發明所述的皂化反應是指堿催化下的酯水解反應，尤指油脂的水解。本發明進一步提供了金針菇中可皂化提取物在制備治療抗腫瘤藥物中的應用。 以抑制人肝癌細胞(ifepG2)、人胃腺癌細胞(SGC)、人膠質瘤細胞(U251)、人肺腺癌細胞 (AM9)、人宮頸癌細胞(HeLa)和人結腸癌細胞(Lovo)增殖能力為活性指標進行抗腫瘤活性實驗。實驗結果表明，當藥物濃度為100 μ g ^171或者125 μ g ^171,時間從M h延長至72 h時，可皂化提取物對腫瘤細胞的抑制率越來越高，72 h時達到最大值，抑制率分別為 68. 49% (H印G2)、71. 40% (SGC),61. 57% (U251)、76· 87% (Α549)、0· 31% (HeLa)和 44.20% (Lovo)ο藥物對H印G2、SGC、U251和ΑΜ9的增殖抑制率強于HeLa和Lovo。有益效果
1、本發明的優點和效果在于采用溶劑提取、萃取等常規方法，從金針菇中提取得到了新的具有抗腫瘤作用的有效組合物一可皂化提取物，該有效組合物經實驗證明具有體外抑制H印G2、SGC、U251和A549腫瘤細胞生長的活性。2、本發明拓展了抗腫瘤藥物的原料渠道，擴大了金針菇的用途，使金針菇從普通食品發展成為抗腫瘤藥物的新原料，可顯著提高金針菇的附加值；同時，為從食用菌中篩選發現新的抗腫瘤藥物提供了新思路。
具體實施例方式
以下所列實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。實施例1金針菇可皂化提取物的制備
將鮮金針菇子實體5000 g粉碎，用95%乙醇回流提取2小時，乙醇量為金針菇重量的 3倍，過濾后的殘渣重復提取1次，過濾，合并二次乙醇提取液34 L，回收乙醇至近無醇味， 繼續濃縮至600 ml，加等體積的乙醚萃取4次，合并乙醚萃取液MOO ml，無水硫酸鈉脫水干燥，回收乙醚，約得乙醚提取物10 g。乙醚提取物加入1.0 mol/L氫氧化鉀的95%乙醇溶液，攪拌加熱回流，皂化液除去乙醇后加適量蒸餾水稀釋，用乙醚萃取不皂化物4 5次；用濃鹽酸將萃取不皂化物后的水相皂化液調至PH=I 2，用乙醚萃取可皂化物3 4次，合并乙醚提取液，經蒸餾水洗至中性，無水硫酸鈉脫水后，過濾，回收乙醚即得可皂化提取物20 mg0實施例2金針菇可皂化提取物的制備將鮮金針菇子實體50°C下鼓風烘干，粉碎，用70%乙醇回流提取2小時，乙醇量為金針菇重量的10倍，過濾后的殘渣重復提取1次，合并乙醇提取液；回收乙醇，加乙醚萃取4次， 合并乙醚萃取液，無水硫酸鈉脫水干燥，回收乙醚，即得乙醚提取物。乙醚提取物加入1. 0 mol/L氫氧化鉀的95%乙醇溶液，攪拌加熱回流，皂化液除去乙醇后加適量蒸餾水稀釋，用乙醚萃取不皂化物4 5次；用濃鹽酸將萃取不皂化物后的水相皂化液調至pH=l 2，用乙醚萃取可皂化物3 4次，合并乙醚提取液，經蒸餾水洗至中性，無水硫酸鈉脫水后，過濾， 回收乙醚即得可皂化提取物。
實施例3抗腫瘤活性實驗
以實施例1或實施例2得到的金針菇不皂化提取物為受試藥物，體外培養人肝癌細胞 H印G2，取指數生長期的細胞，用胰酶消化后，1500 r · mirT1離心5 min，將細胞重懸于培養基中，細胞濃度調至為2 X IO4個/mL，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μ L，放置細胞培養箱(37°C，5%C02)中培養M h。之后加入受試藥物20 μ L，陰性對照組加入終濃度為0. 5%DMS0，各組均設3個復孔。分別在加藥24 h,48h,72 h后，每孔加入5 mg ‘ mL^MTT 試劑20 μ L，繼續置于37°C培養4 h。每孔加入DMSO 100 μ L，振蕩混勻，測定各孔在波長 570 nm處的吸光度值。計算細胞增殖抑制率抑制率(％) = (1_實驗組吸光度/對照組吸光度)X 100%。其結果見表1.
表1金針菇可皂化提取物抗腫瘤活性實驗(IfepG2)
權利要求
1.一種金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物，其特征是它是金針菇子實體經醇溶液提取，濃縮提取液，用水分散后用低極性非質子有機溶劑萃取，回收低極性非質子溶劑后，加堿的醇溶液進行皂化，皂化液回收醇溶劑后加水分散，經低極性非質子有機溶劑萃取，經低極性非質子有機溶劑萃取后的皂化液用鹽酸酸化至pH=l-2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液回收溶劑后得到的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。
2.一種制備權利要求1所述的金針菇具有抗腫瘤作用的可皂化提取物的方法，其特征是它包括如下步驟步驟1.將金針菇子實體粉碎后用70%-95%的乙醇回流提取，冷卻，過濾，濃縮提取液得浸膏；步驟2.將步驟1的浸膏加水分散，用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液蒸餾回收溶劑后，加堿的乙醇溶液加熱回流皂化，冷卻；步驟3.將步驟2的皂化液蒸餾回收乙醇，加水后用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取后的皂化液加鹽酸酸化至PH=1_2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液回收溶劑后即得金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。
3.根據權利要求2所述的制備金針菇具有抗腫瘤作用的可皂化提取物的方法，其特征是所述的低極性非質子有機溶劑是乙醚或乙酸乙酯。
4.權利要求1所述的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用。
5.根據權利要求4所述的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征是所述的抗腫瘤藥物是抑制人肝癌細胞HepG2藥物、抑制人胃腺癌細胞SGC藥物、抑制人膠質瘤細胞U251藥物、抑制人肺腺癌細胞A549藥物、抑制人宮頸癌細胞HeLa藥物或抑制人結腸癌細胞Lovo藥物。
全文摘要
一種金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物，它是金針菇子實體經醇溶液提取，濃縮提取液，用水分散后用低極性非質子有機溶劑萃取，回收低極性非質子溶劑后，加堿的醇溶液進行皂化，皂化液回收醇溶劑后加水分散，經低極性非質子有機溶劑萃取，經低極性非質子有機溶劑萃取后的皂化液用鹽酸酸化至pH=1-2，再次用低極性非質子有機溶劑萃取，萃取液回收溶劑后得到的金針菇中具有抗腫瘤作用的可皂化提取物。該提取物具有體外抑制HepG2、SGC、U251和A549腫瘤細胞生長的活性。本發明公開了其制法。
文檔編號A61P35/00GK102441012SQ201110361029
公開日2012年5月9日 申請日期2011年11月15日 優先權日2011年11月15日
發明者余江南, 屈睿, 徐希明, 易承學, 曹霞 申請人:江蘇大學