專利名稱：含引導肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白和核酸及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程領域。具體為一種新的融合蛋白及其在藥物中的應用。本發明公開了一種通過引入肽段(優選蛋白質轉導域(PTD))，提高了免疫毒素(人促黃體激素釋放激素-綠膿桿菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL))細胞殺傷活性，該肽段定位于人促黃體激素釋放激素(GnRH)的C端和綠膿桿菌外毒素A衍生物(PE39KDEL)的N端并和GnRH、 PE39KDEL組成一種新的融合蛋白，以及編碼該融合蛋白編碼的核苷酸序列，含有所述序列的表達載體和含有這種表達載體的宿主細胞以及作為免疫毒素在抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
目前癌癥的治療仍然是一個世界難題，人們應用的主要的治療手段仍然是手術， 放療和化療，傳統的治療法在帶來療效的同時，副作用也往往很大，并且對于復發的腫瘤治療效果更加有限。最早在20世紀初，Ehrilich等就提出免疫毒素(Immunotoxins, ITs)的概念。是一種專門設計用于選擇性破壞具有某一特異性標記細胞的一類融合蛋白，通常由具有高度特異的單克隆抗體與具有強大殺傷作用的毒素分子通過化學交聯構建而成。免疫毒素是由具有催化作用的毒素和有適當導向作用的細胞因子、短肽激素或者抗體構建的具有藥理活性的生物制劑，主要應用于腫瘤的導向治療。免疫毒素克服了傳統治療腫瘤的化療和放療方法的缺陷。它既具有特異性的識別功能，又具有毒素的殺傷功能。研究表明，免疫毒素在細胞培養水平有很好的選擇性結合與殺傷腫瘤細胞作用，主要應用于腫瘤的導向治療，是一種有望代替化療的新的治療手段。免疫毒素是達到導向治療的一個重要的發展方向，通過特異性抗體或細胞因子、激素等與毒素連接，前者作為導向部分，即配體，可以引導分子到達腫瘤部位并與腫瘤細胞表面的過量表達的該種受體結合，后者作為毒素部分，即殺滅腫瘤細胞的部分。部分免疫毒素，如0VB3 — PE、IgG — HD37 — dgA、 IgG — RFB4 — dgA、B3—PE40、LHRH — PE40 等已進入臨床觀察，DAB389— IL一2 (商品名為 0NTAC)已通過FDA批準上市，顯示良好的療效。目前以GnRH或其衍生物為導向部分，以PE 毒素的截短形式及其衍生物為毒素部分的靶向治療劑已經有報道(中國專利應用嵌合毒素診斷癌癥的方法，99806580. 3 ;中國專利一種能特異殺死腫瘤細胞的基因工程重組蛋白；03137587. I ;高效低毒的系列功能蛋白，200410033621. 6 ;高細胞毒性靶向融合蛋白 200710301316 GnRH與PE衍生物組成的融合蛋白GnRH_PE39KDEL，其與目前的同類靶向藥物相比，具有更高的靶向細胞毒性活性，從而在腫瘤的治療方面有潛在的應用價值。)，這些融合蛋白的靶向型已得到廣泛驗證，能特異性地識別目的細胞并將其殺死，但目前在應用中還存在一個很大的問題，那就是由于實體瘤的結構問題，如對靶組織的特異性殺傷作用較弱，尤其對大型實體瘤的浸潤性較差，在體內的免疫反應嚴重，所以如何增強靶向毒性蛋白中PE部分的細胞毒性，研制出只殺死相關病理有關的免疫毒素就成為關鍵。而通過增強免疫毒素對腫瘤細胞的穿透性勢必能增強其毒性。蛋白質轉導域(proteintransductiondomain,PTD)或 Trojanhorsepeptides,可以有效地將蛋白、多肽、核酸片段通過無受體介導、無耗能的方式，導入多種哺乳動物細胞，
3且在一定濃度范圍內不會造成細胞損傷。在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、臨床藥效評價及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景。細胞穿膜肽有天然存在和人工合成兩大類，細胞穿膜肽的研究始于1988年，Green和Frankel分別證實HIV-I的反式激活蛋白Tat能跨膜轉移入細胞質和細胞核內。1997年，Vives等發現HIV-TAT中一個富含堿性氨基酸、帶正電荷的多肽片斷與蛋白轉導功能密切相關天然存在的CPPs。目前已經發現的有三種，分別來自果蠅同源異型域ANTP、單純皰疹病毒I型(HSV-I) VP22轉錄因子以及 HIV-I和SIV (2，3)的Tat。這些細胞穿膜肽均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基。利用這一特性，人工合成的多聚精氨酸、賴氨酸，也具有穿膜活性，且9個精氨酸和9個賴氨酸殘基構成的基序比TatPTD的蛋白轉導活性還要強。
發明內容
為了提供一種新的應用于腫瘤的導向治療藥物的融合蛋白，本發明選用一種胞質轉導肽，可以有效地介導外源物質進入細胞的胞質當中，與其他蛋白的融合表達產物能夠高效地進入體外培養的細胞，并且表現出生物學活性。具有更強的介導外源物質進入細胞的能力，胞質轉導肽融合蛋白的作用具有速度快、溫度適應性廣、濃度依賴性、能夠摻入所有細胞等特點。胞質轉導肽融合分子穿越細胞膜而不損傷細胞，被胞質轉導肽帶入細胞的分子仍保留其原有的性質。無活性的分子進入細胞后也能重新折疊，自我復性，是基因工程藥物經濟、高效利用的有利途徑。用胞質轉導肽融合蛋白進行介導方法簡單，轉導的效率高，反應條件也不嚴格，而且它轉導的蛋白質在細胞內部仍具有活性。融合蛋白的轉導使藥物的用量顯著下降，副作用明顯減少，是其它方法所無法比擬的。本發明所述的融合蛋白為含人促黃體激素釋放激素(GnRH)和綠膿桿菌外毒素A 衍生物(PE39KDEL)以及肽載體(蛋白質轉導域(PTD)的融合蛋白。其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。本發明用大腸桿菌表達系統高效表達含蛋白轉導域(PTD)和免疫毒素GnRH -PE39KDEL融合蛋白，蛋白轉導域(PTD)定位于融合蛋白GnRH的C端和PE39KDEL的N端之間并在此融合蛋白的N端引入了 6個His標簽和Factor Xa蛋白酶切位點，表達后的產物是含有6個His標簽和GnRH-PTD-PE39KDEL的前體融合蛋白，Factor Xa蛋白酶可以將融合蛋白專一性的切割產生具有天然N端得目的蛋白，Factor Xa蛋白酶酶切后直接得到GnRH-PTD-PE39KDEL,從而使生產、純化工藝簡化。最終我們得到的高活性的靶向融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL,作用原理是首先重組蛋白的GnRH部分與腫瘤細胞的GnRH受體結合，結合后由PTD介導將融合蛋白轉送至細胞的內質網，由融合蛋白的毒素部分作用于延長因子2使之核糖基化，阻斷蛋白合成殺死細胞。由于增加了 PTD蛋白轉導域可以增強跨越細胞膜的能力，所以可以大大增強融合蛋白在實體瘤中浸潤性，在腫瘤治療方面有將有很高的應用價值。本發明提供了高效表達含兩種不同抑菌機制的抗菌肽融合蛋白的表達質粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL,其包N端有6個His標簽，序列中有Factor Xa蛋白酶切位點，有利于表達純化。本發明提供的宿主細胞是萬.BL21(DE3) plysS，具有氯霉素抗性。
本發明提供表達融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL的工程菌株為大腸埃希氏菌{Escherichia co7i ) GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-His,是由表達質粒 pET-His~GnRH-PTD_PE39KDEL 轉化 E. coli BL21(DE3) plysS細胞獲得的最高表達量的菌株。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為OGMCC No. 5357，保藏時間為2011年10月17日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。本發明提供了使用Factor Xa蛋白酶切割法制備GnRH-PTD_PE39KDEL的方法，并在此基礎上提供了完整的表達、分離純化GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白的方法。本發明所獲得的GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白可用于制備治療和預防腫瘤的藥物，特別是用于制備防治在腫瘤細胞表面過量表達促黃體激素釋放激素(GnRH)腫瘤的藥物。
圖I 重組質粒 pET-Hi S -GnRH-PTD-PE39KDEL 酶切電泳圖。M DL2000 DNA Marker (2000，1000，750，500，250，100) bp I 質粒 pET-His 酶切(腦H I BcoR I)。2 重組質粒 pET-His -GnRH-PTD_PE39KDEL 酶切 UasH I 和&oR I)。圖 2 SDS-PAGE 電泳分析 GnRH-PTD_PE39KDEL 表達。M 高分子量蛋白標準(116，66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD
I表達質粒pET-His在疋co7iBL21 (DE3)plysS細胞中的表達(空白對照)。2 表達質粒 pET-His -GnRH-PTD-PE39KDEL 在萬· co7iBL21(DE3)plysS 細胞中的表達。圖 3 SDS-PAGE 電泳檢測 GnRH-PTD_PE39KDEL。M 高分子量蛋白標準(I 16，66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD
I 表達質粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在萬.co7iBL21 (DE3) plysS 細胞中的表達后使用Ni柱純化的表達蛋白穿通液。2 表達質粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL在萬· co7iBL21 (DE3) plysS 細胞中的表達后使用Ni柱純化的表達蛋白清洗液。3 表達質粒 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 在萬.co7iBL21 (DE3) plysS 細胞中的表達后使用Ni柱純化后的洗脫液經Factor Xa蛋白酶切割后分離純化得到的 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白。
具體實施例方式實施例I GnRH-PTD-PE39KDEL融合蛋白基因序列的獲得
依據已知GnRH -PE39KDEL的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成GnRH -PE39KDEL基因序列(生工生物工程(上海)有限公司完成)，同時在相應于所編碼的氨基酸序列之N末端和C末端加上限制性酶切位點。應用PCR的方法對全基因合成PE39KDEL的基因序列進行操作，設計3條引物 MiddleCTDFl
5，TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCACTTCCCGGAAGGTGGMiddleCTDF2
5’ GGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACGCTGGTCGTCG GnRHR 5’ GAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG
在 GnRH -PE39KDEL 的 GnRH 的 C 端引入 PTD 序列，并在 GnRH_PTD_PE39KDEL 的 N 末端引入Factor Xa蛋白酶切割位點，得到編碼SEQ ID NO:2的融合蛋白的核酸序列SEQ ID NO: I。 實施例2
2. I GnRH-PTD-PE39KDEL基因重組質粒的構建
提取質粒pET-His，用及I和I雙酶切，回收2. 8 kb的線性質粒；
將所述步驟I中獲得的GnRH-PTD-PE39KDEL基因片段用漢·Η I和&oR I雙酶切，加入等體積的酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)抽提，3倍體積無水乙醇沉淀回收酶切片段； 將上述回收酶切產物片段，用T4 DNA連接酶進行連接，連接反應體系為25μ I :
權利要求
1.一種含引導肽和GnRH-PE39KDEL的融合蛋白，其特征是含人促黃體激素釋放激素 GnRH和綠膿桿菌外毒素A衍生物PE39KDEL以及肽載體-蛋白質轉導域PTD的融合蛋白。
2.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征是蛋白質轉導域PTD定位于人促黃體激素釋放激素GnRH的C端和綠膿桿菌外毒素A衍生物PE39KDEL的N端并直接相連和GnRH、 PE39KDEL組成的融合蛋白GnRH-PTD-PE39KDEL，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
3.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征是所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO. I所示。
4.如權利要求I所述的融合蛋白，其特征是在所述融合蛋白的N端引入6個組氨酸的標簽和Factor Xa蛋白酶切位點。
5.—種表達權利要求I所述的融合蛋白的工程菌株，為大腸埃希氏菌coli ) GnRH-PTD-PE39KDEL/pET-Hi s，是由表達質粒 pET_Hi s-GnRH-PTD_PE39KDEL 轉化 E. coli BL21 (DE3) plysS細胞獲得的最高表達量的菌株；該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No. 5357，保藏時間為2011年11月02 曰。
6.如權利要求I所述的融合蛋白的應用，其特征是用于制備治療和預防腫瘤的藥物。
全文摘要
本發明公開了一種通過引入肽段(優選蛋白質轉導域(PTD))，提高了免疫毒素人促黃體激素釋放激素-綠膿桿菌外毒素A衍生物(GnRH-PE39KDEL)細胞殺傷活性，該肽段定位于人促黃體激素釋放激素(GnRH)的C端和綠膿桿菌外毒素A衍生物(PE39KDEL)的N端并和GnRH、PE39KDEL組成一種新的融合蛋白，編碼該融合蛋白編碼的核苷酸序列，以及含有所述序列的表達載體和含有這種表達載體的宿主細胞以及作為免疫毒素在抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號A61K47/48GK102603897SQ20111040586
公開日2012年7月25日 申請日期2011年12月8日 優先權日2011年12月8日
發明者扈進冬, 李紀順, 楊合同, 郭凱, 魏艷麗 申請人:山東省科學院生物研究所