專利名稱：神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物、其主動靶向脂質體載體系統及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物、其主動靶向脂質體載體系統及其制備方法。
背景技術：
前列腺癌是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤，發病隨年齡而增長，其發病率有明顯的地區差異，歐美地區較高。據報道僅次于肺癌，在男性是癌癥死亡的第二位。隨著人口老齡化程度的增加，近年來中國男性發病率呈明顯增加趨勢1993年中國前列腺癌發病率為每年每10萬人中1. 71個病人，至2000年已上升到了 4. 55人。由于我國對前列腺癌的認識和重視不夠，且早起前列腺癌沒有任何癥狀，不易引起人們的注意，所以我國發現的前列腺癌大多是晚期病例，已經發生淋巴轉移或者血道轉移，形成轉移灶。對前列腺癌晚期患者，手術治療已難以取得較好治療效果，所以一般采取擴大范圍體外放療或化療手段，但這兩種治療手段全身毒副作用大，常規化療對病灶部位無靶向效果，治療效果不佳。因此，對前列腺癌進行靶向治療具有重要的臨床現實意義。
在所有納米遞藥系統中，由于脂質體膜材與細胞膜組成相同，其生物安全性問題較小，而且由于其易制備、易修飾、易控制粒徑、載藥量高、易工業化生產等優點，脂質體是臨床應用最多的納米載藥系統。目前已有阿霉素脂質體、柔紅霉素脂質體和兩性霉素B脂質體等產品上市，主要用于腫瘤或真菌感染的靶向治療。現有的脂質體絕大部分是基于被動靶向發揮作用，靶向效率較低。基于多肽介導的腫瘤主動靶向脂質體遞藥系統因對腫瘤表現出優越的靶向性和生長抑制作用而逐漸成為納米遞藥系統和腫瘤治療領域的研究熱點。但目前腫瘤主動靶向遞藥系統從其靜脈給藥到與腫瘤細胞發生接合的過程中，仍受到兩大屏障的制約——腫瘤血管屏障和腫瘤實質屏障，此問題已受到研究者的普遍關注。有研究者通過多肽篩選技術篩選出一些具有穿透腫瘤血管和腫瘤實質能力的靶向分子，將其用于介導藥物分子或者納米遞藥系統進入腫瘤組織，取得了很好的效果，但未見用于脂質體遞藥系統靶向遞藥的報道。此類多肽及其修飾的脂質體的生物安全性評價也未見文獻報道，這也是所有腫瘤主動靶向脂質體遞藥系統臨床應用的共性問題。發明內容
本發明的目的之一在于提供一種神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物。
本發明的目的之二在于提供一種含復合物的主動靶向脂質體載體系統。
本發明的目的之三在于提供該脂質體載體系統的制備方法。
為達到上述目的，本發明采用如下技術方案一種神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征在于該復合物由神經氈蛋白-ι配體多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其中神經氈蛋白-1配體多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1，所述的神經氈蛋白-1配體多肽的氨基酸序列為RPAKPAR。
上述的聚乙二醇的重均分子量可以為400 8000。
上述的聚乙二醇重均分子量可以為200(Γ5000。
上述的磷脂可以為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
一種主動靶向脂質體載體系統，含有上述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征在于該載體系統的組成為a.磷脂；b.膽固醇；c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物；d.神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物；上述各成分之間的摩爾比為a:b=5:l 1:5，a:c=1000:l 1000:100， a:d=1000:0. 1 1000:100。
上述的組分a所述的磷脂為蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、 二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1_棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、I"棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物中的磷脂可以為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量可以為 400 6000。
一種制備上述的主動靶向脂質體載體系統的方法，其特征在于該方法的具體步驟為分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質膜，真空干燥；再加入0. 155M的硫酸銨溶液，在20-70°C水浴中震蕩得到脂質體混懸液；再于20-70°C水浴中依次擠壓過400、 200,100和50nm核孔膜，得空白脂質體，即為含有神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物的主動靶向脂質體載體系統。
上述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物的制備方法的具體步驟為a.將取代度為0. 6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸(對甲苯磺酰基)_對乙酰氨基芐酯 Boc-Arg (Tos)-PAM樹脂用N，N-二甲基甲酰胺DMF溶脹，抽干；再用三氟乙酸TFA脫去Boc保護基，抽去TFA;b.用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽HBTU的DMF溶液和N，N- 二異丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；c.將步驟a所得樹脂用DMF洗滌后加入步驟b所得的Boc-Ala活化液，25°C振搖反應 25分鐘，抽去反應液，并用DMF洗滌樹脂；d.重復步驟a_c，按CRPAKPAR序列順次連接其余氨基酸；反應結束后洗滌樹脂、TFA 脫保護基，真空干燥；e.將步驟e所得的樹脂放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應1小時；反應結束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀；沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液；濾液再于冰乙醚中沉淀，過濾，濾渣以水復溶，凍干得CRPAKPAR純品；f.將步驟e得到的CRPAKPAR溶于pH7.O的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，攪拌反應至Mal-PEG-DSPE反應完全，去除過量的CRPAKPAR 和DMF，冷凍干燥，得到直鏈的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物。
RPAKPAR是一種通過噬菌體展示技術篩選得到的直鏈七肽，是神經氈蛋白-1的配體。研究表明神經氈蛋白-1在前列腺癌腫瘤細胞及腫瘤血管內皮細胞表面有高表達，而在正常組織無表達或低表達。RPAKPAR對神經氈蛋白-1高表達的腫瘤細胞和腫瘤血管表現出特異親和性，且具有介導噬菌體穿透腫瘤血管進入腫瘤組織內部的能力。目前尚未見利用 RPAKPAR多肽介導納米遞藥系統用于前列腺癌及其轉移灶靶向治療的報道。
含RPAKPAR序列的多肽通過固相合成法合成，HPLC (高效液相色譜法)和MS (質譜法)表征其結構。
含RPAKPAR序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，通過以下方式合成含 RPAKPAR序列的多肽提供一個游離巰基，聚乙二醇-磷脂提供一個馬來酰亞胺基，兩者發生特異性反應而連接成共價復合物，合成之后通過核磁共振(NMR)表征其結構。
脂質體采用旋轉蒸發-薄膜水化-擠壓過膜法制備。將一定比例的a、b、C、d溶于氯仿，采用旋轉蒸發-薄膜水化法制備RPAKPAR修飾的脂質體(RPAKPAR-脂質體)，用擠壓過膜的方法減小脂質體粒徑，得到脂質體。激光散射法測定粒徑分布。其平均粒徑為 30 1000nm。
本發明通過熒光示蹤脂質體，考查腫瘤細胞分別對載羧基熒光素(FAM)的 RPAKPAR-脂質體和普通脂質體的攝取，結果證實RPAKPAR在體外能介導脂質體進入腫瘤細胞。
通過以阿霉素為模型藥物，考察了 RPAKPAR-脂質體/DOX對PC_3前列腺癌細胞的體外生長抑制作用和體內對前列腺癌的腫瘤生長抑制作用，表明RPAKPAR的修飾能顯著增加阿霉素脂質體對前列腺癌細胞和腫瘤組織的生長抑制作用。
研究結果提示，本發明制備的含有RPAKPAR序列的多肽修飾的主動靶向脂質體載體系統的可用于靶向前列腺癌及其轉移灶。該系統可通過皮下組織間隙注射或肌肉注射將脂質體被動引流至淋巴系統內，通過RPAKPAR的介導作用靶向至淋巴轉移病灶。該系統也可直接通過靜脈注射給藥，通過腫瘤EI3R效應和RPAKPAR介導作用將其靶向至原發腫瘤和血道轉移病灶。此脂質體載體系統可用作前列腺癌原發腫瘤和轉移腫瘤診斷或治療的藥物6靶向遞送。
圖 1 為 CRPAKPAR 的 HPLC 圖譜色譜方法色譜柱Diamonsil C18 5ym 200X4. 6mm 迪馬；流動相 A :0. 1%TFA H2O ； 流動相 B:0. 1%TFA 乙腈；洗脫程序0_2min 5%B，2 32min 5%_65%B，32 33min 65% 90%B， 33 36min 90%B ；波長UV214nm ；流速0. 7ml/min ；柱溫40°C ； 圖2為CRPAKPAR的質譜圖； 圖 3 為 RPAKPAR-PEG-DSPE 的 -NMR 圖譜； 圖4為RPAKPAR-脂質體/FAM和脂質體/FAM粒徑分布圖； 圖5為RPAKPAR-脂質體/FAM和脂質體/FAM被PC-3腫瘤細胞攝取照片； 圖6為RPAKPAR-脂質體/DOX和脂質體/DOX對PC-3前列腺癌腫瘤細胞體外生長抑制效果。
具體實施方式
通過下述實施例將有助于進一步理解本發明，但并不限制本發明的內容。
實施例1 CRPAKPAR的合成、純化和表征稱取Boc-Arg(Z)-PAM樹脂0.4167g (取代度0. 6mmol/g)于接肽瓶中，樹脂用DMF (N，N-二甲基甲酰胺)溶脹，二十分鐘后，抽干。加入約兩倍樹脂體積的TFA (三氟乙酸)攪拌反應，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脫去Boc保護基。用HBTU (苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽)的DMF溶液和DIEA (N, N- 二異丙基乙胺)活化 Boc-Ala,樹脂用DMF洗滌后加入Boc-Ala活化液，振搖反應。反應結束后抽去反應液，并用 DMF洗滌樹脂。隨后以上述方法按CRPAKPAR序列順次連接其余氨基酸。反應結束后按前述方法洗滌樹脂、TFA脫保護基。依次用DMF、DCM/MeOH (二氯甲烷/甲醇，1/1，ν/ν)洗滌樹脂，真空干燥。
將樹脂放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應1小時。反應結束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液。濾液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗過濾，棄濾液，以水復溶沉淀，凍干得CRPAKPAR純品，以HPLC及MS對其進行表征，參見圖1和圖2，由質譜結果計算得其分子量為898. 10與理論分子量相符合。結果表明CRPAKPAR合成成功。
實施例2 :RPAKPAR-PEG335O-DSPE的合成、純化和表征將上述步驟得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(ρΗ7. 0)，取Mal-PEG335tl-DSPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇(分子量3350)-磷脂復合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應，TLC (薄層層析法)監測反應，待Mal-PEG335ci-DSPE反應完全后停止反應，過量的CRPAKPAR和DMF通過透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷凍干燥，得到直鏈的RPAKPAR-PEG335(1-DSPE，NMR表征其結構，參見圖3，圖中A為Mal-PEG335tl-DSPE的核磁圖譜，B為RPAKPAR-PEG335(1-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變， 顯示Mal-PEG335tl-DSPE中的馬來酰亞胺基團已與RPAKPAR反應。結果顯示，Mal-PEG335tl-DSPE 圖譜在6. 67ppm處顯示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG335(1-DSPE圖譜上此峰消失，說明RPAKPAR-PEG3350-DSPE 合成成功。
實施例3 :RPAKPAR-PEG335O-DPPE的合成、純化和表征將上述步驟得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(pH7. 0)，取Mal-PEG335tl-DPPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇(分子量3350)-磷脂復合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應，TLC (薄層層析法)監測反應，待Mal-PEG335ci-DPPE反應完全后停止反應，過量的CRPAKPAR和DMF通過透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷凍干燥，得到直鏈的RPAKPAR-PEG335(1-DPPE，NMR表征其結構，參見圖3，圖中A為Mal-PEG335tl-DPPE的核磁圖譜，B為RPAKPAR-PEG335(1-DPPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變， 顯示Mal-PEG335tl-DPPE中的馬來酰亞胺基團已與RPAKPAR反應。結果顯示，Mal-PEG335tl-DPPE 圖譜在6. 67ppm處顯示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG335(1-DPPE圖譜上此峰消失，說明 rpakpar-peg335o-dppe 合成成功。
實施例4 :RPAKPAR-PEG4500-DSPE的合成、純化和表征將上述步驟得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(pH7. 0)，取Mal-PEG45citl-DSPE (馬來酰亞胺-聚乙二醇(分子量4500)-磷脂復合物)溶于DMF，兩者混合后磁力攪拌反應，TLC (薄層層析法)監測反應，待Mal-PE(i45(1(1-DSPE反應完全后停止反應，過量的CRPAKPAR和DMF通過透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷凍干燥，得到直鏈的RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE，NMR表征其結構，參見圖3，圖中A為Mal-PEG45citl-DSPE的核磁圖譜，B為RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE的核磁圖譜，由圖可看出，A圖顯示出馬來酰亞胺峰，而B圖中該峰消失，而其余峰基本保持不變， 顯示Mal-PEG45citl-DSPE中的馬來酰亞胺基團已與RPAKPAR反應。結果顯示，Mal-PEG45citl-DSPE 圖譜在6. 67ppm處顯示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE圖譜上此峰消失，說明 rpakpar-peg4500-dspe 合成成功。
實施例5 :RPAKPAR-脂質體/FAM的制備和表征脂質體膜材料處方組成為HSPC (氫化大豆磷脂VChol (膽固醇)/mPEG_-DSPE(甲氧基聚乙二醇(分子量2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復合物)(55: 45: 2，mo 1/mo 1),RPAKPAR 修飾的 PEG 脂質體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPE(i2(l(l(l-DSPE/ RPAKPAR-PEG335(I-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉蒸發除去有機溶媒，得均勻脂質膜，真空干燥M小時。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震蕩2小時，得脂質體混懸液。 在60°C水浴中，使用高壓均質機(若脂質體體積少于10 mL則改用微型擠出器)依次將脂質體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的FAM，得脂質體。脂質體用動態光散射法測定粒徑， 顯示粒徑均約為90nm。
實施例6 :RPAKPAR-脂質體/FAM的制備和表征脂質體膜材料處方組成為DPPC (二棕櫚酰磷脂酰膽堿)/Chol (膽固醇)/ mPEG3000-DSPE (甲氧基聚乙二醇(分子量3000) - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺復合物)(55: 45: 2，mol/mol)，RPAKPAR 修飾的 PEG 月旨質體膜材料處方為 DPPC/Chol/mPE(i2_-DSPE/ RPAKPAR-PEG4500-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉蒸發除去有機溶媒，得均勻脂質膜，真空干燥M小時。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震蕩2小時，得脂質體混懸液。在60°C水浴中，使用高壓均質機(若脂質體體積少于10 mL 則改用微型擠出器)依次將脂質體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，使其粒徑減小。然后以生理鹽水為洗脫液過葡聚糖凝膠G-50層析柱分離除去未包封的FAM，得脂質體。脂質體用動態光散射法測定粒徑，顯示粒徑均約為80nm。
實施例7 :RPAKPAR-脂質體/DOX的制備和表征普通脂質體膜材料處方組成為HSPC/Chol/mPE(i2(1(1(1-DSPE(55:45:2, mol/mol)，RPAKPAR 修飾的脂質體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG2Q(l(l-DSPE/ RPAKPAR-PEG335(I-DSPE (55: 45: 2: 1，mol/mol)。分別稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉蒸發除去氯仿，得均勻脂質膜， 真空干燥Mh。加入一定體積的0. 155M硫酸銨溶液，60°C水浴震蕩2h，得脂質體混懸液。 在60°C水浴中，使用高壓均質機(若脂質體體積少于IOmL則改用微型擠出器)依次將脂質體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質體。以生理鹽水為洗脫劑，將空白脂質體洗脫通過kphadex G-50凝膠柱更換外水相。按照藥脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理鹽水溶液，60°C水浴20min。以生理鹽水洗脫通過kphadex G-50凝膠柱，除去游離藥物， 得阿霉素脂質體。用動態光散射法測定粒徑，參見圖4，脂質體/FAM和RPAKPAR-脂質體/ FAM粒徑分布圖，由圖可知，兩者粒徑大小及分布無顯著差異。顯示粒徑均約為90nm。
實施例8 :RPAKPAR-脂質體/DOX的制備和表征普通脂質體膜材料處方組成為HSPCX氧化大豆磷脂)/Chol(膽固醇)/mPE(i2_-D0PE(甲氧基聚乙二醇(分子量2000)- 二油酰基磷脂酰乙醇胺復合物)(55:45:2，mol/mol),RPAKPAR 修飾的脂質體膜材料處方為 HSPC/Chol/mPEG2(IQ(l-D0PE/ RPAKPAR-PEG335(l-D0PE (55: 45: 2: 1，mol/mol)。分別稱取上述膜材料溶于氯仿，減壓旋轉蒸發除去氯仿，得均勻脂質膜， 真空干燥Mh。加入一定體積的0. 155M硫酸銨溶液，60°C水浴震蕩2h，得脂質體混懸液。 在60°C水浴中，使用高壓均質機(若脂質體體積少于IOmL則改用微型擠出器)依次將脂質體擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質體。以生理鹽水為洗脫劑，將空白脂質體洗脫通過kphadex G-50凝膠柱更換外水相。按照藥脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理鹽水溶液，60°C水浴20min。以生理鹽水洗脫通過kphadex G-50凝膠柱，除去游離藥物， 得阿霉素脂質體。用動態光散射法測定粒徑，參見圖4，脂質體/FAM和RPAKPAR-脂質體/ FAM粒徑分布圖，由圖可知，兩者粒徑大小及分布無顯著差異。顯示粒徑均約為70nm。
實施例9 :RPAKPAR-脂質體體外腫瘤細胞靶向性驗證取對數生長期的單層培養PC-3細胞，用0. 25%胰蛋白酶和0. 025%乙二胺四乙酸二鈉消化單層培養細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養液配成單細胞懸液，以每孔1 X IO5個細胞接種于M孔培養板中，每孔體積1ml，將培養板移入二氧化碳培養箱中，37°C，5% 二氧化碳及飽和濕度條件下培養過夜，使細胞貼壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培養液配制一系列不同濃度的脂質體/FAM和RPAKPAR-脂質體/FAM溶液。將培養板中的培養液吸出，加入脂質體/FAM和RPAKPAR-脂質體/FAM的系列溶液，37°C孵育lh，吸棄上清液。用PBS溶液洗板兩次，在熒光顯微境下觀察細胞內化情況。參見圖5，RPAKPAR-脂質體/FAM (A)和脂質體/FAM (B)于37°C分別與PC-3細胞作用1小時后的熒光顯微照片，由圖可知，PC-3 細胞對RPAKPAR-脂質體/FAM的攝取量遠大于脂質體/FAM。結果顯示，脂質體/FAM不能被PC-3細胞攝取，而RPAKPAR-脂質體/FAM則被大量攝取，說明在RPAKPAR的介導作用下， RPAKPAR-脂質體對前列腺癌腫瘤細胞具有良好的體外靶向性。
實施例10 :RPAKPAR-脂質體/DOX對PC_3前列腺癌細胞的體外生長抑制作用采用MTT法測定RPAKPAR-脂質體/DOX和脂質體/DOX對腫瘤細胞的體外生長抑制作用。將處于對數生長期的PC-3細胞用0. 25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，細胞計數，96孔板中(corning，USA)每孔加入200μ1細胞懸液(2Χ 103cells)，留出三孔加不含細胞的培養液作為空白孔，貼壁Mh。用細胞培養液將脂質體/DOX和RPAKPAR-脂質體/DOX稀釋至DOX 濃度為6. 25ηΜ^102. 4μΜ，吸去96孔板內細胞培液，各孔加入200μ1 —系列濃度的脂質體藥液。每個濃度均設三復孔，留出三個僅加入培養液的孔作為對照孔，培養72h。用細胞培液配置MTT，濃度為0. 2mg/ml，吸去96孔板的藥液，每孔加入MTT溶液200μ1，37°C培養4h，小心吸去液體，每孔加入150μ1 DMS0，水浴振蕩lOmin，酶標儀(Bio-TEK)檢測吸光度(檢測波長570nm)，以下列公式計算細胞存活率，細胞存活率=(A^-Ase)/ (Aw-Ase)并根據存活率計算得到脂質體/DOX和RPAKPAR-脂質體/DOX體外抗PC-3細胞的IC5tl 值分別為1. 38 X IO4M和1. 66 X IO^5M, RPAKPAR的修飾使阿霉素脂質體的IC5tl值降低了 8. 3 倍，顯著增加了阿霉素脂質體體外抗前列腺癌細胞生長作用。
實施例11 :RPAKPAR-脂質體/DOX對前列腺癌腫瘤組織的的體內生長抑制作用將處于對數生長期的PC-3細胞胰酶消化，PBS洗滌，分散于PBS中，以1 X IO7細胞 (ΙΟΟμΙ)濃度皮下注射接種于裸鼠右側肩胛骨部位，SPF環境下飼養。將M只已形成PC-3 皮下腫瘤的裸鼠隨機分為4組(每組6只)，分別設為N. S.，D0X,脂質體/DOX和RPAKPAR-脂質體/DOX組。將ΙΟΟμΙ相應的制劑分別在接種后第15、20、25天經足墊組織間隙注射到裸鼠體內，阿霉素的總劑量為10mg/kg。在接種后30天，將裸鼠處死，取出皮下腫瘤塊，稱重并測量體積和重量。體積由以下公式計算得到 V (mm3) = (d2 X D) / 2其中d和D分別為淋巴結的短徑和長徑，單位為mm。參見圖6，RPAKPAR的修飾顯著增加了阿霉素脂質體對PC-3前列腺癌腫瘤細胞的體外生長抑制效果，結果顯示與脂質體/ DOX相比，RPAKPAR-脂質體/DOX對腫瘤生長抑制作用顯著增強。
權利要求
1.一種神經氈蛋白-ι配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征在于該復合物由神經氈蛋白-1配體多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通過共價連接而成的線性嵌段共聚物，其中神經氈蛋白-1配體多肽、聚乙二醇和磷脂的摩爾比為1:1:1，所述的神經氈蛋白-1配體多肽的氨基酸序列為RPAKPAR。
2.根據權利要求1所述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征是所述的聚乙二醇的重均分子量為40(Γ8000。
3.根據權利要求2所述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征是所述的聚乙二醇重均分子量為200(Γ5000。
4.根據權利要求1所述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征是所述的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
5.一種主動靶向脂質體載體系統，含有根據權利要求1、2、3或4所述的神經氈蛋白-1 配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物，其特征在于該載體系統的組成為a.磷脂；b.膽固醇；c.甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物；d.神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物；上述各成分之間的摩爾比為a:b=5:l 1:5，a:c=1000:l 1000:100， a:d=1000:0. 1 1000:100。
6.根據權利要求5所述的主動靶向脂質體載體系統，其特征是組分a所述的磷脂為 蛋磷脂、氫化大豆磷脂酰膽堿、氫化蛋磷脂酰膽堿、二月桂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、1-肉豆蔻酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、 1-棕櫚酰-2-硬脂酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿、1-棕櫚酰-2-油酰磷脂酰膽堿、1-硬脂酰-2-亞油酰磷脂酰膽堿、二油酰磷脂酰膽堿、氫化二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二棕櫚酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、腦磷脂酰絲氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸、二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕櫚酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、腦鞘磷脂、二棕櫚酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
7.根據權利要求5所述的主動靶向脂質體載體系統，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物中的磷脂為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
8.根據權利要求5所述的主動靶向脂質體載體系統，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量為400飛000。
9.一種制備根據權利要求5、6、7或8所述的主動靶向脂質體載體系統的方法，其特征在于該方法的具體步驟為分別稱取上述各組分溶于氯仿中制備得到均勻脂質膜，真空干燥；再加入0. 155M的硫酸銨溶液，在20-70°C水浴中震蕩得到脂質體混懸液；再于20_70°C 水浴中依次擠壓過400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂質體，即為含有神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物的主動靶向脂質體載體系統。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物的制備方法的具體步驟為a.將取代度為0.6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸(對甲苯磺酰基)_對乙酰氨基芐酯 Boc-Arg (Tos)-PAM樹脂用N，N-二甲基甲酰胺DMF溶脹，抽干；再用三氟乙酸TFA脫去Boc 保護基，抽去TFA;b.用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸鹽HBTU的DMF溶液和N，N- 二異丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；c.將步驟a所得樹脂用DMF洗滌后加入步驟b所得的Boc-Ala活化液，25°C振搖反應 25分鐘，抽去反應液，并用DMF洗滌樹脂；d.重復步驟a_c，按CRPAKPAR序列順次連接其余氨基酸；反應結束后洗滌樹脂、TFA 脫保護基，真空干燥；e.將步驟d所得的樹脂放入多肽切割管中，加入適量P-cresol，然后通入HF，冰浴攪拌反應1小時；反應結束后減壓抽去管中HF，殘液用適量冰乙醚沉淀，過濾得沉淀并用冰乙醚洗滌沉淀；沉淀重新用TFA溶解，過濾得濾液；濾液再于冰乙醚中沉淀，過濾，濾渣以水復溶，凍干得CRPAKPAR純品；f.將步驟e得到的CRPAKPAR溶于pH7.O的PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，攪拌反應至Mal-PEG-DSPE反應完全，去除過量的CRPAKPAR 和DMF，冷凍干燥，得到直鏈的神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物。
全文摘要
本發明涉及一種神經氈蛋白-1配體多肽-聚乙二醇-磷脂復合物、其主動靶向脂質體載體系統及其制備方法。脂質體載體系統的成分為a磷脂，和b膽固醇，和c甲氧基聚乙二醇-磷脂復合物(甲氧基聚乙二醇的分子量為400~6000)，和d含RPAKPAR序列的多肽-聚乙二醇-磷脂復合物(聚乙二醇的分子量為400~8000)。各成分之間的摩爾比為a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1~1000:100。該系統可通過皮下組織間隙注射或肌肉注射將脂質體被動引流至淋巴系統內，通過RPAKPAR的介導作用靶向至淋巴轉移病灶。該系統也可直接通過靜脈注射給藥，通過腫瘤EPR效應和RPAKPAR介導作用將其靶向至原發腫瘤和血道轉移病灶。此脂質體載體系統可用作前列腺癌原發腫瘤和轉移腫瘤診斷或治療的藥物靶向遞送。
文檔編號A61P35/00GK102516391SQ20111043759
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月23日 優先權日2011年12月23日
發明者何丹農, 楊一祎, 金彩虹, 鐘建, 閆志強, 陳玉云, 魏岱旭 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司