專利名稱：蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及到蕓香苷的用途，尤其涉及作為酪氨酸酶抑制劑的應用。
背景技術：
酪氨酸酶(EC I. 14. 18. I, Tyrosinase)是一種含銅的金屬酶,廣泛分布于微生物、動植物及人體中。酪氨酸酶是皮膚色素合成中具有多重催化功能的重要的酶，該酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過程中起關鍵作用，是黑色素合成過程的限速酶。酪氨酸酶屬于第三類銅蛋白家族(I. Yoon J, Fujii S, Solomon EI. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Apr 21 ；106(16) :6585-6590 ;2· Li Y, Wang Y, Jiang H, Deng J. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Oct 6 ； 106 (40) : 17002-17006.)，在活性部位 2 個銅離子分別與3個組氨酸相連，并且這2個銅離子與不同的催化反應直接相關，如單酚羥基化為二酹(甲酹酶活性)和二酹氧化為二醌(鄰苯二酹氧化酶活性)(3. Decker, H. and Tuczek,
F.Trends Biochem. Sci. 2000 ；25 :392-397.)。酪氨酸酶的活性與黑色素合成量密切相關，在人體內的活性增高會導致雀斑、黃褐斑等黑色素過度沉積疾病的發生(4. Olivares C，Solano F.Pigment Cell Melanoma Res. 2009 Dec ；22 (6) :750-760 ；5.Jimbow K, Park JS, Kato F, Hirosaki K, Toyofuku K, Hua C, Yamashita T. Pigment Cell Res. 2000Aug ； 13(4) :222-229.)。食物(果蔬、蝦蟹等)中的酪氨酸酶會引起食物加工及貯藏過程中的褐變，導致食物變質(6.Kim YJ, Uyama H. Cell Mol Life Sci. 2005Aug ；62(15) 1707-1723 ；7. Rescigno A, Sollai F, Pisu B, Rinaldi A, Sanjust E. J Enzyme Inhib Med Chem. 2002Aug ； 17 (4) :207-218.)。酪氨酸酶在昆蟲體內也普遍存在，在昆蟲創傷愈合 (8. KanostMR, Jiang H, Yu XQ. Tmmunol Rev. 2004Apr ；198 :97-105 ；9. Lai SC, Chen CC, Hou RF. J Med Entomol. 2002Mar ；39(2) :266-274.)和表皮形成(10. Guerrero,A. and Rosell,
G.Curr· Med. Chem. 2005 ; 12 :461-469.)中起重要作用。由于酪氨酸酶在醫藥、化妝品和農業上的潛在應用前景，其活性調控研究成為研究的焦點。迄今為止，已研制出多種類型的酪氨酸酶抑制劑，可作為開發美白劑及生物殺蟲劑的候選。目前，已有不少來源于化學合成和天然產物的酪氨酸酶抑制劑作為藥品、化妝品、 食品添加劑及生物殺蟲劑。已普遍應用的酪氨酸酶抑制劑有氫醌、曲酸及其衍生物、壬二酸、熊果苷、黃酮類化合物、維生素C及其衍生物、綠茶提取物、甘草提取物等。但現有的酪氨酸酶抑制劑在抑制效果、穩定性或安全性等多方面存在著不同程度的缺陷，因此繼續尋找抑制效果好、安全性高、性質穩定的酪氨酸酶抑制劑仍然具有十分重要的意義。蕓香苷，也稱3-蕓香糖苷-槲皮素，是一種來源于蔬菜和水果的天然物質 (11. Z. Xie, Y. Zhao, P. Chen, P. Jing, J. Yue, and L. L. Yu. J Agric Food Chem. 2011 ； 59 :3042-3049 ；12. R. Slimestad and M. Verheul.J Agric Food Chem.2011 ；59 3180-3185 ；13. S. Tong, J. Yan, G. Chen, and J. Lou. J Chromatogr Sci. 2009 ；47 :341-344 ； 14. J. Kalinova,J. Triska,and N. Vrchotova. J Agric Food Chem. 2006 ；54 :5330-5335.)。在結構上，蕓香苷包括一個黃酮槲皮素和通過糖苷鍵連接的二糖蕓香糖。蕓香苷被用于許多復合維生素的生產，并可作為中草藥的有效成分(15. I. Erlund, T. Kosonen, G. Alfthan, J. Maenpaa, K. Perttunen, J. Kenraali, J. Parantainen, and A. Aro. Eur J Clin Pharmacol. 2000 ；56 :545-553 ；16. ff. Dimpfel. Phytomedicine. 2009 ； 16 :287-294.)。 蕓香苷作為生物藥物的應用主要是由于其具有抗氧化作用，可用于治療糖尿病(17. H. D. Je, C. Y. Shin, S. Y. Park, S. H. Yim, C. Kum, I. H. Huh, J. H. Kim, and U. D. Sohn. Arch Pharm Res. 2002 ；25 184-190 ； 18.A.A. Fernandes, E. L. Novelli, K. Okoshi, M. P. Okoshi,
B.P. Di Muzio, J. F Guimaraes, and A. Fernandes Junior. Biomed Pharmacother. 2010 ； 64 :214-219.)，還具有抗炎癥(19. K. Nones, Y. E. Dommel s, S. Martel I, C. Butts, ff.
C.McNabb, Z. A. Park, S. Zhu, D. Hedderley, M. P. Barnett, and N. C. Roy. Br J Nutr. 2009 ； 101 169-181.)，抗腫瘤(20· E. Bourogaa, J. Bertrand, M. Despeaux, R. Jarraya, N. Fabre, L. Payrastre, C. Demur, J. J. Fournie, M. Damak, A. E. Feki, and C. Leuk Res. 2011 ；35 1093-1101 ；21. J. P. Lin, J. S. Yang, J. J. Lin, K. C. Lai，H. F Lu, C. Y. Ma, R, Sai-Chuen Wu, K. C. Wu, F. S. Chueh, ff. Gibson Wood, and J. G. Chung. Environ Toxicol Jan. 2011 ； 20. doi 10. 1002/tox. 20662. [Epub ahead of print])和抗血管生成的作用(22. H. Luo, B. H. Jiang, S. Μ. King, and Y. C. Chen. Nutr Cancer. 2008 ；60 :800-809.)。
發明內容
本發明的目的在于提供蕓香苷的新用途，即作為酪氨酸酶抑制劑的新應用。本發明所用的蕓香苷,其英文名稱為Rutin hydrate,分子式為C27H3tlO16 · 3H20,分子量610. 52，為淡黃色或草黃色粉末，溶于二甲基亞砜和吡啶、甲酰和堿液中，常溫密封避光貯存，其化學結構式如下所示蕓香苷為商品化物質，可以從Sigma等試劑公司直接購買到。酪氨酸酶的英文名稱為Tyrosinase，分子量為128X IO3道爾頓，為凍干粉末，購于Sigma公司。以L-3,4- 二輕基苯丙氨酸(L-D0PA)作為底物，米用Lineweaver-Burk 雙倒數作圖法測得購買的酪氨酸酶的米氏常數Km = 0. 71±0. 04mM,最大反應速度Vmax = 0. 17 ±0. OOSmr1Iiiin'為了更好的理解本發明的實質，下面詳細說明蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑使用的機理。I.酪氨酸酶活性測定方法可通過測定酪氨酸酶的鄰苯二酚氧化酶活性來計算酪氨酸酶的活性。酪氨酸酶可催化底物L-DOPA形成多巴醌，而多巴醌在475nm波長處有最大吸收峰。因此通過測定酶催化反應體系的A475隨時間的增長直線，該直線的斜率即為酪氨酸酶的活力，即以L-DOPA為底物通過分光光度法在波長475nm處測定多巴醌的產生速度來計算酪氨酸酶活力的大小。 具體測定方法為=ImLL-DOPA底物體系中加入15 μ L酪氨酸酶溶液，迅速混勻，通過島津公司UV-1800紫外可見分光光度計檢測475nm處每分鐘吸光值變化來指示反應速度v值，從而表征酶活性的大小。所有動力學反應和檢測的緩沖液均采用50mM Tris-HCl，pH8. 8。2.蕓香苷對酪氨酸酶抑制作用的測定配制50mM(毫摩爾/升)蕓香苷，用緩沖液逐級稀釋成不同濃度。將不同濃度的蕓香苷30 μ L與等體積的酪氨酸酶液混合，25°C保溫3hr后測定酶活力。測定時酪氨酸酶終濃度為2. O μ g/mL，底物L-DOPA濃度為2mM，底物中含相應濃度抑制劑蕓香苷。蕓香苷濃度與酪氨酸酶活力的關系如圖I所示。由圖I可知酪氨酸酶活力被蕓香苷以濃度依賴的方式顯著地抑制，酪氨酸酶活力下降一半時蕓香苷的濃度(IC5tl)為6.8±0.3mM(n = 3);當蕓香苷濃度高于12mM時，酪氨酸酶被完全抑制。酪氨酸酶抑制劑是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成。在蕓香苷存在下進行酪氨酸酶的活性測定，測得的多巴醌V值在475nm波長處每分鐘吸光值的變化即v值顯著減小，說明酪氨酸酶被蕓香苷抑制，這種抑制作用可導致黑色素生成的抑制從而起到美白等作用。由圖I可知，當蕓香苷濃度高于12mM時酪氨酸酶活性被完全抑制，該濃度可作為酪氨酸酶抑制劑使用時的最低濃度。3.蕓香苷對酪氨酸酶的抑制為可逆的抑制作用為了判斷蕓香苷介導的抑制作用是否為可逆反應，我們在反應體系中，加入不同濃度的蕓香苷，當底物L-DOPA濃度不變時，改變酪氨酸酶的加入量，測定酪氨酸酶催化底物氧化的活力隨酶量的關系。結果如圖2所示v值代表在475nm波長處每分鐘吸光值的變化，[E]代表酪氨酸酶的濃度，圖2中1-5號蕓香苷的濃度分別為0，2. 5,5,7. 5和10mM， 體系中L-DOPA的終濃度為2mM。圖中直線均經過坐標軸原點，直線的斜率隨著加入蕓香苷濃度的增大而下降，證實蕓香苷對酪氨酸酶的抑制作用是一個可逆過程。4.蕓香苷和Cu2+的紫外/可見光掃描由于蕓香苷為多羥基的化合物，可預期其具有較強的銅離子螯合能力。通過紫外掃描光譜發現蕓香苷溶液中加入銅離子引起明顯的紅移現象，即峰值處波長變大，如圖3 所示。這說明蕓香苷可螯合銅離子，證實蕓香苷可在酪氨酸酶的活性位點直接螯合銅離子。 圖3所示曲線中蕓香苷的測試濃度為O. 05mM, Cu2+的測試濃度為O. 2mM。5.蕓香苷對酪氨酸酶的競爭性抑制分析為了評估蕓香苷對酪氨酸酶抑制的類型，用Lineweaver-Burk雙倒數法作圖。競爭性抑制動力學分析的Lineweaver-Burk方程如公式I和公式2所示
權利要求
1.蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應用。
全文摘要
本發明涉及到蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的應用。蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的作用機理為蕓香苷與酪氨酸酶的結合引起了競爭性抑制，但未引起三級結構的明顯變化，蕓香苷結合殘基位于活性中心的凹陷區域，這些殘基影響蕓香苷在初始階段的對接，一個位于活性中心與3個組氨酸結合的銅離子在平衡狀態直接與蕓香苷螯合。蕓香苷作為酪氨酸酶抑制劑的進一步研究可開發用于皮膚黑色素生成紊亂的新型美白劑，抑制效果好，并且細胞毒性非常微小。
文檔編號A61K8/60GK102579273SQ201210017958
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月19日 優先權日2012年1月19日
發明者尹尚軍, 斯越秀, 樸龍斗, 錢國英 申請人:浙江萬里學院