Vegf拮抗劑制劑的制作方法

專利名稱：Vegf拮抗劑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有能夠抑制血管內皮生長因子(VEGF)的物質的藥物制劑，并涉及制備和使用該制劑的方法。本發明包括具有提高了的穩定性的藥物制劑。相關技術綜述血管內皮生長因子(VEGF)表達在人癌癥中幾乎普遍存在，與其作為腫瘤新血管生成的關鍵介體的作用相一致。VEGF功能通過與分子或其VEGFR-2受體結合的阻斷抑制了多個不同異種移植物模型中植入的腫瘤細胞的生長(參見，例如，Gerber等人(2000)Cancer Res. 60 :6253-6258)。已經描述了可溶性VEGF特異性融合蛋白拮抗劑，被稱為“VEGF 捕集物(trap) ” (Kim 等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :11399-404 ；Holash等人(2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 :11393-8)。凍干(在受控條件下冷凍干燥)通常用于蛋白質的長期貯藏。凍干的蛋白質在凍干狀態下基本上能抵抗降解、聚集、氧化和其他退化過程(參見，例如，U. S. 6，436，897)。發明簡述在此提供了 VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩定制劑。本發明的藥物學上可接受制劑包括VEGF “捕集物”拮抗劑和藥物學上可接受的載體。具體實施方案中，提供了液體和冷凍干燥或凍干制劑。第一個方面中，本發明的特征在于VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩定液體制劑，包括含有基本上由第一個VEGF受體的免疫球蛋白樣(Ig)結構域2和第二個VEGF受體的Ig結構域3構成的受體成分和多聚化成分的融合蛋白、一種或多種緩沖劑和一種或多種熱穩定劑。VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的具體實施方案中，第一個VEGF受體是Fltl而第二個VEGF受體是Flkl或Flt4。更具體的實施方案中，融合蛋白具有SEQ ID NO :2或SEQ IDNO 4的氨基酸序列。一個實施方案中，緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑和/或檸檬酸鹽。更優選，緩沖劑是磷酸鹽和檸檬酸鹽。一個實施方案中，熱穩定劑是NaCl和/或蔗糖。更優選，熱穩定劑是NaCl和鹿糖兩者。具體實施方案中，VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩定液體制劑包括I-IOmM磷酸鹽緩沖劑、I-IOmM檸檬酸鹽、25-150mM NaCl、5-30%蔗糖、10_50mg/ml融合蛋白，約6-6. 5的pH。更具體的實施方案中，穩定的液體制劑包括5mM磷酸鹽緩沖劑、5mM檸檬酸鹽緩沖齊[J、IOOmMNaCl、20%蔗糖、25mg/ml融合蛋白，約6. O的pH。此外，可以存在聚山梨酸酯，例如O. 05-0. 15%聚山梨酸酯20。本發明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩定液體制劑以25mg/ml的VEGF制劑在_80°C貯藏約6個月后幾乎沒有呈現出沉淀并且在5°C貯藏6個月后幾乎沒有沉淀。 第二個方面中，本發明的特征在于VEGF拮抗劑的高濃度穩定液體制劑，該制劑包括 l-50mM 組氨酸、25-150mM NaCl、5-30%蔗糖、50_100mg/ml 融合蛋白，約 6-6. 5 的 pH，和O. l-o. 5%聚山梨酸酯或1-5% PEG。更具體的實施方案中，高濃度穩定液體制劑包括IOmM組氨酸、50mM NaCl、5-20%蔗糖、50-100mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH，和O. 1%聚山梨酸酯(例如，聚山梨酸酯20)或3% PEG(例如，PEG3350)。本發明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的高濃度穩定液體制劑在5°C貯藏15個月后(70或100mg/ml VEGF捕集蛋白)呈現出少于約3%降解或在24個月后(50mg/ml)少于約I. 5%降解。第三個方面中，本發明的特征在于血管內皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑凍干前制劑，包括(i)含有基本上由第一個VEGF受體的免疫球蛋白樣(Ig)結構域2和第二個VEGF受體的Ig結構域3構成的受體成分和多聚化成分的融合蛋白，(ii)緩沖劑，(iii)有機助溶劑或增量劑，和Qv) —種或多種凍干保護劑(Iyoprotectant)。各種不同的實施方案中，緩沖劑是組氨酸，有機助溶劑或增量劑是PEG，且凍干保護劑是甘氨酸和蔗糖中的至少一種。一個實施方案中，本發明的凍干前制劑不含有防腐劑。本發明的凍干前制劑的一個實施方案中，該制劑包括5_50mM組氨酸、O. 1-3.0%PEG、0. 25-3. 0%甘氨酸、O. 5-6. 0%蔗糖和5_75mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH。任何實施方案中，凍干前制劑都可以進一步包括達O. 05mM的檸檬酸鹽和/或O. 003-0. 005%的聚山梨酸酯。存在的聚山梨酸酯可以是例如聚山梨酸酯20。更具體的實施方案中，凍干前制劑包括約IOmM組氨酸、約I. 5 % PEG3350、約
O.75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約12. 5至75mg/mlVEGF特異性融合蛋白，約6. 25的pH。具體實施方案中，融合蛋白包括SEQ ID NO :4的蛋白質序列，作為多聚體存在，例如二聚體。個別的實施方案中，重建制劑是凍干前制劑濃度的2倍，例如，將20mg融合蛋白/ml凍干前制劑重建成60mg融合蛋白/ml的最終制劑。通常，用適于注射的無菌水來重建凍干制劑。一個實施方案中，重建液體可以是抑菌水。優選的實施方案中，凍干前制劑基本上由約IOmM組氨酸、約I. 5% PEG 3350、約
O.75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約50mg/ml具有SEQ ID NO :4的序列作為二聚體的融合蛋白構成，約6. 25的pH。可以存在檸檬酸鹽(低于或等于約O. 02mM)和/或聚山梨酸酯(低于或等于約O. 0005% )。任選地，凍干前制劑不含有防腐劑、磷酸鹽緩沖劑和/或超過痕量的NaCl。一個實施方案中，凍干前制劑由約IOmM組氨酸、約I. 5% PEG3350、約O. 75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約50mg/ml的VEGF捕集蛋白(SEQ ID NO 4)構成，pH6. 3，并且在重建時含有20mM組氨酸、3% PEG、I. 5%甘氨酸、約5%蔗糖和約100mg/ml VEGF捕集蛋白。第四個方面中，本發明的特征在于生產VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干制劑的方法，該方法包括對本發明的凍干前制劑進行凍干以產生凍干制劑。該凍干制劑可以通過本領域已知的用于將液體凍干的任何方法來凍干。第五個方面中，本發明的特征在于生產VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的重組凍干制劑的方法，該方法包括將本發明的凍干制劑重建成重建制劑。一個實施方案中，重建制劑是凍干前制劑濃度的兩倍，例如，本發明的方法包括(a)生產VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干前制劑，(b)對步驟(a)的凍干前制劑進行凍干；和(C)重建步驟(b)的凍干制劑。
生產重建凍干制劑方法的具體實施方案中，凍干前溶液以每ml凍干前制劑溶液25mg VEGF特異性融合蛋白拮抗劑存在于小瓶中，將其凍干并重建成50mg/ml溶液。另一實施方案中，將30mg/ml凍干前溶液凍干并重建成60mg/ml溶液。另一實施方案中，將40mg/ml凍干前溶液凍干并重建成80mg/ml溶液。另一實施方案中，將12. 5mg/ml凍干前溶液凍干并重建成25mg/ml溶液。另一實施方案中，將50mg/ml凍干前溶液凍干并重建成IOOmg/ml溶液。另一實施方案中，將75mg/ml凍干前溶液凍干并重建成150mg/ml溶液。優選，重建的凍干制劑不含有防腐劑。其他目的和優勢將從以下的詳述中將變得顯而易見。發明詳述
本發明不限于所述的特定方法和實驗條件，因此這樣的方法和條件可以改變。還應理解在此所用的術語只是為了描述特定的實施方案，而不是打算來限制，除非另外指出，因為本發明的范圍只受到所附權利要求的限制。如本說明書和所附權利要求中所使用的，單數形式“a”、“an”和“the”包括復數提及物，除非上下文中另外清楚地規定。因此，例如，對“一種方法”的提及包括一種或多種方法，和/或在此所述類型的步驟和/或本領域技術人員經閱讀本公開內容將變得清楚。概述含蛋白制劑的安全處理和給藥代表了對藥物制造者的重大挑戰。蛋白質具有出現穩定性問題的獨特化學和物理特征對于蛋白質而言存在多種降解途徑，涉及到化學和物理不穩定性。化學不穩定性包括脫氨基、聚集、肽主鏈的截短和甲硫氨酸殘基的氧化。物理不穩定性包括許多現象，包括，例如，聚集。可以通過從蛋白質中除去水來提高化學和物理穩定性。凍干(在受控條件下冷凍干燥)通常用于蛋白質的長期貯藏。凍干的蛋白質在處于凍干狀態時基本上能夠抵抗降解、聚集、氧化和其他退化過程。通常在給藥之前用任選地含有抑菌防腐劑(例如，苯甲醇)的水重建凍干的蛋白質。定義術語“載體”包括稀釋劑、輔劑、賦形劑或媒介物，組合物將與其一起給藥。載體可以包括無菌液體，如，例如，水和油，包括石油、動物、植物或合成來源的油，如，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。術語“賦形劑”包括加入藥物組合物中的非治療性物質以提供所需的稠度或穩定作用。合適的藥物賦形劑包括，例如，淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇
坐寸ο術語“凍干的”或“冷凍干燥的”包括已經經過干燥程序處理如凍干的物質的狀態，其中已經除去了至少50%的水分。短語“增量劑”包括藥物學上可接受的并給凍干塊狀物增加體積的化合物。通常，本領域已知的可接受增量劑包括，例如，碳水化合物，包括單糖如葡萄糖、核糖、果糖等，醇糖如甘露醇、肌醇和山梨糖醇，二糖包括海藻糖、蔗糖和乳糖，天然存在的聚合物如淀粉、葡聚糖、殼聚糖、透明質酸酯、蛋白質(例如，明膠和血清白蛋白)、糖原以及合成單體和聚合物。在本發明的制劑中，PEG 3350是攪拌、混合或操作時用于穩定融合蛋白的有機助溶劑，并作為增量劑來幫助產生可接受的體積。術語“凍干保護劑”包括可以加入冷凍干燥或凍干制劑中來幫助維持冷凍干燥或凍干時蛋白質結構的物質。“防腐劑”包括通常加入制劑中來延遲或消除制劑中細菌或其它污染微生物生長的抑菌、殺菌、抑真菌或殺真菌化合物。防腐劑包括，例如，苯甲醇、苯酚、苯扎氯銨、間甲酚、硫柳汞、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等。可以在USP中找到藥物學上可接受的防腐劑的其他實例。VEGF 拮抗劑VEGF拮抗劑是能夠阻斷或抑制血管內皮生長因子(VEGF)的生物作用的化合物，并包括能夠捕獲VEGF的融合蛋白。優選的實施方案中，VEGF拮抗劑是SEQ ID N0:2或4的融合蛋白；更優選，SEQ ID N0:4。具體實施方案中，VEGF拮抗劑在哺乳動物細胞系如CHO細胞中表達并可以在翻譯后修飾。一個具體實施方案中，融合蛋白包括SEQ ID N0:4的氨基酸27-457并在Asn殘基62、94、149,222和308上糖基化。可以通過本領域已知的任何合適方法來制備本發明方法和制劑中的VEGF拮抗 齊U，或者該拮抗劑是已知的。VEGF拮抗劑在用于制備藥物學上可接受的制劑時優選基本上無蛋白質污染物。優選，“基本上無蛋白質污染物”意思是至少90%重量的用于制備制劑的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑制劑中的蛋白質是VEGF融合蛋白拮抗劑蛋白質，更優選至少95%，最優選至少99%。融合蛋白優選基本上無聚集體。“基本上無聚集體”意思是在融合蛋白用于制備藥物學上有效的制劑時至少90%重量的融合蛋白不存在聚集體。作為純化處理的結果，本發明方法和制劑中的融合蛋白可以含有少量或痕量化合物，例如，少量或痕量檸檬酸鹽和/或聚山梨酸酯。含有約50mg融合蛋白/ml的本發明凍干前制劑的一個實施方案中，檸檬酸鹽可以以約O. 02mM的濃度存在和/或聚山梨酸酯可以以約O. 0005%的濃度存在。如果在凍干后將凍干前制劑重建成最初體積的一半(例如，100mg/ml融合蛋白)，那么所得到的濃度可能是O. 04mM檸檬酸鹽和/或O. 001%聚山梨酸酯。凍干和凍干制劑本發明的一個方面中，提供了包括VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的藥物學上可接受的制劑，其中該制劑是冷凍干燥或凍干制劑。可以將凍干制劑重建成溶液、懸浮液、乳液或用于給藥或使用的任何其他合適的形式。通常首先將凍干制劑制備成液體，然后冷凍和凍干。凍干之前的總液體體積可以小于、等于或大于凍干制劑的最終重建體積。凍干處理是本領域普通技術人員公知的，并且通常包括在受控條件下使水從冷凍制劑中升華。凍干制劑可以貯藏在寬范圍的溫度下。凍干制劑可以貯藏于低于25°C，例如，冷藏于4°C，或貯藏于室溫(例如，大約25V )。優選，將凍干制劑貯藏于低于約25°C，更優選，約 4-20°C ;低于約 4°C ;低于約-20°C ;約-40°C ;約 _70°C，或約 _80°C。通常通過加入水溶液使凍干制劑溶解來重建凍干制劑供使用。可以使用各種水溶液來重建凍干制劑。優選，使用水來重建凍干制劑。優選用基本上由水(例如，USP WFI，或注射用水)或抑菌水(例如，含有O. 9%苯甲醇的USP WFI)構成的溶液來重建凍干制劑。然而，也可以使用含有緩沖劑和/或賦形劑和/或一種或多種藥物學上可接受的載體的溶液。通常從液體，即，從溶液、懸浮液、乳液等制備冷凍干燥或凍干制劑。因此，經歷冷凍干燥或凍干的液體優選含有最終重建的液體制劑中所需的所有成分。結果，當重建時，冷凍干燥或凍干制劑重建之后將立即成為所需的液體制劑。用于產生冷凍干燥或凍干制劑的優選液體制劑包括藥物學上有效量的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑、緩沖劑、穩定劑和增量齊U。冷凍干燥或凍干制劑優選包括組氨酸，因為組氨酸與磷酸鹽相比，在將融合蛋白凍干時可更有效地穩定融合蛋白。有機助溶劑，如PEG 3350，用于在攪拌、混合或操作時穩定融合蛋白。優選在冷凍干燥或凍干制劑中使用凍干保護劑。凍干保護劑在冷凍干燥或凍干時有助于維持蛋白質的二級結構。兩種優選實例凍干保護劑是甘氨酸和蔗糖，優選一起使用。穩定的液體制劑一方面，本發明提供了包括VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的穩定的藥物學上可接受的制劑，其中該制劑是液體制劑。優選，該液體制劑包括藥物學上有效量的融合蛋白。該制劑還可以包括一種或多種藥物學上可接受的載體、緩沖劑、增量劑、穩定劑、防腐劑和/或賦形劑。藥物學上可接受的液體制劑的實例包括藥物學上有效量的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑、緩沖劑、助溶劑和一種或多種穩定劑優選的液體制劑包括磷酸鹽緩沖劑、有機助溶劑和一種或多種將貯藏時聚集物和低分子量產物的形成減到最少的熱穩定劑，和約10mg/ml至約50mg/ml融合蛋白，其中該制劑約為pH 6. 0-6. 5。優選的液體制劑包括約5mM磷酸鹽緩沖劑、約5mM檸檬酸鹽、約IOOmMNaCl、約25%蔗糖和約10-50mg/ml融合蛋白，其中該制劑為約6. O的pH ;任選地可以存在聚山梨酸酯(例如，O. I %聚山梨酸酯20)。盡管NaCl或蔗糖可以用作穩定劑，已經確定NaCl和蔗糖的組合比任一單獨的穩定劑可更有效地穩定融合蛋白。在規定的時間點以多種方式來測定穩定性，包括pH的測定、顏色和外觀的目測、通過本領域已知的方法，例如UV光譜法、SDS-PAGE、大小排阻HPLC、活性的生物測定、等電點聚焦和異天冬氨酸定量對總蛋白含量的測定。用于測定VEGF拮抗劑活性的生物測定的一個實例中，使用BAF/3VEGFR1/EP0R細胞系來測定通過本發明的VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的VEGF165結合。制劑，不管是液體還是冷凍干燥和凍干的，都可以貯藏于缺氧環境中。可以通過將制劑貯藏在惰性氣體如，例如氬、氮或氦下來產生缺氧環境。
實施例在描述本發明方法之前，應當理解本發明不限于所述的特定方法和實驗條件，因為這樣的方法和條件可以改變。還應當理解在此所用的術語只是為了描述特定的實施方案，而不是打算來限制，因為本發明的范圍只限于所附的權利要求。如本說明書和所附權利要求中所使用的，單數形式“a”、“an”和“the”包括復數提及物，除非上下文中另外清楚地規定。因此，例如，對“一種方法”的提及包括一種或多種方法，和/或在此所述類型的步驟和/或本領域技術人員在閱讀該公開內容之后將變得清楚。除非另外限定，在此所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含意。盡管與在此所述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于實踐或測試本發明，現在描述優選的方法和材料。實施例I. 50mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩定性將含有IOmM磷酸鹽、50mM NaCl.O. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和50mg/ml VEGF捕集物(SEQ ID N0:4)，pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在3、6、9、12、18和24個月時測試樣品。通過SE-HPLC測定穩定性。表I中所示的結果表明了分別在12和24個月時98.6%和98. 3%的VEGF捕集蛋白保持完整(未降解)。在0D405nm處測量濁度；和通過大小排阻HPLC測定回收的蛋白質百分比。
表I.貯藏于5°C時50mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS065)的穩定性
月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VBGF捕集物% 天然構象%
O 通過 O. 00 6.210099. O
3 通過 O. 00 6.210298.8
6 通過 O. 00 6. 210398.7
9 通過 O. 00 6. 310298.2
12 通過 O. 00 6. 310698.6
18 通過 O. 00 6. 310398.4
24 通過 O. 00 6. 29398. 3將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和50mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO :4)，ρΗ6· 25的液體制劑貯藏于5°C并在3、6、9、12、18和24個月時測試樣品。穩定性結果顯示于表2中。表2.貯藏于5°C時50mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS065)的穩定性
月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構象％
O通過 O. 00 6.210099. O
3 通過 O. 00 6.210098.8
6 通過 O. 01 6. 310398. 5
9 通過 O. 00 6. 310398. 3
12 通過 O. 01 6. 311098. 3
18 通過 O. 00 6. 311398. O
24 通過 O. 01 6. 29097.8實施例2. 75mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩定性將含有10禮磷酸鹽、501111 NaCl、0.1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和75mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在0、1、2. 3、3、9、12和15個月時測
試樣品。穩定性結果顯不于表3中。表3.貯藏于5°C時75mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩定性
月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構象%
0通過 O. 00 6.210097. I
1通過 O. 00 6.29697. O 2. 3 通過 O. 00 6.2 98 96.7
3 通過 O. 00 6.29796. I
9 通過 -O. 01 6. O10196. O
12 通過 O. 00 6. 311094.5
15 通過 O. 00 6. 39295 .6
將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和75mg/mlVEGF捕集物(SEQ ID NO 4), 冊.25的液體制劑貯藏于51并在0、1、2.3、3、9、12和15個月時測試樣
品。穩定性結果顯示于表4中。表4.貯藏于5°C時75mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩定性
月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VBGF捕集物天然構象％
0通過 O. 00 6.210096.8
1通過 O. 00 6.29996.7
1.3 通過 O. 00 6. 29796. 3 3 通過 O. 00 6. 2 89 95.6 9 通過 -0.01 6. 2 98 95. 4 12 通過 -(LOl 6.3 112 94. I 15 通過 O. 00 6. 3 98 94.8實施例3. 100mg/ml VEGF捕集物的液體制劑的穩定性將含有IOmM磷酸鹽、50mM NaCUO. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和100mg/ml VEGF捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在0、1、2. 3、3、9、12和15個月時
測試樣品。穩定性結果顯示于表5中。表5.貯藏于5°C時100mg/ml VEGF捕集蛋白(VEFT-SS101)的穩定性
月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構象%
0通過 O. 00 6. 310096.7
1通過 O. 00 6.29296.6
2.3 通過 O. 00 6.29296.2 3 通過 O. 00 6. 2 99 95. 5 9 通過 -O. 01 6. 2 92 95. 5 12 通過 -O. 01 6. 2 110 93.9 15 通過 O. 00 6. 3 108 94.8將含有IOmM 磷酸鹽、50mM NaCl,3% PEG 3350、20%蔗糖和 lOOmg/mlVEGF 捕集物(SEQ ID NO 4), pH6. 25的液體制劑貯藏于5°C并在O、1、2· 3、3、9、12和15個月時測試樣品。穩定性結果顯不于表6中。表6.貯藏于5°C時100mg/ml VEGF捕集蛋白(VEF T-SS101)的穩定性月數目測外觀濁度pH回收的VEGF捕集物
VEGF捕集物% 天然構象％
0通過 O. OO 6. 310096. 5
1通過 O. 01 6. 29496. 2
2.3 通過 O. 01 6. 2 93 95.7
3 通過 O. 01 6.210294. 6
9 通過 O. 00 6.29594.6
12 通過 O. 00 6, 39692.8
15 通過 O. 01 6. 310293.9實施例4.穩定的VEGF捕集物制劑的另外的實施方案
一個實施方案中，本發明提供了穩定的液體VEGF結合融合蛋白(VEGF捕集物)制齊U，其含有5mM磷酸鹽、5mM檸檬酸鹽、IOOmM NaCUO. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖、2511^/1111VEGF捕集蛋白，pH6. O。該制劑可以皮下遞送或通過靜脈內輸注來稀釋并遞送。由于該制劑的高摩爾滲透壓濃度，將其稀釋3倍以獲得用于靜脈內給藥的等滲溶液。穩定性研究顯示了在2-8°C貯藏3年后檢測到少于約I %的降解。一個實施方案中，本發明的特征在于凍干制劑，優選將凍干前制劑濃縮兩倍成為凍干后制劑，例如，50至100mg/ml ;75至150mg/ml,或100至200mg/ml VEGF捕集蛋白。一個具體的實施方案中，凍干前制劑包括IOmM組氨酸、I. 5% PEG 3350,0. 75%甘氨酸、2. 5%蔗糖、50mg/ml VEGF捕集蛋白，pH6. 3，將其重建成包括20mM組氨酸、3% PEG3350、I. 5%甘氨酸、5%蔗糖、100mg/ml VEGF捕集蛋白，pH6. 3的制劑。穩定性研究顯示出在2_8°C貯藏6個月后未檢測到降解。液體制劑的一個實施方案中，該制劑包括IOmM組氨酸、50mM NaCl、5_20 %蔗糖、50-100mg/ml VEGF捕集物和O. I %聚山梨酸酯20或3% PEG3350之一。該液體制劑的優勢之一在于它提供了較高濃度的VEGF捕集物而不需要制造凍干產品。因此，該制劑易于皮下遞送，例如，通過允許提供預先填充液體的注射器，其濃度高于經IV輸注遞送的濃度。此夕卜，該制劑可有利地用于提供較小的輸注體積和較短的輸注時間。在5°C保溫長達15或24個月后通過SE-HPLC測定的降解量概括于表7中。表7.含有50-100mg/ml VEGF捕集物的液體制劑(VEGF-SS101)的穩定性
保溫 VEGF捕集物聚山梨酸酯20% PEG 3350% 降解％
(月數)(mg/ml)
2450O. I-0.7
2450=3I. 3
1575O. I-I. 5
1575-32. O
15100O. I-1. 9
15100-32. 6實施例5.凍干的和液體的穩定性和活性在6個月期間測定重建的凍干制劑的穩定性。凍干前制劑含有IOmM組氨酸、I. 5%PEG 3350、2. 5%蔗糖、0. 75%甘氨酸和50mg/ml VEGF捕集蛋白。凍干后，重建的制劑含有20mM組氨酸、3%PEG 3350、5% 蔗糖、I. 5% 甘氨酸和 100mg/ml VEGF 捕集蛋白(SEQ ID NO:
4)。結果顯示于表8中。在基于細胞的生物測定中測定活性，該測定直接測量VEGF捕集物抑制人VEGF對小鼠Baf/3 VEGFRl/EpoR細胞系的生物活性的能力。因此，該生物測定直接測量蛋白質的生物活性。將結果表示為相對效能百分比(測試樣品IC5tl/參照VEGF IC5tl標準X 100)。使用特異性測量含有VEGF和各種濃度VEGF捕集物的平衡混合物中游離VEGF的靈敏ELISA來測量VEGF與VEGF捕集物的結合親和力。將結果表示為相對結合百分比(測試樣品的IC5tl/參照的IC5tlX 100)。測量的pH在6. 3-6. 5的范圍內。所有溶液在視覺上都是澄清的。在A28(lnm處用UV分光光度計來測定回收的VEGF捕集物濃度，以mg/ml表示。用SE-HPLC測定以天然構象回收的VEGF捕集物百分比(主峰純度)。表8.貯藏于5°C的VEGF捕集物凍干制劑(VGT-RS475)的穩定性
月數生物測定結合測定回收的% 天然構象％
012012697.998.7
11177497.998.6 1+24 小時 126 72 99. O 98.5 1+4 小時 94 81 101. 5 98.2
31019898. I98.6
3+24 小時659498. I98.2
6+4 小時96.998.7
6+24 小時98.898.6測試含有約5mM磷酸鹽、5mM檸檬酸鹽、IOOmM NaCl、0. 1%聚山梨酸酯20、20%蔗糖和25mg/ml VEGF捕集蛋白的制劑在5°C貯藏時36個月內的穩定性和活性。結果顯示于表9中。如通過目測所確定的，所有樣品是澄清的和無色的。pH范圍為6. 0-6. I。*直接表示兩次測量(I和2個月)的結合測定結果而不是以標準的百分比表示。表9.液體制劑(VGT-FS405)的穩定性和活性
月數天然構象％ 生物測定結合測定蛋白質含量mg/ml
099. 71067225. O
199. 91194. 4pM*25. 2
299. 61025. 4pM*25. I
399.6978825. I 6 99.6 101 106 25. O 9 99.4 89 126 25.4 12 99. 5 85 95 25. 2 18 99.4 99 81 25.5 24 99. 3 75 95 25. 6 36 98.8 109 79 25. 權利要求
1.凍干前制劑，包括α)血管內皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑，(ii)緩沖齊U，(ill)有機助溶劑或增量劑，和(iV) —種或多種凍干保護劑，其中融合蛋白具有SEQ IDNO 4的氨基酸序列。
2.權利要求I的凍干前制劑，其中緩沖劑是組氨酸。
3.權利要求I的凍干前制劑，其中有機助溶劑或增量劑是PEG。
4.權利要求I的凍干前制劑，其中凍干保護劑是甘氨酸和蔗糖中的至少一種。
5.權利要求I的凍干前制劑，包括5-50mM組氨酸、O.1-3. 0% PEG、0. 25-3. O %甘氨酸、O. 5-6. 0%鹿糖和 5-75mg/ml 融合蛋白，約 6. 0-6. 5 的 pH。
6.權利要求5的凍干前制劑，包括約IOmM組氨酸、約I.5% PEG3350、約O. 75%甘氨酸、約2. 5%蔗糖和約12. 5-75mg/mlVEGF特異性融合蛋白，約6. 25的pH。
7.權利要求6的凍干前制劑，其中融合蛋白是50mg/ml。
8.由SEQID NO :4編碼的VEGF拮抗劑融合蛋白的液體穩定制劑，包括l-50mM組氨酸、25-150mM NaCl、5_30%蔗糖和 50_100mg/ml 融合蛋白，約 6. 0-6. 5 的 pH，包括 O. 01-0. 5%聚山梨酸酯。
9.權利要求8的液體穩定制劑，進一步包括O.1-5% PEG。
10.權利要求8的液體穩定制劑，包括約IOmM組氨酸、約50mMNaCl、5-20%蔗糖和50-100mg/ml融合蛋白，約6. 0-6. 5的pH，進一步包括O. I %聚山梨酸酯20。
11.權利要求10的液體穩定制劑，進一步包括3%PEG 3350。
12.生產VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的凍干制劑的方法，包括使權利要求7的凍干前制劑受到凍干而產生凍干制劑。
13.生產VEGF特異性融合蛋白拮抗劑的重建的凍干制劑的方法，包括用液體重建權利要求12的凍干制劑，其中產生重建的凍干制劑。
14.權利要求13的方法，其中液體是無菌水或抑菌水。
全文摘要
提供了血管內皮生長因子(VEGF)特異性融合蛋白拮抗劑的制劑，包括凍干前制劑、重建的凍干制劑和穩定的液體制劑。優選，該融合蛋白具有SEQ ID NO4的序列。
文檔編號A61K47/26GK102614134SQ201210090068
公開日2012年8月1日 申請日期2006年3月22日 優先權日2005年3月25日
發明者D·迪克斯, K·弗萊, S·考特茲 申請人:瑞澤恩制藥公司