專利名稱：一種預防奶牛乳腺炎的改進型增效核酸疫苗的構建的制作方法
技術領域：
該發明涉及生物技術領域中的疫苗及其構建方法，尤其是涉及以地區流行菌株的FnBPA分子A區及B區的部分序列為靶標的DNA疫苗的改進及其構建方法。
背景技術：
近年來，隨著飼養規模的擴大和飼養密度的増加，乳房炎的感染呈上升趨勢。截止2011年我國奶牛存欄頭數1300萬頭，毎年由乳腺炎造成的經濟損失可達40億元。近些年來，抗生素的大量使用甚至濫用，使金黃色葡菌球菌的抗菌譜逐漸擴大，給臨床治療和預防金黃色葡菌球菌乳腺炎提出了新的挑戰。目前認為疫苗是防控金黃色葡菌球菌感染的有效方法。迄今金黃色葡萄球菌疫苗研制經歷了全菌滅活苗、亞單位疫苗和DNA疫苗3次重大變革。
林峰強等(林峰強，胡松華，胡奇林,等.奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎菌苗佐劑研究現狀.動物醫學進展，2004，25 ￠) 49-51.)針對滅活苗的不足研制出了針對金黃色葡萄球菌單ー成分的亞單位疫苗。金黃色葡萄球菌黏附素纖連蛋白結合蛋白A(FnbpA)是細菌感染的先決條件(周宏，李韓平.金黃色葡萄球菌表面蛋白研究進展.生物技術通訊，2004，15 (I) :73-75.)抑制其活性后可從根源上切斷金黃色葡萄球菌感染的途徑。幾乎所有的金黃色葡萄球菌都擁有FnbpA基因，都可以表達纖連蛋白結合蛋白A，此蛋白由于具有與宿主組織的特異黏附能力，正成為抗金黃色葡萄球菌感染疫苗開發的熱點分子。目前FnBP分子結構中的D區被稱作配體結合區，被認為是主要的免疫優勢表位，目前在研制金黃色葡萄球菌疫苗中占有重要的作用。國內研制的FnBPA重組蛋白疫苗疫苗首免后7d，在免疫組小鼠血清中即可檢測到抗體，而且隨著免疫時間的延長，抗體效價呈明顯的上升趨勢，在21d達到最高水平，之后抗體水平逐漸降低。通過對小鼠的免疫攻毒試驗可知，FnBPA基因工程亞單位疫苗可有效提高小鼠的抗體水平，免疫保護指數PI達80%，說明該疫苗對金黃色葡萄球菌具有較強的免疫保護カ(張海燕，楊宏軍，王長法，何洪彬，仲躋峰，馬衛明.重組金黃色葡萄球菌FnbpA亞單位疫苗的研制.西北農林科技大學學報.2011, 5 (39) :39-43.)。雖然基因工程亞單位疫苗具有抗原劑量大、純度高且無遺傳物質及宿主和培養基的成分等優點(張延齡，張暉.疫苗學.北京科學出版社2004 :345-377,421-504.)基因工程亞單位疫苗誘導大動物的免疫應答持續時間短，且制作的成本高，尤其是大動物的免疫成本高。為克服這些缺點，我們選擇了核酸疫苗。核酸疫苗又稱基因疫苗、DNA疫苗，是把外源基因克隆到質粒或病毒載體上，用重組質粒或病毒DNA直接免疫，使外源基因在活體內以天然蛋白的形式呈遞抗原，激活機體免疫系統，井能持續的引發免疫反應。其無毒性返祖現象，對病毒變異株也起作用。因此DNA疫苗是近年來備受人們關注的ー種新型疫苗。基于細菌表面蛋白的粘附機制研制的抗金黃色葡萄球菌核酸疫苗，被認為是有廣闊研究前景的疫苗，可望通過阻斷金黃色葡萄球菌對奶牛乳腺上皮細胞的粘附過程來預防乳腺炎的發生。Nour等研制了 CTLA4和ClfA的重組核酸疫苗并采用了共聚物陽離子包裝先用核酸疫苗免疫奶牛2次，3個月后再用200 μ g的ClfA重組蛋白加強免疫一次，免疫牛產生了較強的體液免疫及細胞免疫反應(Adel NM Nour Eldin, Lulzim Shkreta, Br IanG Talbot, et a. I DNAimunization of aairy cows with the clumping factor A ofStaphylococcus aureus. Vaccine, 2006, 24 :1997-2006.)國外已有基于 FnBP 的黏附機制來研制金黃色葡萄球菌DNA疫苗的報道。但是當前以FnBPA為靶基因研制的核酸疫苗效果并不是很理想，作為新一代疫苗的代表，免疫原性較低是限制DNA疫苗廣泛應用的ー個主要因素。尤其是大動物要獲得有效的免疫需要大劑量的DNA。提高DNA疫苗的有效性可通過改善所使用的質粒的抗原提呈效率使其在體內更有效的發揮免疫效果來實現。 糖磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白是ー類廣泛存在于細胞表面的蛋白，其特點是能將蛋白質錨定于細胞膜上而不涉及細胞內信號傳遞。對GPI融合細胞因子的研究發現，GPI融合細胞因子在轉移到細胞表面后會在免疫位點形成ー個持續時間較長的不可溶的緩釋基地，這將會使更多的免疫細胞來到免疫位點，并使這些細胞攝取更多的抗原，從而增強了疫苗的效果(Poloso N, Nagarajan S, Bumgarner Gff, et al. Designer cancer vaccines madeeasy protein transfer of immunostimulatory molecules for use in therapeutictumor vaccines. Front Biosci, 2001，6 :760-775.)GPI 蛋白轉移技術能最大限度地延長GPI結合蛋白的壽命而對其功能無明顯影響(Daniel R. D. Premkumar, Yoshihiro Fukuoka,et al. Properties of exogenously added GPI—anchored proteins following theirincorporation into cells. Journal of Cellular Biochemistry, 2001,82 :234-245.)。發明目的為克服當前DNA疫苗免疫原性較低和免疫強度低，提高其抗原針對性和抗原提呈效率，在體內獲得更有效的免疫。與其他設計不同，本研究通過PCR在FnBPA抗原表位基因的N端加上牛IFN- Y的信號肽序列，在C端加上牛源膜錨定型堿性磷酸酶的GPI信號序列組成融合基因。將抗原表位粘附素分子FnBPA配體結合區的A區及B區部分序列和設計編碼GPI的基因融合在一起，設計了以FnBPA為免疫靶標的預防奶牛乳腺炎的改進型增效核酸疫苗。
發明內容
(I)本發明的目的之ー是提供了一種改進型增效核酸疫苗的構建，以提高抗原的
提呈效率。(2)為解決上述的技術問題，本發明采取了以下技術方案在抗原表位的選擇上選擇了本區流行株FnBPA基因的A區和B區，克服不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的粘附素的差異造成的免疫失敗和提高其抗原針對性。(3)為提高該核酸疫苗抗原提呈效率，在體內獲得更有效的免疫，我們在抗原表位基因的N端加上牛IFN-Y的信號肽序列，在C端加上牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列組成融合基因。
(4)所述的融合基因位于真核表達載體PVAX-I中，此外還包括所有能在真核細胞中表達的載體pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pLXSN等載體。(5)本發明的第二個目的是提供一種本發明預防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PVAX-SGFn的設計及其構建方法。(6)本發明預防奶牛乳腺炎核酸疫苗PVAX-Fn的設計及其構建方法，可包括以下步驟(A)為了在Fn的氨基端加入信號肽序列，根據奶牛IFN-Y信號肽cDNA序列合成引物，FnPI-5，TGC TCT GTG GGC TTT TGG GTT TTT CTG GTT CTT ATG GCA CTA ACGTTA ATCATATAG 3’FnP2-5’CGAggatcc ATG AAATAT ACAAGC TAT TTC TTAGCT TTA CTG CTC TGT GGGCTT TTG GGT TTT TC 3’ FnR5’ -GGA Tga att cTTCAA TGT ATC CGT CAA C 3’ 并在上游引物引入BamH I、下游引物引入EcoR I兩個酶切位點，利用延伸PCR方法將奶牛IFN-Y信號肽序列與FnBPA抗原表位基因融合。 (B)為在抗原表位基因的羧基端加上加上牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列，用引物 GPIF-5， CCG GAA TTCT CAG CCA GCT CGT CCG GCA GCC CCT CCC CCG GCCCCC TGC TGCTCC TCC TGG CCC TGC TGC CCC TGG GCA GCC TGT TCT GACTCG AGC GG-3’GPIR-5， CCG CTC GAG TCA GAA CAG GCT GCC CAG GGG CAG CAG GGC CAGGAG GAGCAG CAG GGG GCC GGG GGA GGG GCT GCC GGA CGA GCT GGC TGAGAA TTC CGG-3’。通過 PCR反應將牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列序列與上述構建的FnBPA融合基因相連接；(C)PCR產物經雙酶切(上游引物引入BamHI、下游引物引入Xho 11兩個酶切位點)后的產物連接入真核表達載體中；(D)在此以PVAX-I為出發載體，得到PVAX-SGFn質粒，測序并驗證序列。(7)本發明以上技術方案提供了一種以金黃色葡萄球菌FnBPA基因為靶標的核酸疫苗的設計和構建方法。本發明的特點可總結為該疫苗將牛IFN-Y信號肽的DNA序列與FnBPA抗原表位的N端相連，并將牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列與構建的FnBPA融合基因的C端相連接；該改進型增效的設計能夠使靶抗原表達于細胞表面；該設計可提高抗原提呈的效率并具有長期而有效的保護作用，是對FnBPA基因DNA疫苗的改進。本發明在奶牛乳腺炎防治中新型疫苗的研制與開發方面發揮重要的作用，應用前景廣闊。發明效果(I)本發明與亞單位疫苗相比，制作的成本降低。(2)本發明與亞單位疫苗相比用量少。(3)本發明中將牛IFN- Y信號肽的DNA序列與抗原表位的N端相連，并將牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列與上述構建的FnBPA融合基因的C端相連接；可使抗原在細胞表面表達，并在免疫位點形成ー個持續時間較長的不可溶的緩釋基地，這將會使更多的免疫細胞來到免疫位點，使這些細胞攝取更多的抗原，從而增強了疫苗的效果。(4)此外該發明延長融合蛋白的壽命而對其功能無明顯影響。因此本發明與傳統的核酸疫苗相比免疫應答持續時間長，可達3個月以上。(5)免疫后3個月攻毒保護效果可達66 %。(6)免疫表位的選擇位于FnBPA的A區即B區的部分序列，可克服不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的黏附素造成的差異。
(7)與改進前的DNA疫苗相比，其體液免疫與細胞免疫的效果均有顯著的提高與
改善實施例構建奶牛乳腺炎FnBPA基因的真核表達載體(I)獲得本地流行菌株的基因組DNA。(2)篩選具有良好免疫原性和抗原多樣性FnBPA基因的優勢表位，PCR擴增FnBPA基因的A區及B區的部分基因(圖I)，作為DNA疫苗的候選序列。(3)為了在Fn的氨基端加入信號肽序列，根據奶牛IFN-Y信號肽cDNA序列合成引物，FnPI-5，TGC TCT GTG GGC TTT TGG GTT TTT CTG GTT CTT ATG GCA CTA ACGTTA ATC ATA TAG 3’FnP2-5’CGA gga tcc ATG AM TAT ACA AGC TAT TTC TTAGCT TTA CTG CTC TGTGGG CTT TTG GGT TTT TC 3，FnR5，-GGA Tga att cTTCAA TGT ATC CGT CAA C 3，并在上游引物引入BamHI、下游引物引入EcoR I兩個酶切位點，利用延伸PCR方法將奶牛IFN- Y信號肽序列與FnBPA抗原表位基因融合。(4)為在抗原表位基因的C端加上加上牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列，用引物GPIF-5’CCG GAA TTCT CAG CCA GCT CGT CCG GCA GCC CCT CCC CCG GCCCCC TGC TGC TCCTCC TGG CCC TGC TGC CCC TGG GCA GCC TGT TCT GACTCG AGC GG-3’GPIR-5， CCG CTC GAG TCA GAA CAG GCT GCC CAG GGG CAG CAG GGC CAGGAG GAGCAG CAG GGG GCC GGG GGA GGG GCT GCC GGA CGA GCT GGC TGAGAA TTC CGG-3’。通過 PCR反應將牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列序列與上述構建的FnBPA融合基因相連接。(5) PCR產物經雙酶切(上游引物引入BamHI、下游引物引入Xho 11兩個酶切位點)后的產物連接入真核表達載體中；(6)在此以PVAX-I為出發載體(圖2)，得到PVAX-SGFn質粒，測序并驗證序列。(7)構建完成后，轉化大腸桿菌，挑取陽性克隆，進行PCR鑒定。結果獲得1700bp左右的片段(圖3)，與預期結果相符，提示上述抗原表位已連接到表達載體上。同時將重組的載體測序，以驗證序列。
ΚΛ I
零禱 Ml —-M DL2000Marker ；1 PCR 產物圖I. FnBPA基因的PCR擴增
權利要求
1.一種治療和預防奶牛乳腺炎的改進型增效核酸疫苗。
2.根據權利要求I所述的核酸疫苗，其特征在于其優勢抗原表位包含了本地區流行株FnBPA基因的A區和B區的核苷酸序列，克服不同來源的奶牛乳腺炎金黃色葡萄球菌產生的粘附附素造成的差異和提高其抗原針對性。該疫苗具有SEQN02所示的堿基序列。
3.根據權利要求2所述的核酸疫苗，其特征在于其是ー種融合基因，在FnBPA抗原表位基因的N端増加了牛IFN-Y的信號肽序列，在C端増加了牛源膜錨定型堿性磷酸酶的GPI信號序列組成融合基因。
4.根據權利要求3所述的核酸疫苗，其特征在于我們所述的融合基因位于真核表達載體PVAX-I中，此融合基因可位于任何真核表達載體中，包括但不限于PVAX-I，pcDNA3. 1，pEGFP-Nl, pEGFP-Cl, pLXSN 等載體。
5.根據權利要求4所述的核酸疫苗，還涉及所述核苷酸用于生產疫苗的用途
6.權利要求5所述的核酸疫苗的設計與構建方法，包括以下步驟(A)為了在Fn的氨基端加入信號肽序列，根據奶牛IFNi信號肽cDNA序列合成引物，FnPl-5’TGC TCT GTGGGCTTT TGG GTT TTT CTG GTT CTT ATG GCA CTA ACG TTA ATC ATA TAG 3’ FnP2_5’ CGA ggatcc ATG AAA TAT ACA AGC TAT TTC TTA GCT TTA CTG CTC TGTGGG CTT TTG GGT TTT TC3’FnR5’-GGA Tga att cTT CAA TGTATC CGT CAA C 3’并在上游引物引入 BamH I、下游引物引入EcoR I兩個酶切位點，利用延伸PCR方法將奶牛IFN- Y信號肽序列與FnBPA抗原表位基因融合。(B)為在抗原表位基因的羧基端加上加上牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列，用引物 GPIF-5，CCG GAA TTCT CAG CCA GCTCGT CCG GCA GCC CCT CCC CCG GCC CCC TGCTGC TCC TCC TGG CCC TGC TGCCCC TGG GCA GCC TGT TCT GAC TCG AGC GG-3’GPIR-5， CCG CTC GAG TCA GAA CAG GCT GCC CAG GGG CAG CAG GGC CAG GAGGAG CAGCAG GGG GCC GGG GGA GGG GCT GCC GGA CGA GCT GGC TGA GAATTC CGG-3’。通過 PCR 反應將牛源堿性磷酸酶的GPI信號序列序列與上述構建的FnBPA融合基因相連接；(C) PCR產物經雙酶切(上游引物引入BamH I、下游引物引入XholI兩個酶切位點)后的產物連接入真核表達載體中；(D)在此以PVAX-I為出發載體，得到PVAX-SGFn質粒，測序并驗證序列。
7.權利要求I所述的核酸疫苗的生產宿主細胞是大腸桿菌。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域中的疫苗及其構建方法，是一種改進型增效核酸疫苗的設計及構建方法和應用。該發明是將選擇金黃色葡萄球菌FnBPA的抗原表位基因與GPI錨定序列連接后的融合基因插入載體進行表達和免疫，實驗表明該改進型的疫苗具有良好的免疫原性，免疫效果優于非融合的基因單獨免疫。在攻毒保護試驗中對免疫小鼠起到了免疫保護的作用。該核酸疫苗可安全、有效、無藥物殘留地防治奶牛乳房炎，對奶牛乳腺炎的防治具有良好的應用前景。
文檔編號A61K48/00GK102847167SQ20121023607
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者蘇艷, 王世民, 張寶江 申請人:新疆農業大學