專利名稱：牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及兩種中藥單體成分的藥理作用及其應用，具體是以牛蒡苷和苷元為活性成分的單體藥物及其在抗帕金森藥物中的應用。
背景技術：
牛蒡子為菊科(Compositae)牛蒡屬(Arctium)植物牛蒡(Arctium lappa)的干燥成熟果實。牛蒡子的主要藥效成分為牛蒡苷，我們的研究結果(He Fan，Dou De-Qiang, SunYu, Zhu Lin, Xiao Hong-Bin, Kang Ting-Guo. Plasma pharmacokinetics and tissuedistribution of arctiin and its main metabolite in rats by HPLC-UV and LC-MS.Planta Medica 2012, 78:800-806.)和國外報道均表明牛蒡苷是通過在胃腸道中代謝成牛蒡苷元而發揮其藥效的。帕金森病(Parkinson’ s disease, PD)是以中腦黑質多巴胺能神經元漸進性死亡為病理特征的中樞神經系統退行性疾病。目前治療手段主要以西藥為 主，但只能改善癥狀，不能控制其進程，長期應用療效減弱且毒性增大。
發明內容
本發明的目的在于公開一種牛蒡苷及苷元的新用途，即能有效防治帕金森病。我們的研究結果表明牛蒡苷元為牛蒡苷的代謝產物和吸收入血的活性成分，而且直接服用牛蒡苷元的生物利用度較低。因此牛蒡苷為牛蒡苷元的前體藥物。我們首先通過體外實驗發現牛蒡苷元具有較好的抗帕金森作用，然后通過體內實驗發現口服牛蒡苷而顯示其具有較強的抗帕金森病的作用。研究結果證明牛蒡苷和苷元均可應用于帕金森病的治療。為證實牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病采用的技術方案是
一、牛蒡苷和苷元的制備
I、牛蒡苷的制備方法，是取牛蒡子粗粉I. Okg (牛蒡苷含量5. 2%)，用水煎煮提取三次，每次加15倍量水，I小時。合并提取液，減壓濃縮至藥材的2倍量，加95%乙醇至乙醇濃度達到80%，4°C醇沉12小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至近干，得浸膏。浸膏用甲醇溶解，用浸膏I等重量的100-120目硅膠拌樣，用浸膏I等重量的200-300目硅膠分離，用氯仿-甲醇洗脫，得到含有牛蒡苷的餾分，合并含有牛蒡苷的餾分，濃縮后加95%乙醇結晶，得牛蒡苷30g (牛蒡苷含量大于95%)。2、牛蒡苷元的制備方法，是取牛蒡子粗粉I. OKg (牛蒡苷含量5. 2%)，加3倍量水，40°C溫孵4個小時，加95%乙醇和水調節成10倍量60%乙醇提取液，加熱回流煎煮I小時。繼續用60%乙醇提取兩次，每次I小時。合并提取液，濃縮近干。經硅膠柱分離，用100目硅膠按樣品量I: I拌樣，200-300目硅膠I: I進行柱層析，氯仿-甲醇洗脫，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重結晶，得牛蒡苷元25g (牛蒡苷元含量大于95%)。二、細胞的培養及ro細胞模型的建立
I.I實驗材料多巴胺能人神經母瘤細胞株(SH-SY5Y細胞，購于中科院上海細胞庫)，所用牛蒡苷和苷元取自本實驗室。
I. 2細胞培養含10%滅活小牛血清(購自GIBCO公司，批號8166872)、青霉素100U .mL'鏈霉素 ΙΟΟμ g .mr1 (購自 HyClone 公司，批號:J120721)的 DMEM F-12 1:1 培養液(購自HyClone公司，批號NXA0559)培養SH-SY5Y細胞，置于37°C、5% C02的培養箱中。隔天更換培養液，培養至單層細胞約80%匯合時，傳代培養，用對數生長期的細胞進行實驗。I. 3造模及給藥方法調節SH-SY5Y細胞密度約5X 104/mL，100 μ L/孔接種于96孔板，16h后分別加入不同濃度(I μ Μ、5 μ M和10 μ Μ)的牛蒡苷和牛蒡苷元,每一濃度設3個復孔，并設等量的對照組(不含處理試劑)和模型組(只加ΜΡΡ+，購于Sigma公司，批號100M4713V)，24h后，對照組加入完全培養基，模型組和空白組每孔加入用培養液稀釋的ImM的MPP+ (I —甲基一4 —苯基吡啶離子)。I. 4四甲基偶氮唑鹽(MTT+)法檢測細胞存活率48h后，不同組細胞每孔均加入5mg/mL MTT+ 10 μ L，培養4h，吸去孔內培養基，每孔加DMSO 100 μ L，待結晶充分溶解，酶標儀檢測490nm處各孔的吸收值(0D值)(參考波長620nm)，計算細胞存活率細胞存活率％ =(實驗組OD值-空白組OD值/對照組OD值-空白組OD值)X 100% ]01.5統計學處理數據以均數土標準差(I 土S)表示，用單因素方差分析(one-wayAN0VA)進行統計學處理。結果見表I。表I不同濃度牛蒡苷和苷元對抗MPP+細胞毒性后的SH-SY5Y細胞存活率
權利要求
1.牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元純度大于90%時具有治療帕金森病作用。
2.根據權利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用，其特征在于所述牛蒡苷及苷元是由牛蒡子粗粉制成，其中 牛蒡苷的制備方法如下取牛蒡子粗粉I. O kg，牛蒡苷含量5. 2%，用水煎煮提取三次，每次15倍量，I小時，合并提取液，減壓濃縮至藥材的2倍量，加95%乙醇至乙醇濃度達到80%，4°C醇沉12小時，過濾，取上清液，減壓濃縮至近干，得浸膏，浸膏用甲醇溶解，用浸膏等重量的100-120目硅膠拌樣，用浸膏等重量的200-300目硅膠分離，用氯仿-甲醇洗脫，得到含有牛蒡苷的餾分，合并含有牛蒡苷的餾分，濃縮后加95%乙醇結晶，得牛蒡苷30g，牛蒡苷含量大于90% ； 牛蒡苷元的制備方法如下取牛蒡子粗粉I. 0K，牛蒡苷含量5. 2%，加3倍量水，40°C溫孵4個小時，加95%乙醇和水調節成60%乙醇含量的10倍量提取液，加熱回流煎煮I小時，繼續用60%乙醇提取兩次，每次I小時，合并提取液，濃縮近干，經硅膠柱分離，用100目硅膠按樣品量I: I拌樣，200-300目硅膠I: I進行柱層析，氯仿-甲醇洗脫，合并含有牛蒡苷元的流分，用乙醇重結晶，得牛蒡苷元25g、牛蒡苷元含量大于93%。
3.根據權利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用，其特征在于采用多巴胺能人神經母瘤細胞株模型，證明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病的生物活性。
4.根據權利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用，其特征在于采用MTPT所致的C57BL/6小鼠模型，證明牛蒡苷及苷元具有抗帕金森病作用。
5.根據權利要求I所述的牛蒡苷及苷元在抗帕金森病中的應用，其特征在于所述牛蒡子苷及苷元可單獨或與其他藥物組合治療帕金森病。
全文摘要
牛蒡苷和牛蒡苷元為中藥牛蒡子中的主要活性成分。本發明公開了一種抗帕金森病的中藥牛蒡中活性成分牛蒡苷和苷元在抗帕金森方面的應用。通過體內和體外試驗結果表明表明牛蒡苷及其苷元具有較強的抗帕金森病作用。本發明中的牛蒡苷和苷元在抗帕金森病方面有較強的活性，副作用小，價格便宜。
文檔編號A61K131/00GK102895278SQ20121040202
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者竇德強, 李東薇, 康廷國 申請人:遼寧中醫藥大學