腫瘤細胞所導致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑的制作方法

專利名稱：腫瘤細胞所導致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及腫瘤細胞所導致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑。
背景技術：
已知調節T細胞在病理學上和生理學上都能抑制免疫反應，參與自身耐受和免疫自穩的維持(參照非專利文獻I)。例如，最初為⑶4+⑶25-的細胞受到各種因子的刺激而活化，其結果是⑶4+⑶25+調節T細胞在外周血的⑶4+T細胞中占到約5-10%。該⑶4+⑶25+調節T細胞在⑶4+T細胞分化的同時表達FoxP3蛋白(參照非專利文獻2、3)。該過程中，細胞間相互作用及TGF-β (本說明書中也記作TGF-b)和IL-10這樣的體液因子有著重要的作用(參照非專利文獻4)。該FoxP3蛋白不僅在⑶4+⑶25+T細胞中可見表達，在⑶8+⑶25+T細胞中也可見表達，因此被認為是調節T細胞活化的特異性標記物(參照非專利文獻5)。另外，如果在幼稚T細胞中強制表達FoxP3，則顯示出調節T細胞樣表型，這就表示FoxP3對于調節T細胞的功能發揮具有重要的作用(參照非專利文獻6)。由此可以認為，FoxP3基因是對調節T細胞的分化和功能進行控制的 主基因(參照非專利文獻I)。作為這些調節T細胞的功能，已知例外地通過抑制其它細胞的功能(參照非專利文獻7)來抑制免疫反應這一功能(參照非專利文獻I)。其機制不明，但提示了該功能依賴于細胞間相互作用，且有CTLA-4的參與(參照非專利文獻8)。尤其是顯示CTLA-4也參與調節T細胞的分化(參照非專利文獻8)。另一方面，已知雖然在癌癥患者的體內存在有攻擊癌以將其排除的宿主免疫，但在癌細胞一邊也具有逃避宿主免疫的監視的系統，例如，在體外和體內揭示了如果在癌細胞的存在下除去調節T細胞，則針對癌細胞的免疫反應會變化(參照非專利文獻17)。此夕卜，由于在胃癌(參照非專利文獻9、10)、直腸癌(參照非專利文獻11)、胰腺癌(參照非專利文獻12、13)、肺癌(參照非專利文獻14)、神經膠質瘤(參照非專利文獻17)中調節T細胞增加，因此可以認為調節T細胞參與了癌細胞的免疫逃避系統。但是其機制不明，對于來源于調節T細胞的細胞因子作出了何種貢獻尚存在爭議(參照非專利文獻17)。而且，由于調節T細胞的缺陷會引發嚴重的自身免疫疾病(參照非專利文獻15)，因此可以認為自身免疫和癌癥免疫存在共通的機制(參照非專利文獻16)。由此可知，調節T細胞通過免疫反應的抑制,不僅參與針對癌細胞的免疫抑制,還參與自身免疫或變態反應之類的過度免疫反應(參照非專利文獻I)。
非專利文獻I =Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007非專利文獻2:Fontenot 等 Nat.1mmunol.4, 330-336，2003非專利文獻3:Fontenot 等 Immunity 22, 329-341，2005非專利文獻4 =Zheng 等 J.1mmunol.172，5213-5221，2004非專利文獻5 =Bisikirska 等 J.Clin.1nvest.115，2904-2913，2005非專利文獻6 =Hori 等 Science 299，1057-1061，2003非專利文獻7 Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004非專利文獻8 =Atabani 等 Eur.J.1mmunol.35，2157-2162，2005非專利文獻9:Ichihara 等 Clin.Cancer Res.9, 4404-4408，2003非專利文獻10:ffolf 等 Clin.Cancer Res.9，606-612，2003非專利文獻11:Hicky 等 Semin.1mmunol.11, 125-137，1999非專利文獻12 =Liyanage 等 J.1mmunol.169，2756-2761，2002非專利文獻13 =Sasada 等 Cancer 98，1098-1099，2003
非專利文獻14:ffoo 等 Cancer Res.61，4766-4772，2001非專利文獻15:Sakaguchi 等 Immunol.Rev.182, 18-32，2001非專利文獻16 =Turk 等 Immunol.Rev.188，122-135，2002非專利文獻I7:Andaloussi 和 Lesniak Neuro-Oncology 8, 234-243, 2006發明的揭示通過在分子水平上闡明調節T細胞所導致的免疫抑制的作用機理，將其作為有調節T細胞參與的疾病的治療靶點，可以期待開發出針對有調節T細胞參與的疾病的有效的治療方法。于是，本發明的目的在于提供增強細胞中的FoxP3基因表達的基因表達增強劑、將細胞向調節T細胞分化誘導的細胞分化誘導劑、由它們的作用來抑制免疫的免疫抑制劑和過度免疫疾病治療劑、拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強的基因表達增強拮抗劑、拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導的細胞分化誘導拮抗劑、由它們的作用來解除免疫抑制的免疫抑制解除劑、腫瘤免疫激活劑及抗腫瘤劑等。已知鋒指轉錄因子Snail是癌癥的惡性化因子，Snail的表達越聞，癌癥就越是惡性化(Nature Rev Cancer 7, 415-428，2007)。認為其原因之一是因為=Snail通過抑制E-鈣粘著蛋白等細胞間粘附分子的表達，從而對個體發育中的原腸胚內陷或者組織及器官的發育過程、失去正常組織或細胞時的修復過程、癌細胞轉移的轉移過程等發生時的上皮一間充質轉換(EMT:Epithelial-mesenchymal transition)進行控制(Nature Rev Cancer 7,415-428,2007)。于是，本發明人認真努力地嘗試在培養細胞中強制表達Snail，闡明Snail導致癌癥惡性化的機理，結果發現，在癌細胞中，Snail蛋白增強MCPl (單核細胞趨化蛋白-1, monocyte chemoattractant protein-1)基因、TSP I (血小板反應蛋白-1,thrombospondin-l)基因、FSTLl (促濾泡素抑制素樣因子 I, Foil i statin-like I)基因或 IL_13Ra2(白細胞介素 13 受體 α 2, interleukin 13alpha 2receptor)基因的表達，對于⑶4+T細胞和⑶8+T細胞，它們的基因產物增強調節T細胞的活化標記物FoxP3的表達，從而完成了本發明。
由此，本發明的實施方式如下所述。(I) 一種基因表達增強劑，該基因表達增強劑增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，激活所述細胞的MCPl信號。(2) 一種基因表達增強劑，該基因表達增強劑增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，含有表達Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞。(3) 一種基因表達增強劑，該基因表達增強劑增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(4) (3)所述的基因表達增強劑，其特征在于，含有表達Snail蛋白的細胞或者分泌MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞的培養上清。(5)⑵或(4)所述的基因表達增強劑，其特征在于，所述細胞為腫瘤細胞。(6) 一種細胞分化誘導劑，該細胞分化誘導劑將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，激活所述細胞的MCPl信號。(7) 一種細胞分化誘導劑，該細胞分化誘導劑將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，含有表達Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞。(8) 一種細胞分化誘導劑，該細胞分化誘導劑將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(9) 一種免疫抑制劑，其特征在于，激活MCPl信號。(10) 一種免疫抑制劑，其特征在于，含有表達Snail蛋白的細胞或者表達MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細胞。(11) 一種免疫抑制劑，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白。(12) 一種過度免疫疾病治療劑，其特征在于，激活MCPl信號。(13) 一種過度免疫疾病治療劑，其特征在于，含有表達Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細胞。(14) 一種過度免疫疾病治療劑，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2 蛋白。(15) 一種基因表達增強拮抗劑，該基因表達增強拮抗劑拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強，其特征在于，抑制所述細胞的MCPl信號。(16) 一種基因表達增強拮抗劑，該基因表達增強拮抗劑拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(17) (15)或(16)所述的基因表達增強拮抗劑，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體。 (18) (16)所述的基因表達增強拮抗劑，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體。(19) 一種細胞分化誘導拮抗劑，該細胞分化誘導拮抗劑拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導，其特征在于，抑制所述細胞的MCPl信號。(20) 一種細胞分化誘導拮抗劑，該細胞分化誘導拮抗劑拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(21) (19)或(20)所述的細胞分化誘導拮抗劑，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體。(22) (20)所述的細胞分化誘導拮抗劑，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體。(23) 一種免疫抑制解除劑，其抑制MCPl信號。(24) 一種免疫抑制解除劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(25) 一種腫瘤免疫激活劑，其抑制MCPl信號。(26) 一種腫瘤免疫激活劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(27) 一種抗腫瘤劑，其抑制MCPl信號。(28) 一種抗腫瘤劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(29) 一種腫瘤增殖抑制`劑，其抑制MCPl信號或TSPl蛋白的功能。(30) 一種腫瘤細胞浸潤抑制劑，其抑制MCPl信號或FSTLl蛋白的功能。(31) 一種腫瘤轉移抑制劑，其抑制MCPl信號或FSTLl蛋白的功能。(32) 一種基因表達增強劑，該基因表達增強劑是細胞中的FoxP3基因、MCPl (monocyte chemoattractant protein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Folli statin-like I)基因或 IL_13Ra2 (interleukin 13alpha 2receptor)基因的基因表達增強劑，其特征在于，含有Snail蛋白活性增強物質。(33) (32)所述的基因表達增強劑，其特征在于，Snail蛋白活性增強物質是snail基因表達載體。(34) (32)所述的基因表達增強劑，其特征在于，所述細胞是Panc-1細胞。(35) 一種抗癌劑，該抗癌劑是血液癌癥的抗癌劑，其特征在于，含有拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質。(36) (35)所述的抗癌劑，其特征在于，所述拮抗物質拮抗snail基因的表達。(37) (35)或(36)所述的抗癌劑，其特征在于，血液癌癥是白血病。(38) 一種基因表達增強方法，該方法增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，包括激活所述細胞的MCPl信號的工序。(39) 一種基因表達增強方法，該方法增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，包括使所述細胞與表達選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白和分泌型IL-13Ra2蛋白的一種以上的蛋白的細胞接觸的工序。(40) (39)所述的基因表達增強方法，其特征在于，所述細胞是腫瘤細胞。(41) 一種基因表達增強方法，該方法增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，包括使所述細胞與選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白和分泌型IL-13Ra2蛋白的一種以上的蛋白接觸的工序。(42) (40)所述的基因表達增強方法，該方法增強細胞中的FoxP3基因的表達，其特征在于，包括使所述細胞與表達選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白和分泌型IL_13Ra2蛋白的一種以上的蛋白的細胞的培養上清接觸的工序。(43) (42)所述的基因表達增強方法，其特征在于，所述細胞是腫瘤細胞。(44) 一種細胞分化誘導方法，該方法將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，包括激活所述細胞的MCPl信號的工序。(45) 一種細胞分化誘導方法，該方法將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，包括使所述細胞與表達Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞接觸的工序。(46) 一種細胞分化誘導方法，該方法將細胞向調節T細胞分化誘導，其特征在于，包括使所述細胞與MC Pl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白接觸的工序。(47) 一種發生了過度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對所述患者給與激活MCPl信號的活化劑的工序。(48) 一種發生了過度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對所述患者給與表達Snail蛋白的細胞或者表達MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞的工序。(49) 一種發生了過度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對所述患者給與MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的工序。(50) 一種過度免疫疾病治療劑，其特征在于，激活MCPl信號。(51) 一種基因表達增強拮抗方法，該基因表達增強拮抗方法拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強，其特征在于，包括抑制所述細胞的MCPl信號的工序。(52) 一種基因表達增強拮抗方法，該基因表達增強拮抗方法拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強，其特征在于，包括抑制所述細胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(53) (51)所述的基因表達增強拮抗方法，其特征在于，使所述細胞與具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體接觸。(54) (52)所述的基因表達增強拮抗方法，其特征在于，使所述細胞與具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結合型IL-13Ra2抗體或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體接觸。(55) 一種細胞分化誘導拮抗方法，該細胞分化誘導拮抗方法拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導，其特征在于，包括抑制所述細胞的MCPl信號的工序。(56) 一種細胞分化誘導拮抗方法，該細胞分化誘導拮抗方法拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導，其特征在于，包括抑制所述細胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(57) (55)所述的細胞分化誘導拮抗方法，其特征在于，使所述細胞與具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體接觸。(58) (56)所述的細胞分化誘導拮抗方法，其特征在于，使所述細胞與具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結合型IL-13Ra2蛋白抗體或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2蛋白抗體接觸。(59) 一種解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內的MCPl信號的工序。(60) 一種解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(61) 一種腫瘤免疫激活方法，該方法是激活腫瘤免疫受到了抑制的患者體內的腫瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內的MCPl信號的工序。(62) 一種腫瘤免疫激活方法，該方法是激活腫瘤免疫受到了抑制的患者體內的腫瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(63) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內的MCPl信號的工序。(64) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，抑制所述患者體內的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。(65) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，抑制所述患者體內的TSPl蛋白的功倉泛。(66) 一種基因表達增強方法，該方法是細胞中的FoxP3基因、MCPl (monocytechemoattractant protein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Fol I i statin-1 i ke I)基因或 IL_ 13Ra2 (i nt erl eukin 13alpha 2receptor)基因的基因表達增強方法，其特征在于，包括使所述細胞與Snail蛋白活性增強物質接觸的工序。(67) (66)所述的基因表達增強方法，其特征在于，Snail蛋白活性增強物質是snail基因表達載體。(68) (66)所述的基因表達增強方法，其特征在于，所述細胞是Panc-1細胞。(69) 一種治療方法，該方法是患有血液癌癥的患者的治療方法，其特征在于，包括對所述患者給與拮抗Snail蛋白功能的拮抗物質的工序。(70) (69)所述的治療方法，其特征在于，所述拮抗物質拮抗snail基因的表達。(71) (69)所述的治療方法，其特征在于，血液癌癥是白血病。附圖的簡單說明

圖1是表不本發明的一個實施例中強制表達了 snail基因的Panc-1細胞的表型的表格。圖2A是表示本發明的一個實施例中通過與經TGF-β處理的Hs294T細胞的共培養來誘導⑶4+細胞中的FoxP3表達的圖。圖2B是表示本發明的一個實施例中通過與Panc-1細胞及F3細胞的共培養來誘導⑶4+細胞中的FoxP3表達的圖。圖2C是表示本發明的一個實施例中利用與Panc-1細胞、F3細胞及DlO細胞共培養后CD4+細胞來抑制T細胞增殖的圖。
圖3是表示本發明的一個實施例中通過與HCT116細胞的共培養來誘導CD4+細胞中的FoxP3表達的圖。圖4是表示本發明的一個實施例中利用snail基因強制表達克隆的細胞上清來誘導⑶4+細胞中的FoxP3表達的圖。圖5是表示本發明的一個實施例中Panc-1、HCT116、Hs294T各細胞株中因Snail蛋白強制表達而發生表達亢進的基因的圖。圖6是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL-13Ra2抗體來抑制F3克隆的⑶4+細胞中的FoxP3蛋白表達增強的圖。圖7A是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體或抗TSPl抗體來抑制F3克隆的⑶4+細胞、⑶4+⑶25+細胞和⑶4+⑶25-細胞中的FoxP3蛋白表達增強的圖。圖7B是表示本發明的一個實施例中利用抗FSTLl抗體來抑制F3克隆的CD4+細胞、⑶4+⑶25+細胞和⑶4+⑶25-細胞中的FoxP3蛋白表達增強的圖。圖8是表示本發明的一個實施例中利用抗IL_13Ra2抗體來抑制FoxP3蛋白表達增強的圖。圖9是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達增強的圖。圖10是表示本發明的一個實施例中MCP1、TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2的FoxP3蛋白表達增強作用的圖。圖11是表 本發明的一個實施例中由表達Snail的細胞產生的FoxP3蛋白的直接表達增強作用和間接表達增強作用的圖。圖12是表示本發明的一個實施例中利用snail基因強制表達克隆的細胞上清來誘導⑶8+細胞中的FoxP3表達的圖。圖13是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來抑制由F3細胞產生的CD8+細胞中的FoxP3蛋白表達增強作用的圖。圖14是表示本發明的一個實施例中利用抗IL_13Ra2抗體來抑制由Bll細胞產生的⑶8+細胞中的FoxP3蛋白表達增強作用的圖。圖15是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來抑制表達Snail的腫瘤細胞的增殖的圖。圖16是表示本發明的一個實施例中利用抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體來抑制表達Snail的腫瘤細胞的浸潤的圖。圖17A是表示本發明的一個實施例中通過RT-PCR來考察白血病細胞株中的snail表達的結果的圖。圖17B是表示本發明的一個實施例中利用snail基因特異性s iRNA來抑制白血病細胞的浸潤的圖。圖18是表示本發明的一個實施例中，抗MCPl抗體、抗IL_13Ra2抗體、抗IL-13抗體、抗IL-4抗體、抗CCR2抗體和抗IL-10抗體抑制由表達Snail的腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制的圖。圖19是表示使用對snail基因或MCPl基因具有特異性的s iRNA的體內治療實驗的結果(A:測得的腫瘤體積，B:肺轉移結節數，C:腫瘤內浸潤細胞的流式細胞儀分析)的圖。圖20是表示使用抗TSPl抗體的體內治療實驗的結果(A:測得的腫瘤體積，B:肺轉移結節數，C:腫瘤內浸潤細胞的流式細胞儀分析)的圖。實施發明的最佳方式下面，例舉實施例對基于上述發現而完成的本發明的實施方式進行詳細說明。實施方式和實施例中，沒有特別說明的情況下，采用J.Sambrook, E.F.Fritsch和T.Maniatis (編 )，《分子克隆實驗指南(第三版)(Molecular cloning, a laboratorymanual (3rd edition))》,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Pre ss),冷泉港(Cold SpringHarbor),紐約(2001) ; F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (編)，《現代分子生物學實驗技術(Current Protocol sin MolecularBiology))),約翰威立出版有限公司(John Wiley&SonsLtd.)等標準試驗方案集中記載的方法，或采用對其進行了修飾或變形的方法。此外，使用市售的試劑盒或測定裝置時，沒有特別說明的情況下，采用它們所附的試驗方案。還有，根據本說明書的記載，本發明的目的、特征、優點及其設想對本領域技術人員而言是顯而易見的，根據本說明書的記載，只要是本領域技術人員即可容易地再現本發明。以下記載的發明的實施方式及具體的實施例等是表示本發明的優選實施方式的例子，是為了舉例或說明而示出的。因此，本發明不受所記載的實施例的限定，本領域技術人員能夠顯而易見地掌握的所有形態均包含在本發明內。此外，在本說明書中揭示的本發明的意圖及范圍內，可基于本說明書的記載進行各種變形和修飾，這對本領域技術人員而言是顯而易見的，這些變形形態和修飾形態也包含在本發明內。==基因表達增強劑1.MCPUTSP1、FSTLl 和 IL_13Ra2 各基因==本發明的增強作為對象的細胞中的MCPl (monocyte chemoattractantprotein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Follistat in-likel)基因和IL-13Ra2 (interleukin 13alpha 2receptor)基因的表達的基因表達增強劑的特征在于，含有Snail蛋白活性增強物質。Snail蛋白活性增強物質是不僅增強Snail蛋白分子的固有活性、還在細胞內整體上增強Snail蛋白活性的物質即可，可以是任意物質，作為一例，可例舉可實現Snail蛋白的表達增強的NBSl強制表達載體(Yang等Oncogene, 26，1459-1467，2007)、snail基因的強制表達載體等。該基因表達增強劑的使用方法根據作為有效成分的Snail蛋白活性增強物質的性質來決定即可，如果是作用于作為對象的細胞的細胞膜的物質，則對細胞給藥即可，如果是通過細胞內的表達來起作用的物質,則需要導入細胞內。這里，作為基因表達增強的對象的細胞沒有特別限定，優選腫瘤細胞，特別優選Panc-1 細胞。==基因表達增強劑I1.FoxP3基因==本發明的增強作為對象的細胞中的FoxP3基因的表達的基因表達增強劑的特征在于，含有Snail蛋白活性增強物質。Snail蛋白活性增強物質是不僅增強Snail蛋白分子的固有活性、還在細胞內整體增強Snail蛋白活性的物質即可，無特別限定，作為一例，可例舉可實現Snail蛋白的表達增強的NBSl強制表達載體(Yang等Oncogene, 26，1459-1467，2007)、snail基因的強制表達載體等。該基因表達增強劑的使用方法是將用Snail蛋白活性增強物質增強了 Snail蛋白活性的細胞或該細胞的培養上清給與作為要增強FoxP3基因的表達的對象的細胞。例如，可以將這些細胞在體內或體外共培養，在作為對象的細胞位于生物體內的情況下，將增強了 Snail蛋白活性的細胞或該細胞的培養上清注入至作為對象的細胞附近即可。這里，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或⑶8+T細胞。==基因表達增強劑II1.FoxP3基因==本發明的增強作為對象的細胞中的FoxP3基因的表達的基因表達增強劑的特征在于，激活作為對象的細胞和/或與作為對象的細胞共存的其它細胞中的MCPl信號。作為基因表達增強劑所含的有效成分，考慮例如表達Snail蛋白的細胞、表達MCPl的細胞、MCPl蛋白、MCPl受體活化物質等，具體可例舉分泌MCPl的腫瘤細胞、導入了MCPl基因的強制表達載體的細胞、分泌MCPl蛋白的細胞的培養上清、高純度MCPl蛋白、激活MCPl受體的抗MCPl受體抗體等。此外，本發明的增強作為對象的細胞中的FoxP3基因的表達的基因表達增強劑也可含有表達Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細胞，或者含有FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。此時，作為基因表達增強劑，具體可使用表達Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的腫瘤細胞，導入了編碼Snail、FSTL1、膜結合型IL-13Ra2或分泌型IL_13Ra2的基因的強制表達載體的細胞，表達Snail蛋白的細胞的培養上清，分泌FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細胞的培養上清，高純度的FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。`還有，基因表達增強劑可以含有上述物質中的一種，也可以含有多種。作為這些基因表達增強劑的使用方法，例如向作為對象的細胞直接給與基因表達增強劑即可。此時，可以使該細胞與其它細胞共存，作為共存的細胞，優選具有向T細胞遞呈抗原而使其增殖的作用的樹突狀細胞或巨噬細胞等抗原遞呈細胞。此外，也可以向除作為對象的細胞以外的其它細胞給與基因表達增強劑，將該細胞的培養上清給與作為對象的細胞。作為這里所用的細胞，優選樹突狀細胞或巨噬細胞等抗原遞呈細胞。這里，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或⑶8+T細胞。==細胞分化促進劑、免疫抑制劑==FoxP3蛋白是對具有免疫抑制功能的調節T細胞的分化和功能進行控制的主基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007;Hori 等 Science299，1057-1061，2003; Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004;)。因此，上述的增強FoxP3基因的表達的基因表達增強劑可作為用于將作為對象的細胞向調節T細胞分化誘導的細胞分化誘導劑和免疫抑制劑使用。實際上，含有表達snail基因的細胞的FoxP3基因表達增強劑使共培養的⑶4+細胞獲得T細胞的增殖抑制能力，這也表明FoxP3基因表達增強劑可用作細胞分化誘導劑和免疫抑制劑。
還有，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或⑶8+T細胞。還有，這些細胞分化促進劑和免疫抑制劑可以在體內使用，也可以在體外使用。此外，免疫抑制劑可以抑制過度免疫，也可以抑制正常免疫。==過度免疫疾病治療劑==調節T細胞的功能下降會引發自身免疫或變應性疾病等過度免疫疾病(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13, 108-116, 2007;Turk 等 Immunol.Rev.188，122-135，2002)。因此，通過將作為對象的T細胞向調節T細胞分化誘導，藉此抑制免疫，從而可治療這些過度免疫疾病。因此，上述細胞分化誘導劑和免疫抑制劑可用作自身免疫或變應性疾病等的過度免疫疾病治療劑。這里，過度免疫疾病是因調節T細胞的功能下降而引發的疾病即可，不限于自身免疫或變應性疾病。還有，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或CD8+T細胞。過度免疫疾病治療劑的使用方法可適當決定，對于患者，較好是全身給藥或在發生過度免疫的部位直接給藥。==FoxP3基因表達增強拮抗劑==本發明的拮抗作為對象的細胞中的FoxP3基因的表達增強的FoxP3基因表達增強拮抗劑的特征在于，抑制作為對象的細胞和/或與作為對象的細胞共存的細胞的MCPl信號。作為該基因表達增強拮抗劑所含的有效成分，抑制例如MCPl蛋白或MCPl受體的功能即可，具體可例舉拮抗它們的功能的拮抗抗體、分泌該拮抗抗體的雜交瘤、表現出拮抗活性的低分子化合物等。 此外，本發明的FoxP3基因表達增強拮抗劑的特征也可以在于，抑制FSTLl蛋白、膜結合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。該基因表達增強拮抗劑所含的有效成分可例舉例如具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體等。作為這些基因表達增強拮抗劑的使用方法，只要在體內或體外對作為對象的細胞或其附近給藥即可。但是，在FoxP3基因表達增強拮抗劑通過抑制與作為FoxP3基因表達增強拮抗的對象的細胞共存的細胞的MCPl信號來顯現效果的情況下，基因表達增強拮抗劑以作用于該共存細胞的方式給藥。這里，該共存細胞可考慮樹突狀細胞或巨噬細胞等抗原遞呈細胞等。這里，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或⑶8+T細胞。==細胞分化誘導拮抗劑、免疫抑制解除劑==如上所述，FoxP3蛋白是對具有免疫抑制功能的調節T細胞的分化和功能進行控制的主基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007;Hori 等 Science299，1057-1061，2003; Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004;)。因此，如果抑制FoxP3蛋白的表達增強，則可拮抗作為對象的細胞向調節T細胞的分化誘導，進而可解除調節T細胞所導致的免疫抑制。由此，上述的抑制FoxP3基因的表達增強的基因表達增強拮抗劑可用作拮抗作為對象的細胞向調節T細胞的分化誘導的細胞分化誘導拮抗劑和免疫抑制解除劑。作為細胞分化誘導拮抗劑和免疫抑制解除劑的使用方法，只要在體內或體外對作為拮抗向調節T細胞的分化誘導的對象的細胞或其附近給藥即可。但是，細胞分化誘導拮抗劑和免疫抑制解除劑通過抑制與作為對象的細胞共存的細胞的MCPl信號來顯現效果的情況下，以作用于該共存細胞的方式給藥。這里，該共存細胞可考慮樹突狀細胞或巨噬細胞等抗原遞呈細胞等。還有，作為對象的細胞沒有特別限定，優選T細胞，更優選幼稚T細胞、CD4+T細胞或⑶8+T細胞。還有，這些細胞分化誘導拮抗劑和免疫抑制解除劑可以在體內使用，也可以在體外使用。==腫瘤免疫激活劑、抗腫瘤劑==本發明人發現，在腫瘤細胞中，Snail蛋白增強MCPl基因、TSPl基因、FSTLl基因和IL-13Ra2基因的表達，它們的基因產物直接和間接地作用于⑶4+T細胞和⑶8+T細胞，增強調節T細胞的活化標記物FoxP3的表達。即，發現腫瘤細胞通過MCPl蛋白、TSPl蛋白、FSTLl蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白等腫瘤免疫抑制中間蛋白影響周圍的免疫細胞，使該免疫細胞分化成調節T細胞，藉此抑制宿主的癌癥免疫。基于該事實，拮抗這些中間蛋白的作用的本發明的FoxP3基因表達增強拮抗劑可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制，激活腫瘤免疫。如果激活患者本身的腫瘤免疫,則患者可獲得腫瘤的治療效果。因此，本發明的FoxP3基因表達增強拮抗劑可用作腫瘤免疫激活劑和抗腫瘤劑。這里，作為拮抗腫瘤免疫抑制中間蛋白的功能的拮抗物質，可例舉腫瘤免疫抑制中間蛋白的抗體或競爭性抑制分子(顯性負相突變體)等。實際上，如果是普通的腫瘤細胞，則會被包括樹突狀細胞等抗原遞呈細胞在內的吞噬細胞吞噬而被消化排除，雖然表達Snail的腫瘤細胞拮抗該吞噬作用，但拮抗中間蛋白的作用的拮抗物質可抑制表 達Snail的腫瘤細胞所導致的吞噬作用拮抗。腫瘤免疫激活劑和抗腫瘤劑的使用方法可適當決定，對于患者，較好是在腫瘤部位或其附近直接給藥。==腫瘤增殖抑制劑==本發明的腫瘤增殖抑制劑通過抑制MCPl信號或TSPl蛋白的功能來抑制該腫瘤細胞的增殖。腫瘤增殖抑制劑含有例如MCPl蛋白、MCPl受體、或者拮抗TSPl蛋白的功能的拮抗抗體或分泌該拮抗抗體的雜交瘤作為有效成分。腫瘤增殖抑制劑的使用方法可適當決定，對于患者，較好是全身給藥或者在腫瘤部位或其附近直接給藥。==腫瘤細胞浸潤抑制劑、腫瘤轉移抑制劑==本發明的腫瘤細胞浸潤抑制劑通過抑制MCPl信號或FSTLl蛋白的功能來抑制該腫瘤細胞的浸潤。腫瘤細胞發生轉移時會浸潤于正常細胞間或形成血管壁的細胞間。因此，通過抑制腫瘤細胞的浸潤，可抑制腫瘤的轉移。因此，腫瘤細胞浸潤抑制劑可用作腫瘤轉移抑制劑。本發明的腫瘤細胞浸潤抑制劑和腫瘤轉移抑制劑含有例如MCPl蛋白、MCPl受體、或者拮抗FSTLl蛋白的功能的拮抗抗體或分泌該拮抗抗體的雜交瘤、MCPl的顯性負相突變體(7ND)作為有效成分。腫瘤轉移抑制劑的使用方法可適當決定，對于患者，較好是全身給藥或者在腫瘤部位或其附近直接給藥。還有，對于上述本發明的所有藥劑，作為治療對象的腫瘤沒有特別限定，可以是實體癌，也可以是血液癌癥，還可以是上皮性的癌或除此以外的惡性腫瘤。==針對血液癌癥的抗癌劑==本發明的針對血液癌癥的抗癌劑是含有拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質的抗癌劑。這里，拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質不僅是拮抗Snail蛋白分子的固有活性的低分子化合物和蛋白質(顯性負相突變體)等，只要是在細胞內整體上拮抗Snail蛋白的功能的物質即可，無特別限定，作為一例，可例舉拮抗Snail蛋白的表達的核酸(反義RNA、siRNA, shRNA等)、這些核酸的強制表達載體、競爭性抑制蛋白等。該抗癌劑較好是通過拮抗癌化血液細胞的浸潤來發揮其功能。還有，至今為止，完全不知道血液癌癥和Snail的關系。即使認為Snail的表達與腫瘤的轉移相關，這也是因為其對實體癌等中可見的E-鈣粘著蛋白等細胞間粘附分子進行控制，關于懸浮類的血細胞的癌，Snail的參與是本領域技術人員所無法預見的。這里，作為血液癌癥沒有特別限定，可例舉例如白血病、惡性淋巴瘤、多發性骨髓瘤。
實施例[IJPanc-1細胞中的snail基因的強制表達〈目的〉在人胰腺癌細胞株Panc-1細胞中強制表達snail基因，對于Snail的表達得到了增強的細胞克隆D6、DIO、F3、F5，考察與細胞的形狀、Snail和E-鈣粘著蛋白的mRNA和蛋白質的表達水平、細胞增殖能力、細胞粘附能力、細胞遷移能力、細胞浸潤能力相關的表型。<實驗方法>(I) snail基因的強制表達載體的制作及其導入由經已知為EMT誘導劑之一的TGF- β刺激后的Panc-1細胞通過PCR擴增snailcDNA(CDS 71-865，795bp)，插入具有G418抗性基因的pcDNA3.1 (+)質粒載體(英杰公司(Invitrogen社))的限制酶EcoR1-Xho I位點。通過電穿孔將其導入腫瘤細胞株，培養2周后用G418(2mg/mL)篩選抗藥性細胞，對細胞進行克隆。(2)利用RT-PCR進行的導入snail基因的細胞株的基因表達分析用RNeasy (凱杰公司(QIAGEN社))從人腫瘤細胞株中提取RNA，用AMV逆轉錄(420C.50 分一70°C.15 分)，采用所得 cDNA 進行 PCR(iCycler，伯樂公司(BIO-RAD 社))。針對snail cDNA的引物的序列如下。正向(Forward)5’-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3’(序列編號 I)反向(Reverse)5’ -ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3’ (序列編號 2)(3)利用免疫組化染色進行的導入 snail基因的細胞株的蛋白質表達分析為考察腫瘤細胞中的蛋白質的表達水平，將腫瘤細胞(5X104個)在載玻片室(slide chamber)內培養過夜(37°C, 5% CO2),用4%低聚甲醒固定。采用正常山羊血清的非特異性染色的封閉處理后，為進行細胞內染色而用Cytofix/Cytoperm(BD制藥公司(BDPhermingen社))處理(4°C、20分鐘)，然后用各種抗體(例如抗Snail抗體(圣克魯茲公司(SANTA CRUZ 社))+Alexa488 標記抗山羊 IgG(分子探針公司(Molecular Probes 社))、或抗E-1丐粘著蛋白抗體(BD生命科學公司(BDBioscience社))+Alexa568標記抗小鼠IgG(分子探針公司))于4°C染色I小時。然后用Vecter Shield(載體實驗室公司(VectorLaboratories社))將細胞封入，用突光顯微鏡(LSM 5PASCAL,卡爾蔡司公司(Carl Zeiss社))觀察、攝像。〈結果〉圖1A中，將導入snail基因的細胞株的表型匯總于表中。雖然在作為親細胞株的Panc-1細胞中也可見Snail蛋白的固有的表達，但通過導入snail基因的強制表達載體，表中所示的克隆中的Snail蛋白的表達水平亢進。其結果是，各克隆中，細胞形狀均從球狀(round)變成了扁平的紡錘形(spi ndl e/spreadi ng),在體外和體內細胞增殖能力(proliferation)均下降，E-1丐粘著蛋白(E-cadherin)的蛋白水平和細胞粘附能力(Adhesion)均下降，細胞遷移能力(migration)和細胞浸潤能力(Invas ion)均亢進。特別是在克隆F3中，由于觀察到了與上皮一間充質轉換(EMT)相關的顯著效果，因此在以下實施例中使用F3。[2]通過與Hs294T細胞的共培養來誘導CD4+細胞中的FoxP3表達〈目的〉揭示通過將經TGF-β處理的人黑色素瘤Hs294T細胞與PBMC共培養，在PBMC中的⑶4+細胞中發生FoxP3蛋白的表達增強，FoxP3蛋白的表達因snai I基因的下調(knockdown)而消失。<實驗方法> (I)腫瘤細胞的TGF-β處理采用6孔板，在人黑色素瘤Hs294T細胞的培養基中以2 μ g/3 X IO5個/2mL的量添加下述的snail基因特異性s iRNA(英杰公司)或者作為陰性對照的其無義序列的寡核苷酸，然后進行培養。2天后，洗滌這些細胞后，添加TGF-β (5ng/mL)，再培養3天。Snail基因特異性siRNA#l的序列正向5’ -GCGAGCUGCAGGACUCUAA-3’ (序列編號 3)反向5’ -UUAGAGUCCUGCAGCUCGC-3’ (序列編號 4)snail基因特異性siRNA#2的序列正向5’ -CCCACUCAGAUGUCAAGAA-3’ (序列編號 5)反向5’ -UUCUUGACAUCUGAGUGGG-3’ (序列編號 6)siRNA對照的序列正向5’ -GCGCGUCAGGACUCGAUAA-3’ (序列編號 7)反向5’ -UUAUCGAGUCCUGACGCGC-3’ (序列編號 8)(2)利用RT-PCR進行的腫瘤細胞的基因表達分析回收腫瘤細胞，與[I]中同樣地通過RT-PCR測定snail基因的表達。同時，用下述引物測定作為用于進行表達定量的對照的GAPDII基因的表達。正向5’ -GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3’ (序列編號 9)
反向5’ -ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3’ (序列編號 10)(3)人外周血細胞(PBMC)的分離采集健康人的血液并添加1/10量的4%檸檬酸鈉后，使其在菲可(Ficoll)(比重1.090)中分層，離心分離(1500rpm、20分鐘、室溫)，將存在于中間層的細胞組分用作“(成團(bulk))PBMC”。(4) PBMC和腫瘤細胞(Hs294T細胞)的共培養預先通過用MMCdOO μ g/mL、2小時、37°C )處理或照射X射線(20K rad)來使所得腫瘤細胞失活。PBMC和腫瘤細胞以1:10的比例(例如，96孔板的情況下為I X IO5個PBMC和IXlO4個腫瘤細胞，24孔板的情況下為5 X IO5個PBMC和5 X IO4個腫瘤細胞)接種于板，在37°C、5% CO2的條件下共培養，3 5天后回收PBMC。(5)FoxP3蛋白的表達分析

首先使所得PBMC與市售的抗CD4抗體(BD制藥公司)和抗CD25抗體(BD制藥公司)反應I小時。接著，為進行細胞內染色而用Cytofix/Cytoperm(BD制藥公司)處理(4°C、20分鐘)，用抗FoxP3抗體(電子生命科學公司(eBioscienc e社))于4°C反應I小時，然后用流式細胞儀FACScan (碧迪公司(Becton Dickinson社))對CD4+或CD4+CD25+細胞組分進行門選(gating),考察FoxP3的表達水平。< 結果 >圖2A所不為snail基因的表達和FoxP3的表達的考察結果。如果對人黑色素瘤Hs294T細胞進行TGF-β處理，則snail基因的表達亢進(圖中的對照)，利用snail基因特異性siRNA可抑制其表達。此時，⑶4+細胞組分中表達FoxP3的細胞的比例與未經TGF-β處理時(25% )相比，在處理后有所增加(31% )，如果用snail基因特異性siRNA抑制snail基因的表達，則無論是否有TGF-β處理，⑶4+細胞組分中表達FoxP3的細胞的比例均有所減少(無處理:25%— 17%，有處理:31%—20% )。這就表示⑶4+細胞中的FoxP3的表達亢進是由Hs294T細胞中的snail基因的表達亢進導致的。[3]通過Panc-1細胞和F3細胞或DlO細胞的共培養來誘導⑶4+細胞中的FoxP3表達并獲得T細胞增殖抑制活性〈目的〉揭示通過將PBMC與F3細胞或DlO細胞共培養，PBMC中的⑶4+細胞中發生FoxP3蛋白的表達增強，且CD4+細胞獲得抑制T細胞增殖的活性。<實驗方法>(I) PBMC和腫瘤細胞(Panc-1細胞或F3細胞)的共培養采用Pacn-1細胞或F3細胞，通過與[2]相同的方法進行與PBMC的共培養。⑵⑶4+細胞和新鮮T細胞的共培養使與腫瘤細胞共培養了 3 5天后的PBMC在菲可(比重1.090)中分層，離心分離(1500rpm、20分鐘、室溫)采集存在于中間層的細胞組分并洗滌后，加入磁珠結合抗⑶4抗體(MACS抗體，美天旎生物技術公司(Miltenyi Biotec社))，于4°C反應30分鐘，用MACS細胞自動分離機(美天旎生物技術公司)分離CD4+細胞。另一方面，作為用于觀察T細胞增殖反應的材料，通過與[2]相同的方法從同一健康人中重新制備PBMC，通過與上述相同的方法用MACS抗體(抗⑶4抗體或抗⑶8抗體)分離T細胞(⑶4+細胞或⑶8+細胞)。在該新鮮T細胞(2 X IO5個)中加入抗⑶3抗體(終濃度I μ g/mL)以及從事先與腫瘤細胞一起培養的PBMC中分離的⑶4+細胞(2 X IO5個)，在96孔板中培養4天。加入1/10量的Premix WST-1溶液(寶生物公司(夕力5 才社))，再培養24小時，然后用酶標儀測定吸光度(450-655nm)，將該數值作為T細胞的增殖量。(3) FoxP3蛋白的表達分析與[2]中記載的方法同樣地考察FoxP3蛋白的表達。< 結果 >(l)FoxP3蛋白的表達分析圖2B所示為FACS分析的結果。上部(淋巴細胞中的⑶4+⑶25+)是根據⑶4和⑶25的表達來劃分細胞的結果，圖中的數字表示淋巴球組 分中的⑶4+⑶25-(左)或⑶4+⑶25+(右)的細胞所占的比例(% )0下部(⑶4+組分中的FoxP3+)表示⑶4+細胞組分中的FoxP3+蛋白的表達水平(各圖中FoxP3蛋白的表達水平沿著X軸升高)，圖中的數字表示存在于根據與所使用的FoxP3抗體的同種型對照(Isotypecontrol)(大鼠IgG2a)的比較分析被判斷為表達陽性的范圍內的⑶4+細胞組分中的FoxP3+細胞所占的比例(％ )。對于CD4+細胞，和未與腫瘤細胞共培養的情況(圖中的無腫瘤(Notumor):FoxP3的表達水平為14.56)相比，通過與未強制表達snail的Panc-1細胞共培養(圖中的親代(Parent):30.83)，可見FoxP3的表達增強。但是，如果與強制表達snail基因的F3細胞共培養(圖中的F3:43.44),FoxP3的表達進一步增強。該結果表明，snail基因的表達水平與FoxP3的表達增強能力相關。如上所述，表達snail基因的細胞使共培養的⑶4+細胞的FoxP3蛋白的表達增強。此外，如果強制表達snail基因，使Snail蛋白的表達水平亢進，則FoxP3蛋白的表達增強能力也亢進。還有，如果向F3細胞導入對snail基因具有特異性的s i RNA來抑制snail基因的表達，則FoxP3的表達增強能力下降，由此可以確認，FoxP3的表達增強能力不是因克隆間的差異等而產生的人為偏差，實際上是snail基因的強制表達的結果。(2) CD4+細胞與T細胞的共培養圖2C所示為各T細胞的增殖測定的結果(左圖為⑶4+T細胞，右圖為⑶8+T細胞)。還有，無(None)表示未添加抗CD3抗體也未添加CD4+細胞的T細胞增殖的單純的背景值。此外，作為陽性對照，未添加CD4+細胞而只添加抗CD3抗體的T細胞的增殖在CD4+細胞和⑶8+細胞中均顯示出2.0以上的值(圖中未表示)。即使與Panc-1細胞共培養，T細胞的增殖也受到強烈抑制(圖中的親代(Prt)或模擬物(Mock)為I 1.5)，但將T細胞與DlO細胞及F3細胞共培養時受到更強烈的抑制，可見顯著的抑制效果(P〈0.001)。如上所述，表達snail基因的細胞使共培養的CD4+細胞獲得T細胞的增殖抑制能力，即，可使其向調節T細胞分化誘導。[4]通過與HCTl 16細胞的共培養來誘導CD4+細胞中的FoxP3表達〈目的〉
用人結腸癌細胞株HCT116代替Panc-1細胞，進行與[I] [2]相同的實驗。實驗方法與[I] [2]相同。〈結果〉圖3所示為FACS分析的結果。和未與腫瘤細胞共培養的情況(圖中的無腫瘤:FoxP3的表達水平為20.42)相t匕，即使與未強制表達Snail的HCTl 16細胞共培養，FoxP3的表達也不增強(圖中的親代:18.30)。但是，如果與強制表達snail基因的Bll克隆共培養，則FoxP3的表達增強(圖中的Bll:44.79)。如上所述，在多種癌癥中觀察到snail基因的表達水平與FoxP3的表達增強能力的相關性。[5]利用snail基因強制表達克隆的細胞培養上清來誘導⑶4+細胞中的FoxP3表達〈目的〉揭示不僅是F3細胞，F3細胞的細胞培養上清也能增強⑶4+細胞的FoxP3蛋白表達。< 方法 >(1)培養上清的制備方法將1 X IO5個腫瘤細胞在25cm2的燒瓶中培養3 4天，將其培養上清轉移至另一試管，高速離心(3000rpm、20分鐘、4°C )分離后，將其上清作為培養上清。4°C保存至用于實驗。

(2)使用培養上清的處理方法使用24孔板，將等容量比的5 X IO5個PBMC (或其中的一組分)的懸浮液和腫瘤細胞的培養上清、即2倍稀釋的腫瘤細胞的培養上清于37°C、5% CO2的條件下培養3 4天，然后回收該PBMC。還有，作為陰性對照，用未進行培養的培養基代替腫瘤細胞的培養上清進行同樣的實驗。(3)其它與[2]同樣地進行FoxP3蛋白的表達分析。< 結果 >圖4所示為FACS分析的結果。對于⑶4+細胞(圖A上部)、⑶4+⑶25-細胞(圖A下部)、⑶4+⑶25+細胞(圖B)，親細胞株(圖A中的親代-上清(Prt-sup)，圖B中的親代)和導入Snail的細胞(圖A中的D6-snail+等、圖B中的Snail-Tr)的培養上清與單純使用培養基的情況(圖A中的培養基(Medium),圖B中的無刺激物(No stimulant))相比,均能增強FoxP3蛋白的表達。這就表明由Snail蛋白的表達產生的FoxP3蛋白表達的增強作用是體液因子介導的。如上所述,表達Snail蛋白的細胞的培養上清也可用作FoxP3蛋白表達的增強劑。還有，⑶ 4+⑶25+細胞有時也會進行向調節T細胞的分化而具有最大限度的FoxP3蛋白表達，因此有時無法獲得表達Snail的細胞的上清的效果(參照后述圖6)。

[6]因Panc-1、HCT116、Hs294T各細胞株中的Snail蛋白強制表達而發生表達亢進的基因〈目的〉
揭示在Panc-1、HCT116和Hs294T中，通過Snail蛋白的強制表達，MCPU TSPUFSTLl或分泌型IL-13Ra2的表達亢進。< 方法 >(l)MCPl、TSPl、FSTLl或分泌型IL_13Ra2的表達水平的測定方法對于MCPl (ELISA 試劑盒:內生公司(END0GEN 社)制 #EHMCP1)、TSPl (ELISA 試劑盒:貴彌功公司(CHEMIC0N社)制#CYT168)、分泌型IL_13Ra2 (ELISA試劑盒:艾碧康公司(ABCAi^i )制#ab46112)的蛋白的表達，用市售的ELISA試劑盒按照所附的試驗方案進行檢測。還有，作為陰性對照，用未進行細胞培養的培養基進行同樣的實驗。此外，FSTLl的基因表達按照[I]所示的RT-PCR法測定。引物采用以下的寡核苷酸。還有，作為陰性對照(NC)，在不添加mRNA的條件下進行同樣的實驗。正向2 5’-GCACAGGCAACTGTGAGAAA-3’(序列編號 11)反向2 5’-CATAGTGTCCAAGGGCTGGT-3’(序列編號 12)(2) IL-13Ra2蛋白的細胞內局部分布的檢測方法腫瘤細胞中的膜結合型以及存在于細胞內/核內的IL_13Ra2的表達與Snail蛋白的表達同樣地按照[I] (3)所示的免疫染色法進行。< 結果 >結果示于圖5。(A)所示為MCPUTSP1和sIL_13Ra2 (分泌型)的蛋白表達水平的比較結果，(B)所示為FSTLl的mRNA表達水平的比較結果。此外，(C)所示為各腫瘤細胞中的IL-13Ra2的局部分布。在各強制表達Snail的克隆(D6、DIO、F3、F5)中，上述細胞因子的表達與親代(Prt)相比均有所亢進。此外，不僅是分泌型(圖5A)IL-13Ra2的表達亢進，如圖5C所示，在各克隆中，在細胞膜或細胞質內以及核內，IL-13Ra2的表達均亢進。如上所述，通過增強Snail蛋白的活性，可增強MCP1、TSP1、IL_13Ra2、FSTLl的表達。[7]利用針對MCPl、TSPl、FSTLl、IL_13Ra2各蛋白的抗體來抑制F3克隆所導致的FoxP3蛋白表達增強〈目的〉揭示針對MCP1、TSPU FSTLU IL_13Ra2各蛋白的抗體可拮抗F3克隆的FoxP3蛋白表達增強作用。< 方法 >(I)本實施例中所用的抗體采用市售的抗MCPl抗體(BD制藥公司制#551226)、抗TSPl抗體(艾碧康公司制#ab3131)、抗FSTLl抗體(安迪公司(R&D社)制#MAB1694)、抗TGF-β I抗體(安迪公司制#ΜΑΒ246)、抗IL-10抗體(安迪公司制#ΜΑΒ2171)、抗IL_13Ra2抗體(安迪公司制#AF146)、小鼠IgG抗體(BD制藥#557273)。(2)添加有抗體的培養上清的回收以I 5μ g/mL的終濃度在失活的腫瘤細胞中 直接添加或在其培養基中添加抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體、抗IL13Ra2抗體，與PBMC —起培養3天，回收該PBMC。作為陽性對照，采用抗TGF- β I抗體、抗IL-10抗體，作為陰性對照，采用小鼠I gG抗體。(3)其它腫瘤細胞的培養上清的制備方法和FoxP3蛋白的表達分析與[5]同樣地進行。< 結果 >圖6所示為使用各抗體時的CD4+細胞中的FoxP3蛋白的表達水平的測定結果。此夕卜，圖7所示為使用各抗體時的⑶4+細胞、⑶4+⑶25+細胞、⑶4+⑶25-細胞中的FoxP3蛋白的表達水平的測定結果。已知TGF-b和IL-10參與FoxP3蛋白的表達誘導，這里，對于CD4+細胞、CD4+CD25+細胞、⑶4+⑶25-細胞中的任一種，抗TGF-b抗體和抗IL-10抗體也均抑制F3克隆的培養上清的FoxP3蛋白的表達增強能力。例如，通過給與抗TGF-b抗體(圖中的抗TGF-b (Ant1-TGF-b))，對于CD4+細胞，FoxP3蛋白的表達水平從35.34降至23.43 (圖6)或者從38.39降至30.63 (圖7)，對于⑶4+⑶25+細胞，FoxP3蛋白的表達水平從38.39降至28.86，對于CD4+CD25-細胞，FoxP3蛋白的表達水平從35.66降至28.41。此外，抗IL-10抗體的情況(圖中的抗IL-1O(Ant1-1L-1O))也同樣，分別降至11.42 (圖6)或30.88 (圖7) (CD4+ 細胞)、29.89 (CD4+CD25+ 細胞)、28.05 (CD4+CD25-細胞)。另一方面，給與抗MCPl抗體的情況下(圖中的抗MCPl (Ant1-MCPl))，也分別降至16.27 (圖 6)或 22.89 (圖 7) (CD4+ 細胞)、22.08 (CD4+CD25+ 細胞)、19.02 (CD4+CD25-細胞)，抗TSPl抗體(圖中的抗TSPl (Ant1-TSPl))也同樣，分別降至9.26 (圖6)或21.35(圖7) (CD4+ 細胞)、27.78 (CD4+CD25+ 細胞)、16.56 (CD4+CD25-細胞)。給與抗 FSTLl 抗體的情況下(圖中的抗FSTLl (Ant1-FSTLl))，其效果較弱，但即使如此，也分別降至14.86(圖6)或 34.67 (圖 7) (CD4+細胞)、29.85 (CD4+CD25+細胞)、32.64 (CD4+CD25-細胞)。給與抗IL13Ra2抗體的情況下(圖中的抗IL13Ra2 (Anti_IL13Ra2))，從35.34降至11.86 (圖6)(⑶4+細胞)。這就表明抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL13Ra2抗體抑制培養上清的FoxP3蛋白表達增強能力`。此外，同時使用了抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL13Ra2抗體，結果表明⑶4+細胞中的抑制效果最強(35.34降至8.54)(圖6)，這些細胞因子均對F3克隆的培養上清中的FoxP3蛋白的表達增強作用作出過剩(redundant)的貢獻。因此，拮抗MCP1、TSPU FSTLl的功能的物質可拮抗表達Snail的細胞所具有的FoxP3蛋白表達增強能力。[8]利用抗IL_13Ra2抗體來抑制FoxP3蛋白表達增強〈目的〉揭示抗IL_13Ra2抗體可拮抗由Bll克隆產生的FoxP3蛋白表達增強活性< 方法 >除抗體使用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體、腫瘤細胞使用Bll克隆以外，與[7]同樣地進行實驗。這里，使用抗IL-13抗體作為拮抗FoxP3表達增強活性的陽性對照。< 結果 >圖8所示為使用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體的結果。抗MCPl抗體使經Bll克隆的培養上清增強的FoxP3蛋白表達從23.69 (無抗體；圖中的無抗體(No mAbs))降至4.69 (給與抗體；圖中的抗MCT (Ant1-MCT))，抗IL_13Ra2抗體使其降至7.60 (給與抗體；圖中的抗IL-13Ra2 (Anti_IL13Ra2))。如上所述，這些抗體可拮抗Bll克隆的培養上清的表達增強活性。還有，之所以未見抗IL-13Ra2抗體針對親代細胞HCT116細胞的效果，是因為HCT116細胞不表達Snail。如上所述，不僅是拮抗MCPl的功能的物質，拮抗IL13Ra2的功能的物質也可拮抗表達Snail的細胞所具有的FoxP3蛋白表達增強能力。[9]利用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達增強〈目的〉揭示抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體拮抗小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達增強活性。〈方法〉(I)脾臟細胞的制備方法作為免疫細胞，用小鼠脾臟細胞代替成團PBMC。首先，從小鼠體內取出脾臟，勻漿后與成團PBMC同樣地用菲可分離細胞懸浮液，使用位于中間層的細胞組分。⑵其它基本上與人培養細胞同樣地進行，但對于人細胞，共培養或培養上清存在下的培養進行3 4天，而對于小鼠黑色素瘤，共培養或培養上清存在下的培養進行5 6天。〈結果〉

圖9(上部)所示為使用抗MCPl抗體、抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體的結果。作為陰性對照，采用小鼠IgG，作為陽性對照，采用抗TGF-b抗體和抗IL-10抗體。用抗TSPl抗體未能抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達增強作用，但如圖所示，抗MCPl抗體和抗IL-13Ra2抗體抑制了 28 45%左右的FoxP3蛋白表達增強作用。如上所述，FoxP3蛋白表達增強作用的抑制不僅在人腫瘤細胞中可見其效果，在小鼠腫瘤細胞中也可見其效果。[101MCPU TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2各細胞因子的FoxP3蛋白的表達增強作用〈目的〉揭示MCP1、TSP1、FSTL1或分泌型IL_13Ra2各細胞因子使CD4+細胞的FoxP3蛋白的表達增強。< 方法 >除使用以Ing/mL的濃度添加有各細胞因子的培養基代替培養上清以外，與[5]同樣地進行實驗。作為陽性對照，采用Panc-1細胞和F3克隆的培養上清、TGF-b和IL-10細胞因子。各細胞因子使用市售的細胞因子(MCP1:安迪公司#279-MC，TSPl:安迪公司#3074-TH, FSTLl:安迪公司 #669_F0，分泌型 IL_13Ra2:艾碧康公司 #ab46112，TGF_b:安迪公司#100-B，IL-10:電子生命科學公司#34-8109)。< 結果 >圖10所示為FoxP3蛋白的表達的測定結果。與未添加任何物質的培養基(圖中用培養基(Medium)表示；表達水平為2.55)相t匕，MCPl蛋白(表達水平為17.35)、TSPl蛋白(表達水平為18.40)、FSTLl蛋白(表達水平為16.00)、分泌型IL-13Ra2蛋白(表達水平為20.21)均顯示出與F3克隆的培養上清(表達水平為17.08)相同程度的FoxP3蛋白表達增強作用。如上所述，MCP1、TSP1、FSTL1和分泌型IL_13Ra2各細胞因子可用作FoxP3蛋白表達增強劑。[11]由表達Snail的細胞產生的FoxP3蛋白的直接表達增強作用和間接表達增強作用〈目的〉揭示由表達Snail的細胞產生的FoxP3蛋白的表達增強作用包括直接作用和間接作用，間接作用中至少有樹突狀細胞參與。< 方法 >作為免疫細胞，用分離的CD4+細胞代替成團PBMC，在(I)在單獨的CD4+細胞中加入F3細胞的情況、⑵在⑶4+細胞+樹突狀細胞(DC)中加入F3細胞的情況、(3)在⑶4+細胞+其它細胞(其它(others) =從成團PBMC中除去CD4+細胞和樹突狀細胞后留下的細胞)中加入F3細胞的情況、⑷在單獨的CD4+細胞中加入F3細胞培養上清的情況、(5)在單獨的CD4+細胞中加入F3細胞/DC的共培養上清的情況、(6)在單獨的CD4+細胞中加入F3細胞/其它細胞的共培養上清的情況、(7)在單獨的CD4+細胞中加入F3細胞/DC/其它細胞的共培養上清的情況下，分別考察CD4+細胞中的FoxP3蛋白的表達水平。⑶4+細胞和⑶I Ic+細胞(樹突狀細胞)通過與⑵相同的方法用MACS抗體(美天旎生物技術公司)從成團PBMC中分離。其它實驗方法也如上所述。< 結果 >
圖11所示為FoxP3蛋白的表達的測定結果。圖中，中部所示為添加有細胞時的實驗結果，下部所示為添加有培養上清時的實驗結果。如果將成團PBMC換成單獨的⑶4+細胞并加入F3細胞，則FoxP3蛋白表達水平下降(成團+F3細胞為35.34、⑶4+F3細胞為10.93)。如果向其中加入DC或其它細胞，則FoxP3蛋白表達水平上升(⑶4+DC+F3細胞為25.72、⑶4+其它+F3細胞為16.15)，這就表示成團PBMC細胞內的CD4+細胞中的FoxP3蛋白表達水平的上升有CD4+細胞以外的細胞(DC或DC以外的細胞)參與。但是，如果在單獨的⑶4+細胞中加入F3細胞(⑶4+F3為10.93)，則與不對成團PBMC進行任何刺激的情況(成團(無刺激(no stim))為2.55)相比，FoxP3蛋白表達水平上升，這就表示也存在F3細胞或其培養上清中的體液因子直接作用于CD4+細胞的機制。此外，將添加細胞的情況與添加上清的情況進行比較時，添加細胞的情況下FoxP3蛋白表達水平都要高2倍左右。例如，⑶4+F3細胞為10.93，相對地⑶4+F3上清為5.48 ；CD4+DC+F3 細胞為 25.72，相對地 CD4+ 上清(Tu+DC)為 14.98 ;CD4+ 其它 +F3 細胞為 16.15，相對地⑶4+上清(Tu+其它)為6.37。因此可以認為，不僅體液因子的作用對FoxP3蛋白表達增強有貢獻，細胞間的直接的相互作用也對FoxP3蛋白表達增強有貢獻。[12]利用snail基因強制表達克隆的細胞上清來誘導⑶8+細胞中的FoxP3表達〈目的〉揭示與⑶4+細胞同樣，利用snail基因強制表達克隆F3的細胞上清也能誘導⑶8+細胞中的FoxP3蛋白表達。< 方法 >除將作為對象的細胞從CD4+細胞換成CD8+細胞以外，通過與[5]相同的方法進行實驗。< 結果 >圖12所示為FoxP3蛋白的表達的測定結果。與CD4+細胞所得的結果同樣，與未添加腫瘤細胞的上清的情況(圖中的無腫瘤)相比，在親細胞株Panc-1的細胞上清(圖中的親代(Snail-))中，FoxP3蛋白表達僅有少量上升，但如果添加F3的細胞上清(圖中的F3(Snail+))，則在⑶8+細胞中也可見FoxP3蛋白表達的增強。如上所述，表達Snail的細胞的培養上清也能使⑶8+細胞的FoxP3蛋白表達增強。[13]利用抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來抑制CD8+細胞的FoxP3蛋白表達增強〈目的〉揭示與⑶4+細胞同樣，利用抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體也能抑制⑶8+細胞中的FoxP3蛋白表達增強。< 方法 >
除將作為對象的細胞從CD4+細胞換成CD8+細胞以外，通過與[7]相同的方法進行實驗。還有，對F3細胞使用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體，對BI I細胞使用抗IL_13Ra2抗體。使用小鼠IgG抗體作為陰性對照進行同樣的實驗。< 結果 >圖13所示為對F3細胞使用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體的情況下的FoxP3蛋白的表達的測定結果，圖14所示為對Bll細胞使用抗IL-13Ra2抗體的情況下的FoxP3蛋白的表達的測定結果。使用抗MCPl抗體(圖13 ;僅用培養上清(mlgG)時為14.71、用抗MCPl抗體(抗MCP1)時為11.97)、抗TSPl抗體(圖13 ;僅用培養上清(mlgG)時為14.71、用抗TSPl抗體(抗TSP1)時為5.28)和抗IL-13Ra2抗體(圖14;用Bll培養上清(無抗體)時為14.87、用抗IL-13Ra2抗體(抗IL_13Ra2)時為10.21)的情況下，由培養細胞上清產生的FoxP3蛋白表達增強作用受到了拮抗。這就表明對于由培養細胞上清產生的FoxP3蛋白表達增強作用，至少MCPl、TSPl和IL-13Ra2是主要的原因分子。如上所述，對于CD8+細胞，至少MCPUTSP1和IL_13Ra2也具有FoxP3蛋白表達增強作用。[14]利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來抑制表達Snail的腫瘤細胞的增殖〈目的〉揭示如果對表達snail基因的腫瘤細胞添加抗MCPl抗體和抗TSPl抗體，則可抑制腫瘤細胞的增殖。< 方法 >(I)細胞增殖測定方法
以2 μ g/mL的濃度在Panc-1細胞和F3細胞的培養基中添加抗MCPl抗體、抗TSPl抗體或作為對照的抗TGF-b抗體，培養3天后，加入1/10量的PremixWST-1溶液(寶生物公司)，再培養24小時，然后用酶標儀測定吸光度(450-655nm)，將其數值作為T細胞的增殖量。測定結果還表示了將對照mlgG所得的值設為100%時的增殖拮抗率。< 結果 >結果示于圖15。對于 Panc-1 細胞(圖中的親代-snail (-) (Parent-snail (-)))和F3細胞(圖中的F3-snail (+))這兩者，抗MCPl抗體和抗TSPl抗體都能將增殖拮抗至34% 77%。 如上所述，通過拮抗MCPl或TSPl的功能，可降低腫瘤細胞的增殖能力。[15]利用抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體來抑制表達Snail的腫瘤細胞的浸潤〈目的〉揭示如果對表達snail基因的腫瘤細胞添加抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體，則可抑制腫瘤細胞的浸潤。< 方法 >將5X IO4個F3細胞加入至用matrigel涂膜的Transwell小室(孔徑8ym,BD生命科學公司)的上層，培養過夜(37°C，5% CO2) 0以Iy g/mL的濃度在上層和下層中添加抗MCPl抗體或抗FSTLl抗體進行培養。將膜上的細胞完全除去后，用結晶紫溶液對浸潤至下層的細胞進行固定和染色，在顯微鏡下計數，從而測定細胞浸潤能力。也示出了將陰性對照(mlgG)所得的結果設為100%時的浸潤細胞的個數的比例。還有，作為陽性對照，采用抗IL-10抗體和抗TGF-b抗體。< 結果 >細胞浸潤能力的測定結果示于圖16。與親株Panc-1細胞(圖中用親代表示)相比，F3細胞(圖中用mlgG表示)的細胞浸潤能力增強。對該F3細胞給與抗TSPl抗體的情況下，細胞的浸潤能力無變化，但在使用抗MCPl抗體或抗FSTLl抗體時，細胞的浸潤能力降至約45%。如上所述，抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體具有降低表達Snail的腫瘤細胞的細胞浸潤能力的作用。[16]通過白血病細胞中的snail表達抑制來抑制浸潤〈目的〉揭示白血病細胞中，通過抑制Snail表達，可降低白血病細胞的浸潤能力。< 方法 >首先，通過RT-PCR 來考察白血病細胞株(Molt-3、Molt_4、UFl、KTl、K562、MC3)中的Snail、MCPl、FSTLl的表達。方法如[I] [2] [6]所述，但對于MCP1，使用具有以下序列的引物。正向5’ -GTGTTTGACATCTTTGAACTC-3’ (序列編號 13)反向5’ -CCAAAGACAAACCTCACATTC-3’ (序列編號 14)接著，使用6孔板，在白血病細胞株(Molt-4、EL4、Daudi, KTl)的培養基中分別添加與[2] (I)中使用的s iRNA相同的snial基因特異性s iRNA或siRNA對照進行培養(2 μ g/1 X IO6 個 /2mL ,英杰公司)。培養2天后，用涂有matrigel的Transwell小室(孔徑8 μ m,BD生命科學公司)培養4小時，計數浸潤至濾器的細胞。
< 結果 >根據圖17A所示的RT-PCR的結果，在考察的范圍內，所有的白血病細胞株中均檢測到Snail的高表達。此外，圖17B所示為對各白血病細胞株進行測定而得的浸潤細胞數。在各白血病細胞株中，與未經對snail基因具有特異性的siRNA處理的白血病細胞(圖中的無或對照(Control))相比，用snail基因特異性siRNA進行處理的情況下，浸潤能力均受到顯著抑制(P〈0.001 0.05)。如上所述，在白血病細胞中，通過抑制Snail表達，可降低白血病細胞的浸潤能力。因此，抑制Snail的功能的物質作為抗白血病藥物有用。[17]通過拮抗表達Snail的腫瘤細胞所生成的中間蛋白的作用來抑制腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制〈目的〉揭示腫瘤細胞被吞噬細胞吞噬而被消化排除，但表達Snail的腫瘤細胞拮抗該吞噬作用，而且針對MCPl蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白的抗體抑制表達Snail的腫瘤細胞所導致的吞噬拮抗作用。〈所用抗體〉抗MCPl抗體:BD制藥公司、抗CCR2抗體:艾碧康公司、抗IL-13抗體:艾碧康公司、抗IL-13Ra2抗體:安迪公司、抗IL-4抗體:BD生命科學公司、抗IL-10抗體:安迪公司< 方法 >將人結腸癌HCT116細胞或強制表達snail基因的Bll克隆與人PBMC在各抗體(I μ g/mL)的存在下共培養3天使其接觸，將該PBMC用PKH26紅色熒光標記。以1:1的比例在該PBMC中加入用CSFE綠色熒光標記的HCT116細胞，37°C培養2小時后，用流式細胞儀(FCM)分析同時被紅色和綠色兩種熒光標記的細胞(即吞噬了癌細胞的PBMC中的細胞)的比例。還有，為了觀察自然發生的吞噬(背景)，在低溫(4°C)下培養2小時。< 結果 >經不表達snail基因的HCT116細胞處理的PBMC(圖18中的經模擬物處理的PBMC (Mock-treated PBMCs))中，約25%的細胞同時被兩種熒光標記。但是，經Bll克隆處理的PBMC (圖18中的經Bll處理的PBMC(Bll-treated PBMCs))中，僅約10%的細胞同時被兩種熒光標記。如上所述，表達Snail的腫瘤細胞具有抑制PBMC所包含的吞噬細胞的作用的功能。但是，如果在PBMC與Bll克隆接觸時預先添加各抗體，則同時被兩種熒光標記的細胞的比例上升至15 % 35 %，因與表達Snai I的腫瘤細胞接觸而導致的同時被兩種熒光標記的細胞的比例的下降被拮抗。如上所述，通過拮抗腫瘤免疫抑制中間蛋白的功能，可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制，激活腫瘤免疫。[18]利用對snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA的體內治療實驗

〈目的〉揭示通過 在體內抑制Snail蛋白的功能或MCPl信號，可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制。〈方法〉
對于小鼠黑色素瘤B16-F10，與[I]同樣地制作強制表達snail基因的細胞(H6-snail+)，移植至C57BL/6N小鼠(在I只個體內同時進行I X IO6個的皮下接種和2 X IO5個的靜脈內接種)。7天后,用PEI (多轉染公司(PolyplusTransfection社))將形成脂質復合體的對Snail或MCPl基因具有特異性的siRNA或對照siRNA(5 μ g/只，英杰公司)分別注入該皮下移植的腫瘤內。小鼠snail基因特異性siRNA的序列:正義5’ -GGAAGAUCUUCAACUGCAA-3’ (序列編號 15)反義5’ -UUGCAGUUGAAGAUCUUCC-3’ (序列編號 16)小鼠MCPl基因特異性siRNA的序列:正義5’ -CCAGCAAGAUGAUCCCAAU-3’ (序列編號 17)反義5’ -AUUGGGAUCAUCUUGCUGG-3’ (序列編號 18)
小鼠siRNA用對照的序列:正義5’ -CCAGAAGUACUACCGCAAU-3’ (序列編號 19)反義 5，-AUUGCGGUAGUACUUCUGG-3’ (序列編號 20)I周后，從移植小鼠體內摘出腫瘤和肺，測定腫瘤體積和肺轉移結節數，用流式細胞儀FACScan對腫瘤內浸潤細胞進行分析。將實體瘤在培養液內勻漿后采集腫瘤內浸潤細胞，與針對小鼠抗原的各種抗體(抗CD4抗體、抗CD8抗體、抗CDllc抗體和抗I_A(b)抗體是BD制藥公司的產品、抗FoxP3抗體是電子生命科學公司的產品)或H-2K(b)約束性gp70四聚體(肽序列:KSPWFTTL，MBL公司、序列編號21)于4V反應I小時后進行分析。〈結果〉圖19所示為測得的腫瘤體積(A)、肺轉移結節數(B)和腫瘤內浸潤細胞的流式細胞儀分析(C)的結果。如圖19A和圖19B所示，移植了 B16-F10的小鼠(圖中的模擬物)中，腫瘤的增殖顯著，而向肺的轉移少。相對地,移植了 H6-snail+的小鼠(圖中的Cont)中，腫瘤的增殖程度不如模擬物，而向肺的轉移得到顯著促進。但是，如果注入對snail基因或MCPl基因具有特異性的s iRNA(圖中分別為Snail和MCP1)，細胞增殖和向肺的轉移均受到抑制。此外，如圖19C所示，與B16-F10 (圖中的模擬物)相比，強制表達snail基因的H6-snail +中，浸潤至腫瘤內的細胞數顯著減少，而如果注入對snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA，則浸潤至腫瘤內的細胞數增加至多于B16-F10。如上所述，通過利用對snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA在體內抑制Snail蛋白的功能或MCPl信號，可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制，產生抑制腫瘤體積增加、抑制腫瘤轉移、增強向腫瘤內的細胞浸潤等抗腫瘤效果。[19]利用抗TSPl抗體的體內治療實驗〈目的〉揭示通過在體內抑制TSPl蛋白的功能，可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制。〈方法〉將IX IO6個小鼠黑色素瘤B16-F10和H6_snail+皮下接種于C57BL/6N小鼠，7天后向該皮下接種腫瘤內注入抗TSPl抗體(5 μ g/只、卡爾生物化學公司(Calbi ochem社))，I周后進行以下測定。(I)測定腫瘤體積。(2)為檢測出各臟器(LG肺；SP脾臟；PB外周血；BM骨髄)中的腫瘤細胞的微量轉移，通過RT-PCR考察B16-F10細胞特異性表達的癌抗原gplOO的基因表達。還有，除使用下述引物以外，與[I]同樣地進行RT-PCR。對gp 100具有特異性的弓丨物序列:正向5’ -ACAGCCAGTGTATCCACAGG-3’ (序列編號 22)反向5’ -ACTTCCATTGTGTGTGTGCC-3’ (序列編號 23)對作為對照的GAPDH具有特異性的引物序列:正向5’ -TTGACCTCAACTACATGGTCTA-3’ (序列編號 24)反向5’ -ACCAGTAGACTCCACGACATAC-3’ (序列編號 25)(3)與[18]同樣地用流式細胞儀FACScan分析腫瘤內浸潤細胞。< 結果 >圖20所示為測得的腫瘤體積(A)、肺轉移結節數(B)和腫瘤內浸潤細胞的流式細胞儀分析(C)的結果。(I)如圖20A所示，不論是在移植B16-F10的情況下(圖中的模擬物)還是在移植H6-snail+的情況下(圖中的H6_snail+`)，通過給與抗TSPl抗體(圖中的抗TSP1)，腫瘤體積顯著減少。(2)如圖20B所示，移植H6_snail+、給與小鼠IgG作為抗體的對照的情況下(圖中的H6+對照mlgG (H6+Control mlgG))，與移植B16-F10的情況(圖中的模擬物)相比，各組織中檢測出高水平的gplOO表達，腫瘤轉移得到促進，而通過給與抗TSPl抗體(圖中的H6+抗TSPl (H6+Ant1-TSPl))，各組織中gplOO表達降低，向組織的轉移被顯著抑制。(3)如圖20C所示，與B16_F10(圖中的模擬物；mIgG)相比，強制表達snail基因的H6-snail+(圖中的H6-snail+;mIgG)中，向腫瘤細胞內浸潤的細胞數顯著減少，而通過給與抗TSPl抗體(圖中的H6+抗TSP1)，向腫瘤內浸潤的細胞數增加至多于B16-F10 (圖中的模擬物；mIgG)。如上所述，通過利用抗TSPl抗體來拮抗TSPl的作用，可解除腫瘤細胞所導致的腫瘤免疫抑制，產生抑制腫瘤體積增加、抑制腫瘤轉移、增強向腫瘤內的細胞浸潤等抗腫瘤效
果O產業上利用的可能性通過本發明，可提供增強細胞中的FoxP3基因表達的基因表達增強方法、將細胞向調節T細胞分化誘導的細胞分化誘導劑、由它們的作用來抑制免疫的免疫抑制劑和過度免疫疾病治療劑、拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強的基因表達增強拮抗劑、拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導的細胞分化誘導拮抗劑、由它們的作用來解除免疫抑制的免疫抑制解除劑、腫瘤免疫激活劑及抗腫瘤劑等。
權利要求
1.一種抑制細胞的FSTLl蛋白的功能的物質在制備基因表達增強拮抗劑中的應用，該基因表達增強拮抗劑拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述物質為具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體。
3.如權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述劑拮抗細胞向調節T細胞的分化誘導。
4.如權利要求3所 述的應用，其特征在于，所述劑解除免疫抑制。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述劑激活腫瘤免疫。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于，所述劑治療腫瘤。
全文摘要
本發明涉及腫瘤細胞所導致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑，提供一種抑制細胞的FSTL1蛋白的功能的物質在制備基因表達增強拮抗劑中的應用，該基因表達增強拮抗劑拮抗細胞中的FoxP3基因的表達增強。
文檔編號A61P35/00GK103223165SQ20121040885
公開日2013年7月31日 申請日期2008年8月22日 優先權日2007年8月24日
發明者工藤千惠, 河上裕 申請人:學校法人慶應義塾