I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法
【專利摘要】一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，所述I型膠原改性的多孔鈦涂層采用生物化學改性方法，以共價鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原。與物理吸附的膠原改性多孔鈦涂層相比，本發明提供的共價接枝的I型膠原改性多孔鈦涂層所固定的膠原量增加約一倍；固定穩定性更好，在7天后仍保留有90%以上；并且具有更好的生物學性能，可應用于促進誘導骨組織生長的骨植入材料。本發明工藝簡單、效率高、可重復性好，為醫用生物涂層技術提供新的方法。
【專利說明】I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，具體涉及一種采用共價鍵接枝方式在等離子體噴涂鈦涂層表面固定有I型膠原并具有良好生物學性能的I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法，屬于醫用生物涂層【技術領域】。
【背景技術】 [0002]鈦和鈦合金等是臨床上常用的骨植入材料。利用等離子體噴涂方法在其表面制備的多孔鈦涂層，是改善其與骨組織結合的常用方法。多孔結構能夠增加骨和植入體表面之間的機械嵌合作用，使植入體與骨組織間的結合強度明顯提高。等離子體噴涂鈦涂層的人工關節等硬組織植入體已獲臨床應用。然而，鈦涂層屬于生物惰性涂層，不具生物活性，對骨組織的生長并沒有促進誘導作用，其臨床使用效果仍有待改善。
[0003]為了賦予鈦涂層生物活性，改善臨床使用效果，人們采用多種方法對其進行表面改性。利用等離子噴涂、表面礦化等技術在多孔鈦涂層表面沉積生物活性陶瓷涂層，可以有效地改善鈦涂層的生物活性。例如中國專利CN101342387A公開一種鈦涂層表面快速生成磷灰石的活化方法。但生物活性陶瓷涂層在體內容易降解，影響涂層的長期穩定性。化學處理也可以改善鈦涂層的生物活性，但與生物活性陶瓷涂層如羥基磷灰石涂層相比，仍存在較大差距。
[0004]生物化學方法是一類新型的生物材料表面改性方法，其目的是將細胞外基質成分(如膠原)、酶或者多肽固定在生物材料上，構建仿生中間層，以引發特殊細胞和組織的響應。I型膠原是細胞外基質主要組成部分，影響著細胞粘附、遷移、增殖和分化。通過物理吸附，在鈦涂層表面固定I型膠原，能夠提高鈦涂層的生物學性能和細胞相容性(StefanRammelt, et al.Journal of Orthopaedic Research.2004(22):1025-1034.)。例如，中國專利CN102145194A公開一種將具有多孔磷酸鈣涂層的金屬基材浸入膠原溶液后風干以制得多孔磷酸鈣-膠原復合涂層的方法；中國專利CN101984144A公開一種采用電化學共沉積法在鈦基板上以此組裝磷酸鈣層和膠原層的方法。但物理吸附固定的膠原有限，并且不穩定，容易脫附。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種I型膠原改性的多孔鈦涂層及其制備方法。在上述現有技術的基礎上，本發明人意識到通過化學方法將I型膠原共價鍵接枝在多孔鈦涂層表面，不但能夠獲得穩定的仿生中間層，而且能夠提高所固定I型膠原的量以及固定的穩定性，從而獲得相對于物理吸附方法生物學性能更好的改性多孔鈦涂層。
[0006]在此，本發明提供一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，即采用生物化學改性方法，以共價鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原的I型膠原改性的多孔鈦涂層。
[0007]與物理吸附的膠原改性多孔鈦涂層相比，本發明提供的共價接枝的I型膠原改性多孔鈦涂層所固定的膠原量增加約一倍；固定穩定性更好，在7天后仍保留有90%以上；并且具有更好的生物學性能，可應用于促進誘導骨組織生長的骨植入材料。
[0008]另一方面，本發明還提供所述多孔鈦涂層的制備方法，包括堿處理、硅烷化處理和共價鍵固定I型膠原。
[0009]較佳地，所述堿處理包括將多孔鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h。
[0010]較佳地,所述硅烷化處理米用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷為硅烷化劑。
[0011]所述硅烷化處理可以采用甲苯為溶劑，加熱回流反應6~12h。
[0012]較佳地，所述共價鍵固定I型膠原包括將經硅烷化處理的多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中并采用1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為羧基活化劑。
[0013]更佳地,所述共價鍵固定I型膠原可以是在濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺以使其在反應體系中的濃度分別為2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
[0014]所述共價鍵固定I型膠原的反應時間優選為4~10h。
[0015]較佳地，在所述硅烷化處理之前還包括去離子水陳化處理。
[0016]所述去離子水陳化可以是將經堿處理的多孔鈦涂層在去離子水中40~80°C下保溫3~7天。
[0017]本發明工藝簡單、效率高、可重復性好。本發明所提供的I型膠原改性的多孔鈦涂層，具有良好的穩定性和生物學性能，解決了現有技術中所存在的問題，可改善鈦涂層的臨床效果，為醫用生物涂層技術提供新的方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是鈦涂層改性前后的表面形貌:(a)堿處理的鈦涂層(TC-A) ； (b)硅烷化的鈦涂層(TC-AA) ； (c)物理吸附固定I型膠原的鈦涂層(TC-AC) ； (d)共價鍵接枝固定I型膠原的鈦涂層(TC-AAC)，均放大1000倍；
圖2是鈦涂層改性前后的紅外光譜；
圖3是I型膠原的固定效果分析:(a)固定膠原量測定；(b)膠原的固定穩定性分析；圖4是共價鍵接枝固定I型膠原鈦涂層的生物學性能實驗:(a)hMSCs的細胞粘附實驗；(b)hMSCs的細胞增殖實驗；(c)hMSCs細胞分化的堿性磷酸酶活性檢測實驗。
【具體實施方式】
[0019]以下結合附圖及下述【具體實施方式】進一步說明本發明，應理解，下述實施方式和/或附圖僅用于說明本發明，而非限制本發明。
[0020]基于I型膠原良好的生物學性能和細胞相容性，本發明采用生物化學改性方法，以共價鍵接枝方式，將I型膠原固定在等離子體噴涂多孔鈦涂層表面，從而獲得生物學性能更好的I型膠原改性的多孔鈦涂層。作為示例，其具體工藝如下。
[0021](I)鈦涂層的制備:利用等離子體噴涂技術制備鈦涂層。
[0022](2)堿處理:將所述 鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h，取出后可用去離子水超聲清洗，超聲清洗可以持續約5分鐘。這里采用5~IOM的NaOH作為堿處理的堿液，但應理解其他合適的堿液也是適用的，例如氫氧化鉀。
[0023](3)去離子水陳化:將經堿處理得到的多孔鈦涂層浸泡在去離子水中40~80°C下保溫3~7天。可以每天換一次水，最后40°C下干燥。
[0024](4)硅烷化:將干燥的多孔鈦涂層浸泡在濃度為5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應6~12h，冷卻后，分別用酒精、去離子水超聲清洗1-2次，真空干燥。這里采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷(APS)為硅烷化劑，采用甲苯作為溶劑，但應理解其他合適的硅烷化劑、溶劑也是適用。
[0025](5)共價鍵固定I型膠原:將所述硅烷化多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中(例如濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液)中，滴加入1_ (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)水溶液(例如120mg/mL)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)水溶液(例如30mg/mL)，使得EDC最終溶度為2~3.5mg/mL,NHS最終溶度為0.25~0.875mg/mL,反應4~IOh后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥。
[0026]下面進一步例舉實施例以詳細說明本發明。同樣應理解，以下實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據本發明的上述內容做出的一些非本質的改進和調整均屬于本發明的保護范圍。下述示例具體的試劑的量和濃度、反應時間和溫度也僅是合適范圍中的一個示例，即、本領域技術人員可以通過本文的說明做合適的范圍內選擇，而并非要限定于下文示例的具體數值。
[0027]實施例1
[基于共價鍵固定I型膠原 的改性鈦涂層的制備]
利用等離子體噴涂技術制備鈦涂層(標記為TC)，所制備的鈦涂層浸入5M NaOH溶液中，在80°C下保溫12h，用去離子水超聲清洗后，在去離子水中60°C下陳化7天，一天換一次水，40°C下干燥。堿處理改性鈦涂層標記為TC-A。將干燥的樣品TC-A浸泡在濃度為10%的APS/甲苯溶液中，溶液加熱至沸騰，冷凝回流，反應12h。冷卻后用酒精超聲清洗I次，去離子水超聲清洗2次，真空干燥。硅烷化的鈦涂層標記為TC-AA。將樣品TC-AA浸泡在濃度為lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中。每38mL膠原溶液中滴入120mg/mL EDC水溶液和30mg/mL NHS水溶液各ImL,使得EDC最終溶度為3mg/mL, NHS最終溶度為0.75mg/mL。反應6h后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥，樣品標記為TC-AAC。
[0028]對比例I
[用物理吸附方法將I型膠原固定在鈦涂層表面]
將實施例1中的中間樣品TC-A浸泡在lmg/mL I型膠原/5mM乙酸溶液中，6小時后取出，去離子水超聲清洗，真空干燥，樣品標記為TC-AC。
[0029]圖1為鈦涂層表面固定I型膠原前后的表面形貌。在(c)、(d)中均能觀察到纖維狀的I型膠原，表明通過吸附固定方式和共價鍵固定方式，I型膠原成功地固定在鈦涂層表面，得到新型的膠原改性鈦涂層。
[0030]由圖2所示的鈦涂層改性前后的紅外光譜可以看出:與TC-AA譜圖相比，TC-AAC譜圖上的S1-O-Si系列特征吸收峰(1020-12900^1)減弱，而氨基系列特征吸收峰(1300-1700^1)增強，進一步表明制備出新型膠原改性鈦涂層。
[0031][改性鈦涂層的膠原固定效果實驗]
利用天狼猩紅染色法，從定量和固定穩定性兩方面來考察膠原固定效果:將樣品TC-AC和TC-AAC浸泡在濃度為lmg/mL的天狼猩紅-飽和苦味酸溶液中，2小時后取出，去離子水沖洗，真空干燥。用0.1M的NaOH溶液將染料洗脫下來，然后用紫外分光光度計測定染料-NaOH溶液在540nm下的吸光度值，與吸光度值-膠原量標準曲線對照，得出固定膠原的量。將樣品TC-AC和TC-AAC各4個浸泡在tris_HCl溶液中，37度下分別孵育1、3、5、7天。用天狼猩紅染色法測量樣品表面剩余膠原量。
[0032]圖3所示是I型膠原的固定效果分析。從圖3 (a)中可以看出-JC-AAC的膠原量可達391 μ g/cm2,大于TC-AC的191 μ g/cm2,表明共價鍵固定方式能夠固定較多的膠原。在圖3 (b)中，TC-AC的膠原在5天內就脫附殆盡，而TC-AAC的膠原7天后仍保留有90%以上，表明共價鍵固定的膠原穩定性更好。
[0033][改性鈦涂層的生物學性能實驗]
用人骨髓間充質干細胞(hMSCs)來考察共價鍵固定I型膠原鈦涂層的生物學性能:用MTT法考察hMSCs在材料表面的粘附和增殖行為；用BCA法對hMSCs的堿性磷酸酶(ALP)的活性進行定量測定。
[0034]圖4為共價鍵固定I型膠原改性鈦涂層的生物學性能實驗。從圖中可以看出?與TC相比，表面固定了 I型膠原的改性鈦涂層，能夠促進hMSCs的粘附(圖4(a))、增殖(圖4(b))和堿性磷酸酶的活性表達(圖4(c))，具有更好的生物學性能。而與TC-AC相比，TC-AAC具有更好的促進效果。結果表明:在鈦涂層上共價鍵固定I型膠原，能夠提高鈦涂層的生物學性能。
[0035]產業應用性:本發明通過共價鍵接枝方式，將I型膠原固定在多孔鈦涂層表面，獲得一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，具有良好穩定性和生物學性能，不但能夠加強鈦和鈦合金等骨植入材料與 骨組織間的結合強度，而且改善多孔鈦涂層的臨床使用效果，促進誘導骨組織的生長，在醫學生物涂層【技術領域】有廣闊的應用前景。
【權利要求】
1.一種I型膠原改性的多孔鈦涂層，其特征在于，采用生物化學改性方法，以共價鍵接枝方式，在多孔鈦涂層表面固定有I型膠原。
2.—種權利要求1所述的多孔鈦涂層的制備方法，其特征在于，包括堿處理、硅烷化處理和共價鍵固定I型膠原。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述堿處理包括:將多孔鈦涂層浸入濃度為5~IOM的NaOH溶液中在60~80°C下保溫6~12h。
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，所述硅烷化處理采用5~10%的氨丙基三乙氧基硅烷為硅烷化劑。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述硅烷化處理采用甲苯為溶劑，加熱回流反應6~12h。
6.根據權利要求2~5中任一項所述的制備方法，其特征在于，所述共價鍵固定I型膠原包括將經硅烷化處理的多孔鈦涂層浸泡在I型膠原/乙酸溶液中并采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺為羧基活化劑。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，滴加1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺以使其在反應體系中的濃度分別為2~3.5mg/mL和0.25~0.875mg/mL。
8.根據權利要求6 或7所述的改性方法，其特征在于，所述共價鍵固定I型膠原的反應時間為4~IOh。
9.根據權利要求2~8中任一項所述的制備方法，其特征在于，在所述硅烷化處理之前還包括去離子水陳化處理。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述去離子水陳化包括:將經堿處理的多孔鈦涂層在去離子水中40~80°C下保溫3~7天。
【文檔編號】A61L27/56GK103785066SQ201210431500
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2012年11月1日 優先權日:2012年11月1日
【發明者】敖海勇, 鄭學斌, 湯亭亭, 謝有桃, 季衍, 黃利平 申請人:中國科學院上海硅酸鹽研究所, 上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院