一種海蛇提取物及其制備方法和用途
【專利摘要】本發明提供一種海蛇提取物及其制備方法和用途。所述制備方法包含下列步驟：取海蛇干燥體，加水煎煮，水煎液離心濾過；采用截留分子量為2000～8000的有機膜過濾，并將濾液濃縮至相對密度為1.05～1.20，放置，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。本發明制備的海蛇提取物，具有良好的抗類風濕性關節炎作用，可用于制備預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物。
【專利說明】一種海蛇提取物及其制備方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明屬于天然藥物領域，具體涉及一種海蛇提取物及其制備方法和其在制備用于預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002]海蛇(拉丁名Pelamis platurus)，爬行綱，眼鏡蛇科，海蛇亞科，是生活在海洋里的爬行動物，有毒，身長1.5~2米。海蛇具有祛風止痛，滋補強壯的功效，常用于治療風寒濕痹，關節疼痛，屈伸不利，皮膚瘙癢，體虛和小兒營養不良等。
[0003]海蛇在中醫領域中的應用歷史悠久，其功效已被臨床實踐充分證實。近年來，對海蛇在抗菌消炎、抗病毒、抗癌、治療呼吸系統疾病以及免疫系統疾病等方面的研究表明，其在臨床應用上前景廣闊，開發利用潛力很大。但海蛇化學成分復雜，除了對蛇毒的研究比較多以外，其他成分的研究尚不系統深入，且海蛇的應用均是采用原料藥材直接入藥，或是采用簡單水提法或醇提法后入藥。目前，海蛇產品的開發形式主要有兩種，一是以海蛇干體為主藥配伍活血理氣藥制成復方制劑；二是以海蛇精制成各種保健酒。
【發明內容】
[0004]基于海蛇現有的應用情況，本發明的目的是提供一種海蛇有效部位的制備方法。采用本發明制備方法制得的海蛇提取物，具有良好的抗類風濕性關節炎作用，可用于制備預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物。
[0005]本發明提供了一種海蛇提取物的制備方法，所述的制備方法包括下列步驟:
[0006]1)取海蛇干燥體，加水煎煮，水煎液離心濾過；
[0007]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0008]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0009]1)取海蛇干燥體，加水煎煮3次，每次加水5~30倍量、煎煮10分鐘~2小時，濾過，合并水煎液，離心濾過；
[0010]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀
干燥，即得。
[0011]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0012]1)取海蛇干燥體，加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小時，濾過，合并水煎液，離心濾過；
[0013]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0014]1)取海蛇干燥體，加水煎煮2次，每次加水I O倍量、煎煮I小時,濾過,合并水煎液，離心濾過；
[0015]2)采用截留分子量為3000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在7(T80°C下相對密度為1.10，放置72小時，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0016]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0017]I)取海蛇干燥體，加水煎煮，水煎液離心濾過；
[0018]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10，放置，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0019]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0020]I)取海蛇干燥體，加水煎煮3次，每次加水5~30倍量、煎煮10分鐘~2小時，濾過，合并水煎液，離心濾過；
[0021]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0022]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:
[0023]I)取海蛇干燥體，加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小時，濾過，合并水煎液，離心濾過；
[0024]2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0025]優選的情況，本發明所述的制備方法包括下列步驟:`[0026]I)取海蛇干燥體，加水煎煮2次，每次加水10倍量、煎煮I小時,濾過,合并水煎液，離心濾過；
[0027]2)采用截留分子量為3000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10，放置72小時，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
[0028]本發明還提供所述制備方法制得的海蛇提取物。
[0029]本發明還提供一種用于預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物組合物，該藥物組合物包含所述海蛇提取物。
[0030]本發明還提供所述海蛇提取物在制備預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物中的用途。
[0031]本發明制備的海蛇提取物，具有良好的抗類風濕性關節炎作用，可用于制備預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物；實驗證明，本發明所述制備方法得到的海蛇提取物，與單純的水提法或醇提法得到的海蛇提取物相比，在改善SD大鼠CIA模型關節指數(Al)和關節病理學表現方面取得的效果更為明顯。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0032]以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中:
[0033]圖1表示空白對照組SD大鼠踝關節。
[0034]圖2表示CIA模型組SD大鼠踝關節。
[0035]圖3表示海蛇治療組SD大鼠踝關節。
【具體實施方式】[0036]以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發明，其不以任何方式限制本發明的范圍。
[0037]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的藥材原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0038]實施例1
[0039]取海蛇干燥體(購買自廣州清平藥材市場，經鑒定為海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取3次，每次加水10倍量，每次煎煮I小時，合并水煎煮提取液，離心濾過，冷卻至室溫，濾液再采用截留分子量為2000的有機濾膜濾過，濾液濃縮至在15°C下相對密度為1.05，放置I小時，沉淀析出，過濾，取沉淀干燥，得海蛇提取物23克。
[0040]實施例2
[0041]取海蛇干燥體(購買自廣州清平藥材市場，經鑒定為海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮I小時，合并水煎煮提取液，離心濾過，冷卻至常溫，濾液再采用截留分子量為3000的有機濾膜濾過，濾液濃縮至在15°C下相對密度為1.20，放置48小時，沉淀析出，過濾，取沉淀干燥，得海蛇提取物52克。
[0042]實施例3
[0043]取海蛇干燥體(購買自廣州清平藥材市場，經鑒定為海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取2次，每次加水10倍量，每次煎煮I小時，合并水煎煮提取液，離心濾過，冷卻至常溫，濾液再采用截留分子量為3000的有機超濾膜濾過，濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10，放置72小時，沉淀析出，過濾，取沉淀干燥，得海蛇提取物61克。
[0044]實施例4
[0045]取海蛇干燥體(購買自廣州清平藥材市場，經鑒定為海蛇Pelamis platurus) I千克，加水煎煮提取3次，每次加水10倍量，每次煎煮I小時，合并水煎煮提取液，離心濾過，冷卻至常溫，濾液再采用截留分子量為8000的有機超濾膜濾過，濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.20，放置48小時，沉淀析出，過濾，取沉淀干燥，得海蛇提取物56克。
[0046]實施例5
[0047]海蛇提取物的藥效試驗包含以下步驟:
[0048](1)將64只雄性SD大鼠隨機分為8組:空白對照組、CIA (膠原誘導性關節炎)模型組、海蛇治療I組(即實施例1提取物組)、海蛇治療2組(即實施例2提取物組)、海蛇治療3組(即實施例3提取物組)、海蛇治療4組(即實施例4提取物組)、海蛇治療5組(即單純水提法組)、海蛇治療6組(即醇提法組)，每組8只。
[0049](2)參照文獻(Xiao C，Li J, Dong X 等人.Ant1-oxidative and TNF- αsuppressive activities of puerarin derivative(4AC)in RAW264.7cells andcollagen-1nduced arthritic rats.Eur J Pharmacol.2011 Jun 4 ；666 (3)242-250),于實驗開始第I天，取適量濃度為2mg/ml的II型膠原蛋白(Collagen II)溶液，將該II型膠原蛋白溶液逐滴加入等容積的不完全弗氏佐劑中后，在冰浴中，用勻漿器將其充分混勻乳化，以滴加水中不擴散為度，配成II型膠原蛋白濃度為lmg/ml的乳劑。
[0050](3)對于CIA模型組和海蛇治療組，取步驟(2)所得乳劑，分別按每只SD大鼠
0.2ml乳劑量于尾根部皮下免疫；對于空白對照組，按每只SD大鼠以0.2ml等容積蒸餾水于尾根部皮下注射。實驗開始7天后，對于CIA模型組和海蛇治療組，按每只SD大鼠0.1ml乳劑量于尾根部皮下再加強免疫一次；對于空白對照組，按每只SD大鼠以0.1ml等容積蒸餾水于尾根部皮下注射。
[0051 ] (4)實驗開始第7天(即第二次免疫后)，對于海蛇治療各組，按每只SD大鼠以1.84g/kg.d的生藥劑量，lml/100g體重的體積灌胃給藥；對于空白對照組和CIA模型組，分別按每只SD大鼠以lml/100g體重的體積給予生理鹽水灌胃。
[0052](5) 28天期間內對6組SD大鼠進行關節炎指數(Arthritis Index, Al)檢測,用來判斷其大體發病率。SD大鼠全身病變按5級評分法評價，可以得出SD大鼠的4只肢體病變程度累計積分，然后計算出關節炎指數(Al)。5級評分法具體計分方法為:0分表示無紅腫；1分表示小趾關節紅腫；2分表示趾關節和足跖腫脹；3分表示踝關節以下的足爪腫脹；4分表示包括踝關節在內的全部足爪腫脹。累計以上所述各個關節的積分，即為每只SD大鼠的關節炎指數(Al)，每只SD大鼠最高得分為I 6分。
[0053](6)治療結束后，將SD大鼠在乙醚麻醉下取全血；后處死SD大鼠，取其膝關節，用多聚甲醛固定36小時后，放入1096EDTA脫鈣溶液，再用酒精逐級脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋、切片后進行常規HE染色(即蘇木精-伊紅染色)，后于光鏡下觀察滑膜、軟骨、骨的病理改變。
[0054]結果顯示:關節炎指數檢測表明，各海蛇治療組對C II所致SD大鼠CIA模型關節炎指數均有不同程度的降低，但以海蛇治療3組(即本發明制備方法制得的海蛇提取物實施例3提取物)關節炎指數降低最明顯(見表1)。病理學觀察顯示，與空白對照組(圖1)相比，CIA模型組踝關節滑膜細胞增生，滑膜組織內可見有擴張的血管、新生毛細血管，并伴有淋巴細胞浸潤；各跗骨關節的軟骨基質及軟骨細胞出現不同程度的退行性變，嚴重處軟骨壞死剝脫、變性，剝脫的軟骨表面，可見由滑膜細胞和毛細血管增生所形成的血管翳，軟骨下骨也受到血管翳的侵襲，出現退行性變(見圖2);各海蛇治療組對C II所致SD大鼠CIA模型踝關節滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤、血管翳形成、軟骨及骨質破壞等病理學改變均有不同程度的減輕，但以海蛇治療3組(即本發明制備方法制得的海蛇提取物實施例3提取物)上述病理學改變最明顯(見圖3)。
`[0055]表1:大鼠 Al 的變化(i±s，0=8)[0056]
【權利要求】
1.一種海蛇提取物的制備方法，其特征在于，該制備方法包括下列步驟: 1)取海蛇干燥體,加水煎煮,水煎液離心濾過； 2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟1)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟: 1)取海蛇干燥體,加水煎煮f3次，每次加水5~30倍量、煎煮I O分鐘~2小時，濾過，合并水煎液，離心濾過； 2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟: 1)取海蛇干燥體,加水煎煮2~3次，每次加水10倍量、煎煮I小時，濾過，合并水煎液，離心濾過； 2)采用截留分子量為2000~8000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在15°C~80°C下相對密度為1.05~1.20，放置24小時以上，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
4.根據權利要求1至3任一項所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括下列步驟: 1)取海蛇干燥體,加水煎煮2次，每次加水IO倍量、煎煮I小時，濾過，合并水煎液，離心濾過； 2)采用截留分子量為3000的有機膜過濾步驟I)得到的濾液，并將濾液濃縮至在7(T80°C下相對密度為1.10，放置72小時，析出沉淀，過濾，取沉淀干燥，即得。
5.根據權利要求1至4任一項所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2)中將濾液濃縮至在80°C下相對密度為1.10。
6.根據權利要求1至5任一項所述的制備方法制得的海蛇提取物。
7.一種用于預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包含根據權利要求6所述的海蛇提取物。
8.根據權利要求6所述的海蛇提取物在制備預防和/或治療類風濕性關節炎的藥物中的用途。
【文檔編號】A61P29/00GK103800379SQ201210453697
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月13日 優先權日:2012年11月13日
【發明者】肖誠, 徐世杰 申請人:肖誠