Tuft1在制備肝癌診斷和治療制劑中的應用的制作方法

Tuft1在制備肝癌診斷和治療制劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及TUFT1在制備肝癌診斷和治療制劑中的應用。首次發現肝癌組織中TUFT1基因的表達顯著高于周圍的癌旁組織，提示檢測TUFT1基因表達水平可成為肝癌早期診斷的輔助診斷指標之一，干擾TUFT1基因表達可成為肝癌治療的新途徑。
【專利說明】TUFT1在制備肝癌診斷和治療制劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子生物學特別是基因診斷和基因治療領域，尤其是TUFTl在制備肝癌診斷和治療制劑中的應用。
【背景技術】
[0002]肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上發病率和致死率較高的惡性腫瘤之一，全世界每年新發HCC病人中約50%在中國。HCC的發生發展和惡性轉移機制是一個由多基因、多信號通路參與的復雜的網絡調控系統。
[0003]哺乳動物TUFTl基因(編碼Tuftelinl蛋白)最早是由Deutsch從牛成釉細胞的cDNA文庫中鑒別、克隆并完成測序工作[Z.Mao等，The human Tuftelinlgene:cloningand characterization, Gene 279(2001) 181-196.]。之后，發現 Tuftelinl 蛋白在許多類型的組織中表達，包括礦化和非礦化組織均可表達[D.Deutsch等，The human Tuftelinlgene and the expression of Tuftelinl in mineralizing and nonmineralizingtissues, Connect Tissue Res.43(2002)425-434]。人類的 TUFTl 基因是單拷貝基因，大小為43279bp，位于lq21.3染色體上；包含13個外顯子，開放閱讀框為1170bp，編碼全長為390個氨基酸的蛋白質(Tuftelinl)，不含信號肽序列[1.Thesleff等，Epithelial - mesenchymal signaling during tooth development, Connect TissueRes.32(1995)9-15]。目前研究Tuftelinl的功能主要是:參與牙釉質的礦化過程，促進牙齒的發育[J.V.Ruch 等；Int.J.Dev.Biol.39 (1995) 51-68 ;Α.S.Tucker 等，Moleculargenetics of tooth morphogenesis and patterning:the right shape in the rightplace, J.Dent.Res.78 (1999) 826-834]。
[0004]已有研究證實，Tuftelinl是一種缺氧誘導基因[P.T.Sharpe等，Test-tubeteeth, Sc1.Am.293(2005)34-41]，在生理情況下，Tuftelinl蛋白在腎臟和睪丸中表達量很高[D.Deutsch 等，Tuftelin`1-aspects ofprotein and gene structure, Eur.J.0ralSc1.106(Suppl.1) (1998) 315-323]，而腎臟和睪丸常處于低氧環境。現有技術中沒有TUFTl與腫瘤的關系的研究報導。
[0005]目前臨床已有的甲胎蛋白(AFP)等輔助診斷標記物具有一定的假陰性率，可以造成部分患者漏診，且檢測AFP難以排除慢性活動性肝炎、生殖腺腫瘤的干擾，診斷特異性有待提高。臨床診斷仍然需要特異性高、敏感性好的可以在血清中方便檢出的腫瘤標記物來協助AFP診斷肝癌。因此，本領域對于特定癌癥的準確和特異性的檢測有迫切的需求。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在于提供TUFTl在肝癌診斷和治療中的應用。
[0007]在本發明的第一方面，提供一種TUFTl基因或其編碼的蛋白(Tuftelinl)的下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療肝癌的組合物。
[0008]在一個優選例中，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑選自:核酸抑制物(如干擾分子)，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結合分子，其能夠在蛋白或基因水平上下調TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性。
[0009]在另一優選例中，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑選自:以TUFTl基因或其轉錄本為靶序列、且能夠抑制TUFTl基因表達或基因轉錄的干擾分子，包括:shRNA(小發夾RNA)、小干擾RNA(SiRNA)、dsRNA、微小RNA、反義核酸，或能表達或形成所述shRNA、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA、反義核酸的構建物；或特異性與TUFTl編碼的蛋白結合的結合分子(如能夠抑制TUFTl蛋白活性的抗體或配體)。
[0010]在另一優選例中，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑是選自下組序列的SiRNA:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5 或 SEQ ID NO:6。
[0011]在另一優選例中，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑還用于:抑制肝癌細胞的侵襲、抑制肝癌細胞的增殖。
[0012]在本發明的另一方面，提供一種用于預防、緩解或治療肝癌的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑，其是選自下組序列的SiRNA:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5或 SEQ ID NO:6。
[0013]在本發明的另一方面，提供一種用于預防、緩解或治療肝癌的組合物，所述的組合物含有:
[0014](1)所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白下調劑(較佳地，為有效量的)；和
[0015](2)藥學上可接受的載體。
[0016]在本發明的另一方面，提供一種篩選預防、緩解或治療肝癌的潛在物質的方法，所述方法包括:
[0017](1)用候選物質處理表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系；和
[0018](2)檢測所述體系中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性；
[0019]其中，若所述候選物質可降低TUFTl編碼蛋白的表達或活性(優選顯著降低，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)，則表明該候選物質是預防、緩解或治療肝癌的潛在物質。
[0020]在另一優選例中，所述的體系選自:細胞體系(如表達TUFTl的細胞，更特別如HCCLM3細胞)(或細胞培養物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系.
[0021]在另一優選例中，所述的候選物質包括(但不限于):針對TUFTl基因或其編碼的蛋白或其上游或下游基因或蛋白設計的干擾分子、核酸抑制物、結合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。
[0022]在另一優選例中，所述的方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質中進一步選擇和確定對于預防、緩解或治療肝癌有用的物質。
[0023]在另一優選例中，步驟(1)包括:在測試組中，將候選物質加入到表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系中；和/或
[0024]步驟(2)包括:檢測測試組的體系中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系；[0025]如果測試組中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性在統計學上低于對照組，就表明該候選物是預防、緩解或治療肝癌的潛在物質。
[0026]在本發明的另一方面，提供一種TUFTl基因或其編碼的蛋白或特異性識TUFTl基因或其編碼的蛋白的試劑的用途，用于制備檢測(包括診斷、療效評估和預后預測)肝癌的試劑或試劑盒。
[0027]在另一優選例中，所述的特異性識別TUFTl基因或其編碼的蛋白的試劑選自:
[0028]特異性擴增TUFTl基因的引物；
[0029]特異性識別TUFTl基因的探針；或
[0030]特異性結合TUFTl編碼的蛋白的抗體或配體。
[0031]較佳的，所述的特異性擴增TUFTl基因的引物是引物對，序列如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11 所示。
[0032]較佳的，所述的特異性結合TUFTl編碼的蛋白的抗體是SIGMA公司的Tuftelinl特異性抗體。
[0033]在本發明的另一方面，提供一種檢測(包括診斷、療效評估和預后預測)肝癌的試劑盒，所述的試劑盒中含有:特異性識別TUFTl基因或其編碼的蛋白的試劑(較佳地，所述的試劑是抗TUFTl抗體)；以及使用說明書或標簽，其中說明所述試劑盒用于診斷肝癌。
[0034]在本發明的另一方面，提供一種檢測肝癌的方法，該方法包括下列步驟:
[0035]a)將與放射性核素偶`聯的TUFTl核酸探針輸給動物；
[0036]b)檢測所述核酸探針在體內的聚集；
[0037]c)所述聚集表明肝癌的存在。
[0038]在另一優選例中，所述放射性核素是α -32Ρ。
[0039]在另一優選例中，所述動物是人。
[0040]在本發明的另一方面，提供一種肝癌診斷試劑盒，該試劑盒含有容器，所述容器中含有抗TUFTl抗體；以及標簽，所述標簽說明所述試劑盒用于診斷肝癌。
[0041]在本發明的另一方面，提供一種體外檢測特異性TUFTl蛋白表達的方法，該方法包括:用抗TUFTl蛋白特異性抗體或TUFTl特異性核酸探針與細胞樣品反應，以正常肝細胞為對照；比較抗體或探針的結合量，其中高于對照的量表明該細胞為肝癌細胞，低于或等于對照的量表明該細胞為正常細胞。
[0042]在另一優選例中，所述結合量是通過檢測與探針或抗體偶聯的可檢測基團測得的。
[0043]在另一優選例中，所述可檢測基團選自生色團、化學發光基團、熒光團或同位素。
[0044]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1、18對肝癌/癌旁組織TUFTl表達(C=肝癌，N=癌旁)。
[0046]圖2、TUFTl在肝癌癌組織和癌旁組織的mRNA水平的Real Time-PCR分析(C=肝
癌，N=癌旁)。
[0047]圖3、肝癌組織免疫組化染色結果。[0048]圖4、癌旁組織免疫組化染色結果。
[0049]圖5、TUFTl在肝癌細胞株中的表達情況(Real Time PCR結果)。
[0050]圖6、TUFTl在肝癌細胞株中的表達情況(Western Blot結果)。
[0051]圖7、SMMC-7721過表達細胞單克隆株的篩選結果。
[0052]圖8、SMMC-7721過表達細胞CCK-8細胞增殖實驗結果以及HCC-LM3細胞干擾后增
殖實驗結果。
[0053]圖9、過表達TUFTl對SMMC-7721細胞的侵襲作用效果，其中右圖是左圖的細胞平均數的統計結果。
[0054]圖10、干擾TUFTl對HCCLM3細胞的侵襲作用效果，其中右圖是左圖的細胞平均數的統計結果。
[0055]圖11、過表達TUFTl對SMMC-7721細胞的抗失巢凋亡作用效果。
【具體實施方式】
[0056]本發明人經過深入的研究，首次發現肝癌組織中TUFTl基因的表達顯著高于周圍的癌旁組織，提示檢測TUFTl基因表達水平可成為肝癌早期診斷的輔助診斷指標之一，干擾TUFTl基因表達可成為肝癌治療的新途徑。
[0057]TUFTl及其用途
[0058]TUFTl基因編碼的Tuftelinl蛋白(下文也稱為TUFTl蛋白)包括全長的Tuftelinl蛋白或其生物活性片段。優選的，所述的TUFTl蛋白的氨基酸序列可以與SEQID N0:2所示的序列基本上相同。所述的TUFTl基因的核苷酸序列可以與SEQ ID NO:1所示的序列或該序列的簡并序列基本上相同。
[0059]本發明人構建了表達TUFTl的慢病毒載體以及表達針對TUFTl設計的SiRNA序列，并轉染肝癌細胞，得到TUFTl過表達和干擾的肝癌細胞株，用于評價TUFTl過表達和干擾對肝癌細胞增殖、凋亡及侵襲轉移的影響。結果發現，TUFTl是一個新的、對肝癌的研究有用的藥物靶點。針對TUFTl的各種治療手段可以作為抑制肝癌的新穎和有效的手段。
[0060]TUFTl的下調劑及其用途
[0061]基于本發明人的上述新發現，本發明提供了一種TUFTl的下調劑的用途，用于制備抑制(哺乳動物)肝癌的組合物。
[0062]如本文所用，所述的TUFTl基因或蛋白的下調劑包括了抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。
[0063]所述的TUFTl基因或蛋白的下調劑是指任何可降低TUFTl蛋白的活性、降低TUFTl基因或蛋白的穩定性、下調TUFTI蛋白的表達、減少TUFTI蛋白有效作用時間、或抑制TUFTI基因的轉錄和翻譯的物質，這些物質均可用于本發明，作為對于下調TUFTl有用的物質，從而可用于預防或治療肝癌。例如，所述的抑制劑是:核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶，蛋白結合分子，只要其能夠在蛋白或基因水平上下調TUFTl蛋白或其編碼基因的表達。
[0064]作為本發明的一種選擇方式，所述的TUFTl的下調劑是一種特異性與TUFTl結合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。可用TUFTl蛋白免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等來生產多克隆抗體；多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達TUFTl或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler 等人，Nature 256 ；495,1975 ；Kohler 等人，Eur.J.1mmunol.6:511,1976 ；Kohler等人，Eur.J.1mmunol.6:292,1976 ;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and TCell Hybridomas, Elsevier, N.Y.，1981)。抗體的“特異性”是指抗體能結合于TUFTl基因產物或片段。較佳地，指那些能與TUFTl基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。抗Tuftelinl蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的Tuftelinl蛋白含量，還可以作為用于預防肝癌轉移和侵襲的特異性治療劑。血樣或尿液中的Tuftelinl蛋白的直接測定可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標，也可作為腫瘤早期診斷的依據。抗體可以通過ELISA、Western Blot印跡分析，或者與檢測基團偶聯，通過化學發光、同位素示蹤等方法來檢測。
[0065]在得知了所針對的下調對象(TUFTl)后，可以設計出合適的SiRNA或shRNA等干擾分子，這些干擾分子都可應用于本發明中。
[0066]作為本發明的一種優選方式，所述的TUFTl的下調劑是一種TUFTl特異性的小干擾RNA分子(small interfering RNA, Si RNA) ?如本文所用，所述的“小干擾RNA”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式,它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產生合成的雙鏈RNA復合物。
[0067]在篩選有效的SiRNA序列時，本發明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發明人設計合成了多種siRNA序列，并將它們分別通過轉染試劑轉染肝癌細胞系進行驗證，結果檢測出4種干擾效果較好的干擾分子，它們分別具有SEQ ID NO: 3,SEQ IDNO:4,SEQ ID N0:5或SEQ ID N0:6所`示的序列，進一步地在細胞、動物水平實驗，結果證明對于體內試驗而言抑制效率非常高。`
[0068]作為本發明的一種可選方式，所述的TUFTl的下調劑也可以是一種“小發夾RNA(Small hairpin RNA，shRNA) ”，其是能夠形成發夾結構的非編碼小RNA分子，小發夾RNA能夠通過RNA干擾途徑來抑制基因的表達。如上述，shRNA可以由編碼需要的轉錄物的雙鏈DNA模板來表達。編碼需要的轉錄物的雙鏈DNA模板被插進一個載體，例如質粒或病毒載體，然后在體外或體內連接到一個啟動子進行表達。shRNA在真核細胞內DICER酶的作用下，可被切割成小干擾RNA分子，從而進入RNAi途徑。“shRNA表達載體”是指一些本領域常規用于構建shRNA結構的質粒，通常該質粒上存在“間隔序列”以及位于“間隔序列”兩邊的多克隆位點或供替換序列，從而人們可以將shRNA (或類似物)相應的DNA序列通過正向和反向的方式插入多克隆位點或替換其上的供替換序列，該DNA序列轉錄后的RNA可形成shRNA(Short Hairpin)結構。所述的“shRNA表達載體”目前已經完全可以通過商購的途徑購買獲得，例如一些病毒載體。[0069]本發明中，所述的“基本互補”或“基本上互補”指的是一條核苷酸序列對于另一條特定的核苷酸序列有至少80%，較佳的90%，更佳的95%，最佳的100%的互補性。
[0070]本發明的核酸抑制物如SiRNA可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結構里的表達盒轉錄成單鏈RNA之后進行制備。siRNA等核酸抑制物，可通過采用適當的轉染試劑被輸送到細胞內，或還可采用本領域已知的多種技術被輸送到細胞內。
[0071]基因表達載體包括非病毒載體和病毒載體，其中病毒載體包括逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、慢病毒載體等。慢病毒載體將HIV-1基因組中的順式作用元件(如包裝信號、長末端重復序列)和編碼反式作用蛋白的序列進行分離而構建的載體系統，包括包裝成分和載體成分:包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉錄和整合所需的順式作用序列而構建，能反式提供產生病毒顆粒所需的蛋白；載體成分與包裝成分互補，含有包裝、逆轉錄和整合所需的HIV-1順式作用序列，同時具有異源啟動子控制下的多克隆位點及在此位點插入的目的基因。包裝成分可分別構建在兩個質粒上，即一個表達gag和pol、另一個表達env，與載體質粒構成三質粒表達系統。為了進一步降低同源重組形成有復制能力的病毒(RCV)的可能性,Dull等人將包裝質粒中的輔助基因去除,將gag-pol的轉運需要的rev構建到另一個質粒上，構建成四質粒表達系統。
[0072]組合物
[0073]本發明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.00000 l-50wt% ;較佳的0.00001-20wt% ;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的TUFTl的下調劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肝癌。任何前述的TUFTl的下調劑均可用于組合物的制備。
[0074]如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所 述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體:它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、PH緩沖物質等。所述的載體中還可以含有細胞轉染試劑。
[0075]在得知了所述TUFTl基因或蛋白的下調劑的用途后，可以采用本領域熟知的多種方法來將所述的下調劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于:皮下注射、肌肉注射、經皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優選的，所述給藥方式是非腸道給予的。
[0076]優選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將TUFTl的下調劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶TUFTl的下調劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或siRNA或shRNA)遞送到靶點上，并使之表達活性的TUFTl下調劑，具體情況需視所述的下調劑的類型而定，這些均是本領域技術人員所熟知的。
[0077]本發明所述的TUFTl的下調劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于:所述的TUFTl基因或蛋白的下調劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當本發明的TUFTl的下調劑每天以約0.00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。
[0078]藥物篩選
[0079]在得知了 TUFTl與肝癌的密切相關性后，可以基于該特征來篩選抑制TUFTl的表達或活性的物質。可從所述的物質中找到對于預防或治療肝癌真正有用的藥物。
[0080]因此，本發明提供一種篩選抑制肝癌的潛在物質的方法，所述的方法包括:用候選物質處理表達TUFTl的體系；和檢測所述體系中TUFTl的表達或活性；若所述候選物質可抑制TUFTl的表達或活性，則表明該候選物質是抑制肝癌的潛在物質。所述的表達TUFTl的體系例如可以是細胞(或細胞培養物)體系，所述的細胞可以是內源性表達TUFTl的細胞；或可以是重組表達TUFTl的細胞。所述的表達TUFTl的體系還可以是亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系(如動物模型，優選非人哺乳動物的動物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。
[0081]在本發明的優選方式中，在進行篩選時，為了更易于觀察到TUFTl的表達或活性的改變，還可設置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質的表達TUFTl的體系。
[0082]作為本發明的優選方式，所述的方法還包括:對獲得的潛在物質進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于抑制肝癌真正有用的物質。
[0083]本發明對于TUFTl蛋白的表達、活性、存在量或分泌情況的檢測方法沒有特別的限制。可以采用常規的蛋白定量或半定量檢測技術，例如(但不限于)=SDS-PAGE法，Western-Blot 法等。
[0084]另一方面，本發明`還提供了采用所述篩選方法獲得的抑制肝癌的潛在物質。這些初步篩選出的物質可構成一個篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選出能夠對于抑制TUFTl的表達和活性，進而抑制肝癌有用的物質。
[0085]檢測試劑或試劑盒
[0086]基于本發明人的上述新發現，可以將TUFTl作為檢測肝癌的標志物:(i)進行肝癌細胞的鑒別診斷；(ii)評估相關人群的肝癌治療藥物、藥物療效、預后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評估相關人群肝癌患病風險，早期監測早期防治。比如，可分離出由TUFTl基因表達異常而潛在高發肝癌的人群，從而可進行更有針對性地診斷或治療。
[0087]因此，本發明提供了 TUFTl基因或蛋白的用途，用于制備診斷(或檢測)肝癌的試劑或試劑盒。
[0088]可采用各種本領域已知的技術來檢測TUFTl的存在與否以及表達情況，這些技術均包含在本發明中。例如可用已有的技術如Southern印跡法、Western印跡法、DNA序列分析、PCR等，這些方法可結合使用。
[0089]本發明還提供了用于在分析物中檢測TUFTl的存在與否以及表達情況的試劑。優選的，當進行基因水平的檢測時，可以采用特異性擴增TUFTl的引物；或特異性識別TUFTl的探針來確定TUFTl的存在與否；當進行蛋白水平的檢測時，可以采用特異性結合TUFTl蛋白的抗體或配體來確定TUFTl蛋白的表達情況。
[0090]針對TUFTl的引物或特異性探針的設計是本領域人員熟知的技術，例如，制備一種探針，其可與TUFTl基因上特定位點發生特異性結合，而不與TUFTl基因以外的其它基因特異性結合，且所述探針帶有可檢測信號。
[0091]在獲得了核酸序列后，可根據核酸序列設計特異性核酸探針。設計探針的方法是本領域常規的，可見Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述。檢測生物樣品中是否存在Tuftelinl蛋白或核酸的示范性方法包括獲得測試受試者的生物樣品，使該生物樣品接觸能與TUFTl mRNA或基因組DNA雜交的標記的核酸探針。該核酸探針可以是，例如人的核酸或及一部分，如長至少15、30、50、100個核苷酸并能在嚴謹條件下與TUFTl mRNA或基因組DNA充分雜交的核酸探針。核酸探針與擴增的標記序列接觸。該探針優選連接到一種發色團，但可被放射標記。在另一個實施例中，探針連接到一種結合伴侶上，如抗體或生物素，或另一種攜帶可檢測結構域的結合伴侶上。
[0092]在傳統的方法中，檢測可通過Southern印跡以及與標記的探針雜交來進行。Southern印跡所涉及的技術是本領域技術人員所熟知的(參見Sambrook等，1989)。常規的檢測還有生物芯片、熒光顯影技術、細胞流式計數等。
[0093]利用特異性結合TUFTl蛋白的抗體來檢測分析物中TUFTl蛋白表達情況的方法也是本領域人員熟知的技術。
[0094]本發明還提供了用于在分析物中檢測TUFTl的存在與否以及表達情況的試劑盒，該試劑盒包括:特異性擴增TUFTl基因的引物；特異性識別TUFTl基因的探針；或特異性結合TUFTl蛋白的抗體或配體。
[0095]在一個非限制的實例中，所述試劑盒將以適當的容器形式包含這些試劑中的一種或多種。所述試劑盒也可包含用于RNA分離、擴增細胞中RNA的純化的試劑、標記等。
[0096]此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、PCR、雜交、顯色等所需的各種試劑，包括但不限于:抽提液、擴增液、雜交液、酶、對照液、顯色液、洗液等。
[0097]試劑盒的組分可以以水介質的形式或以凍干的形式來包裝。試劑盒中適當的容器通常至少包括一種小瓶、試管、長頸瓶、寶特瓶、針筒或其它容器，其中可放置一種組分，并且優選地，可進行適當地等分。在試劑盒中存在多于一種的組分時，試劑盒中通常也將包含第二、第三或其它附加的容器，其中分離地放置附加的組分。然而，不同組合的組分可被包含在一個小瓶中。本發明的試劑盒通常也將包括一種用于容納反應物的容器，密封以用于商業銷售。這種容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。
[0098]此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等。
[0099]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0100]實施例1、肝癌組織切片的免疫組化研究
[0101]本發明收集了 254對肝癌患者的肝癌組織標本和癌旁組織(正常組織)標本，進行組織病理學研究。其中52對樣本購自上海芯超生物科技有限公司，另外202對樣本由上海交通大學附屬仁濟醫院以及上海東方肝膽外科醫院提供。
[0102]本發明將肝癌組織和癌旁組織制成石蠟切片，采用Tuftelinl特異性抗體(多克隆抗體，購自SIGMA公司；一抗)、辣根過氧化物酶標記二抗(購自Abmart公司；HRP_ 二抗)、二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色底物進行免疫染色。經免疫染色的成對標本切片進行鏡檢，以癌旁組織切片為對照，肝癌組織切片染色較深者為高表達，較淺者為低表達，進行組織病理學研究，并統計研究結果。
[0103]選取部分標本,采用Tuftelinl特異性抗體(一抗)、抗兔突光二抗,進行WesternBlot研究，用于和免疫組化結果進行驗證。
[0104]免疫染色實驗
[0105]上述肝癌組織、癌旁組織順序編號，按常規方法制備石蠟切片。
[0106]將石蠟切片置于60°C烘片機上烘烤20分鐘，然后按二甲苯10minx2-l/2 二甲苯10min-100% 酒精 10minx2_95% 酒精 10min_85% 酒精 10min_75% 酒精 IOmin 流程脫蠟。將脫蠟完畢的切片在流水中沖洗10分鐘，然后放置于0.01M檸檬酸鈉緩沖液中在沸水浴中抗原復活10分鐘。將切片自然冷卻至室溫后，放置于37°C 0.3%H202中去除內源過氧化物酶。用IXPBS清洗一遍后用10%BSA室溫封閉I小時，然后用1%BSA配置好的一抗4°C孵育過夜。第二天用I X PBS清洗3遍，用1%BSA配置的HRP 二抗室溫孵育1-2小時。之后用IXPBS清洗3遍，用DAB顯色液進行顯色5-10秒。顯色完畢后用流水沖洗10分鐘以上，然后再用蘇木精染色I分半，在流水中沖洗5分鐘。之后按75%酒精5min-85%酒精5min_95%酒精5min-100%酒精5minX 2-1/2 二甲苯5min_ 二甲苯5minX 2流程進行脫水。最后用中性樹脂封片。
[0107]結果
[0108]用顯微鏡觀察肝癌組織樣本中TUFTl的表達的染色情況。以癌旁組織作為對照，按照陽性反應的區域大小以及顏色的強弱將標本分組并進行統計。18對肝癌/癌旁組織TUFTl表達情況如圖1 ; 18對肝癌/癌旁組織中，肝癌組織標本表達量顯著高于癌旁組織標本的占72.22%。
[0109]進一步統計發現，254對`標本中，70.4%肝癌組織標本中TUFTl表達顯著高于癌旁組織。如圖2。
[0110]代表性的肝癌組織免疫組化染色結果如圖3所示。
[0111]代表性的癌旁組織免疫組化染色結果如圖4所示。
[0112]實施例2、干擾、過表達慢病毒載體構建及慢病毒包裝
[0113]TUFTl基因采用人TUFTl cDNA的完整編碼區(開放閱讀框)作為目的基因，完整編碼區序列如下(SEQ ID NO:1):
[0114]atgaacggga cgcggaactg gtgtaccctg gtggacgtgc acccagagga ccaggcggcg 60
[0115]ggcagcgtgg acattctcag gctgactctc cagggtgaac tgacaggaga tgaacttgaa 120
[0116]cacatagccc agaaggcggg caggaagacc tatgccatgg tgtccagcca ctcagctggt 180
[0117]cattctctgg cttcagaact ggtggagtcc catgatggac atgaggagat cattaaggtg 240
[0118]tacttgaagg ggaggtctgg agacaagatg attcacgaga agaatattaa ccagctgaag 300
[0119]agtgaggtcc agtacatcca ggaggccagg aactgcctac agaagctccg ggaggatata 360
[0120]agtagcaagc ttgacaggaa cctaggagat tctctccatc gacaggagat acaggtggtg 420
[0121]ctagaaaagc caaatggctt tagtcagagt cccacagccc tgtacagcag cccacctgag 480
[0122]gtggacacct gtataaatga ggatgttgag agcttgagga agacggtgca ggacttgctg 540
[0123]gccaagcttc aggaggccaa gcggcaacac cagtcagact gtgtggcttt tgaggtcaca 600
【權利要求】
1.一種TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑的用途，用于制備預防、緩解或治療肝癌的組合物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑選自: 核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結合分子，其能夠在蛋白或基因水平上下調TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑是選自下組序列的 SiRNA:SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6。
4.一種用于預防、緩解或治療肝癌的TUFTl基因或其編碼的蛋白的下調劑，其特征在于，其是選自下組序列的 SiRNA:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0:5 或 SEQ ID N0:6。
5.一種用于預防、緩解或治療肝癌的組合物，其特征在于，所述的組合物含有: (1)權利要求4所述的TUFTl基因或其編碼的蛋白下調劑；和 (2)藥學上可接受的載體。
6.一種篩選預防、緩解或治療肝癌的潛在物質的方法，所述方法包括: (1)用候選物質處理表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系；和 (2)檢測所述體系中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性； 其中，若所述候選物質可降低TUFTl編碼蛋白的表達或活性，則表明該候選物質是預防、緩解或治療肝癌的潛在 物質。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)包括:在測試組中，將候選物質加入到表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系中；和/或 步驟(2)包括:檢測測試組的體系中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質的表達或含有TUFTl基因或其編碼的蛋白的體系； 如果測試組中TUFTl基因或其編碼的蛋白的表達或活性在統計學上低于對照組，就表明該候選物是預防、緩解或治療肝癌的潛在物質。
8.—種TUFTI基因或其編碼的蛋白或特異性識TUFTI基因或其編碼的蛋白的試劑的用途，用于制備檢測肝癌的試劑或試劑盒。
9.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的特異性識別TUFTl基因或其編碼的蛋白的試劑選自: 特異性擴增TUFTl基因的引物； 特異性識別TUFTl基因的探針；或 特異性結合TUFTl編碼的蛋白的抗體或配體。
10.一種檢測肝癌的試劑盒，所述的試劑盒中含有:特異性識別TUFTl基因或其編碼的蛋白的試劑；以及使用說明書或標簽，其中說明所述試劑盒用于診斷肝癌。
【文檔編號】A61K45/00GK103800919SQ201210455058
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月14日 優先權日:2012年11月14日
【發明者】張志剛, 馬銘澤, 李軍 申請人:上海市腫瘤研究所