專利名稱：多孔生物材料的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種使用膠原制備而成的生物材料，特別涉及一種使用動物組織中的膠原制備而成的生物材料。
背景技術：
膠原是構成動物機體的重要功能物質，廣泛存在于動物骨、軟骨、肌腱、皮膚以及其他結締組織中，約占哺乳動物總蛋白的三分之一，是動物體中最豐富的蛋白資源。目前已確認的膠原有28種，包括從I型到X X珊型，其中I型膠原在動物體內含量最多并且其免疫原性比其他型膠原要低得多，因而被運用的也最為廣泛。不同型的膠原由于分子中多肽鏈的初級結構不同，其生理特性也有差別。膠原基本結構為由三條肽鏈組成的三股螺旋繩狀結構，肽鏈則由一系列氨基酸排列組成，其中氨基酸的排布序列影響膠原的生物性能。膠 原纖維在自然組織中與相鄰的蛋白、糖類或脂類形成三維結構以提供適合細胞生長的內環境，共同形成具有功能的組織。近年來隨著人們健康意識的提高和組織工程材料研究的迅猛發展，尋求到具有良好生物相容性和力學性能的醫用修復材料已成為業內的迫切需求。大量研究表明膠原是一種具備諸多優點的天然聚合材料，具有其他合成材料無法比擬的生物相容性及特殊的力學性能。同種膠原(來源于人的膠原)在植入人體后無抗原性，可被人體組織接納，與周圍組織迅速整合為一體。然而，同種膠原來源非常有限，因此人們開始對異種膠原(豬或牛等其他動物來源的膠原)進行研究開發，發現異種膠原本身安全無毒，且來源廣泛，還具有價格低廉及易加工成型等優點，也已獲得大量臨床應用的成功案例。異種膠原雖然抗原性較低但并非完全無抗原性，植入人體后在被吸收的過程中導致的炎性反應程度決定了它的轉歸(緩慢降解)和宿主的愈合時間。低度的炎性反應能促進血小板凝結，刺激、促進細胞生長及植入物的轉歸。天然膠原力學強度往往在植入體內后發生改變，在一些部位的轉歸速度通常也比受損部位愈合速度快，在新生組織能完全修復前，植入物完全降解會導致新生組織的再度受創，降低了治療效果，達不到預期目標，理想的情況是轉歸速度與受損組織的愈合速度同步。因此，對膠原進行適當的交聯，通過控制交聯過程來控制交聯程度，既可以進一步降低異種膠原的抗原性，同時也提高了其抗酶解特性和力學強度，從而使植入的膠原制品具有不同的植入壽命。此外，對膠原處理后制成的膠原制品的表面和內部結構的改變也會進一步影響與多種宿主細胞及組織的相互作用。目前膠原已被大量應用于制備膠原基醫用材料及組織工程支架材料，如生物型心臟瓣膜、止血海綿、人工皮膚/敷料，手術縫合線，外科補片等。隨著生物材料技術水平的不斷提高，天然膠原將會得到更好地運用和開發，成為新一代的理想生物材料。正因為許多研究和實踐表明膠原是制備組織工程支架的理想材料，因此將膠原制成支架材料的技術工藝成為了組織工程領域的熱門研究課題。通常的思路是先除去其中的非膠原成分和抗原物質進一步降低其免疫原性，再通過物理或化學方法提高其力學性能和化學穩定性，最后進行干燥。目前報道較多的制備工藝是將天然膠原材料制成膠原溶液后直接涂敷或注入模具，并在空氣中自然干燥成膜或用烘箱加熱烘干，這種工藝的優點是制備周期短，但制得的支架材料中一般沒有孔隙存在，細胞很難向其內部生長；或者是將膠原溶液進行冷凍干燥，工藝較簡單且可獲得很高的孔隙率，通常采用此種工藝制備多孔支架的較多，但此種工藝耗時較長，能耗較大，且制成的材料力學性能不佳。組織工程支架材料的特點之一是需要合適的孔徑和相連的孔形態結構。材料表面結構和物理結構影響種 子細胞粘附、生長和分化。其中孔徑尺寸和互聯互通是結構設計的關鍵因素。合適的孔徑和相連的孔形態誘導并決定細胞的生長于分化，如直徑在15-50 μ m的孔徑誘導肌肉纖維細胞的生長，直徑在20-80 μ m的孔徑誘導上皮及內皮細胞的附著和爬行生長，直徑在50-150 μ m的孔徑誘導類骨質的生長，其中90-120 μ m孔徑誘導軟骨成長，直徑在150-500 μ m的孔徑誘導礦化骨形成。凍干過程中的預凍溫度，溶液濃度，滲透壓等極大地影響了制得的支架材料的孔徑大小、孔隙率及三維網狀結構。其中，支架孔徑大小與冷凍時的預凍溫度有密切關系，在一定范圍內，溫度降低越快，凝固時冰晶形核數越多，凝固時間越短，因此形成的冰晶顆粒越小，最后支架中的孔就越小。而支架孔徑結構取決于材料溶液冷凍時的分相，溶液在凝固過程中會產生一定的溫度梯度，導致冰晶的定向生長，產生一定的結晶取向，最終形成方向性的空隙。而且，膠原溶液的濃度越大，支架孔徑越小越均勻，實際生產過程中可通過控制膠原溶液濃度來調節支架的孔徑大小。然而目前鮮見關于溶液滲透壓與支架材料的孔徑關系的報道。此外，將天然膠原制成膠原溶液的過程中，容易引起膠原螺旋區結構的斷裂，破壞了天然膠原的生物活性，且制成的支架材料往往不能滿足生物力學性能的要求。因此本發明尋求在保留天然膠原原有的螺旋區結構的基礎上，通過控制化學處理、凍干過程中的溫度和溶液滲透壓來調節支架材料的孔徑大小，滿足生物材料的使用需求。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的多孔生物材料，通過對天然膠原進行特定工藝處理，并根據使用需求的不同對過程參數加以控制，從而制作出具有良好生物相容性，適當力學性能，降解速率可控的多孔性生物材料。本發明所提供的多孔生物材料可進行植入，起到支架作用，供受損部位周圍的細胞進入其中生長，從而修復人體受損組織，也可作為培養一般細胞或干細胞等的基質材料。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種制備多孔生物材料的方法，包括以下具體步驟(I)預處理使用來自天然組織的膠原材料，例如豬、牛等動物的心包、皮膚、肌腱、硬腦(脊)膜等含有較多膠原的組織，僅用物理方法如手撕，剪刀鑷子等去除組織上的多余脂肪，血跡等雜質。(2)腫脹處理將⑴中處理后的膠原材料用O. 01N-2N濃度的酸或堿液處理1-2小時，可初步改變膠原纖維之間空隙及材料的含水性，從而改變孔隙分布及大小。(3)滲透壓調節根據需要不同，將(2)中處理后的膠原材料用不同滲透壓的溶液進行多次清洗，不同滲透壓溶液包括低滲溶液，等滲溶液和高滲溶液。其中，滲透壓小于280m0sm/kg為低滲溶液,滲透壓在280m0sm/kg至320m0sm/kg之間為等滲溶液,滲透壓大于320m0sm/kg為高滲溶液。用于清洗的溶液滲透壓越高，基材含水量越少，在后續凍干過程中形成的孔徑越小，用于清洗的溶液滲透壓越低，基材含水量越多，在后續凍干過程中形成的孔徑越大。(4)化學交聯將⑶中處理后的膠原材料完全浸沒在交聯劑中對膠原進行固定，交聯劑可以是醛類，碳亞二胺或/和環氧類等化合物，交聯劑通過與膠原分子間較活潑的氨基及羧基發生化學反應，降低膠原基材的免疫原性，并提高基材本身的力學強度。通過控制交聯劑濃度和交聯時間，交聯劑濃度越大，時間越長，則交聯程度越強，經交聯后的膠原纖維可移動性越弱，抗降解能力越強，降解越緩慢；交聯劑濃度越小，時間越短，則交聯程度越弱，經交聯后的膠原纖維可移動性越強，抗降解能力越弱，降解越快。此外，交聯劑與材料反應過程中形成的一些親水基團，如羥基，凍干后復水時可與水分子迅速結合，使水分子迅速滲入材料孔隙中，復水時間大為縮短，復水后具有良好的彈性。(5)清洗將⑷中處理后的膠原材料用不同滲透壓的溶液進行多次清洗，不同滲透壓溶液包括低滲溶液，等滲溶液和高滲溶液。其中，滲透壓小于280m0sm/kg為低滲溶液， 滲透壓在280m0sm/kg至320 mOsm/kg之間為等滲溶液,滲透壓大于320 mOsm/kg為高滲溶液。(6)凍干第一步，將(5)中處理后的膠原材料先進行預凍處理方案I可將其置于兩個可感應并可調控溫度的平面介質之間，例如兩個平面介質中各附有可通液氮的制冷管，并在介質中放置溫度傳感器，溫度控制器一側與溫度傳感器相連，接收傳感器數據，另一側與液氮泵相連，控制泵出的液氮流量大小，從而可控制膠原材料不同面的降溫速率，并使膠原材料溫度降至要求達到的預凍溫度；方案2將一種導熱系數大于2W/m · 1的平面介質預凍至與環境一致的溫度后，迅速將膠原材料置于平面介質上，再置于剛才的預凍環境中預凍1-3小時降至與環境溫度一致，膠原材料與介質接觸的一面，降溫速率較快，膠原材料未與介質接觸的一面，降溫速率較慢。其中，預凍環境溫度范圍為0°C至-200°C，材料降溫速率可達到的范圍為O. I0C /min-50°C /min。第二步，將預凍后的產物放入凍干機于0°C至-100°C溫度下進行凍干。總之，溶液滲透壓越高，材料含水量越低，預凍溫度越低，降溫速率越快，則冰晶形成越小越均勻，形成的孔徑越小，孔隙率越高；溶液滲透壓越低，材料含水量越高，預凍溫度越高，降溫速率越慢，則冰晶形成越大越不均勻，形成的孔徑越大，孔隙率越小；(7)包裝及滅菌將凍干后的產品密封包裝后，進行輻照或環氧乙烷滅菌。較佳的，所述堿為NaOH、KOH和/或Ca (OH) 2。較佳的，所述酸為HCl和/或過氧乙酸。較佳的，所述不同滲透壓的溶液為低滲溶液如蒸餾水，等滲溶液如生理鹽水、PBS緩沖液，12. 5g/L的NaHCO3溶液，高滲溶液如質量濃度為1% -10%的NaCl溶液。較佳的，(4)中所述交聯劑為戊二醛、碳化二亞胺和/或乙二醇二縮水甘油醚。本發明所述平面介質指的是可傳遞能量的平面形狀的介質；優選鋁合金板、銅板和/或不銹鋼板。本發明的有益效果在于(I)保留天然活性使用膠原材料來自天然組織，來源可以是豬、牛等動物的心包、皮膚、肌腱、硬腦(脊)膜等含有較多膠原的組織，且處理過程中未破壞其螺旋區結構，保留了生物活性；(2)可控孔徑大小及孔隙率可根據接觸的組織要求不同，通過酸或堿性處理改變膠原纖維之間的空隙、控制凍干過程中的材料表面溫度變化和溶液滲透壓等工藝來調節材料的孔徑大小，制成不同的多孔性以適合相應細胞進入生長；(3)特殊的復水性交聯工藝中根據需要采用親水性或疏水性交聯劑，改變產品凍干后的復水性能及細胞對產品的親附程度；(4)可控降解速率根據使用需求，通過控制交聯過程來控制膠原纖維的交聯程度，改變了膠原纖維的可移動度從而改變預凍過程中膠原纖維之間的空隙大小，進一步影響凍干過程中形成的冰晶大小，最終影響成品的孔徑大小，使得材料的降解速率可控。(5)制成的同一個多孔生物材料的不同面可具有不同的孔徑大小和孔隙率，以適應不同類型細胞長入。
圖I為顯示多孔生物材料上較大的孔徑，30-80 μ m ；圖2為顯示多孔生物材料上較小的孔徑，5-20 μ m ；圖3為預凍裝置A, I為溫度控制器,2為液氮泵,3為液氮容器,4為制冷管,5為連 接線，6為溫度傳感器，7為平面介質，8為膠原組織；圖4為預凍裝置B，7為平面介質，8為膠原組織。
具體實施例方式實施例I :(I)預處理選用檢驗檢疫合格的新鮮牛心包，僅用物理方法如手撕，剪刀鑷子等去除組織上的多余脂肪，血跡等雜質。(2)腫脹處理將(I)中預處理后的牛心包用IN的NaOH浸沒I小時，(3)滲透壓調節將(2)中腫脹處理后的牛心包用純化水清洗6次，每次10分鐘。(4)化學交聯將(3)中滲透壓調節后的牛心包用乙二醇二縮水甘油醚浸沒進行化學交聯15日，(5)清洗將⑷中化學交聯后的牛心包用純化水清洗6次，每次10分鐘。(6)凍干采用圖3所示的預凍裝置A進行預凍，7采用不銹鋼板，調節1，使降溫速率控制在l°C/min，將(5)中清洗后的牛心包8放入，2小時后取出；然后迅速放入_40°C至-20°C的真空凍干機中進行凍干15小時。取出后在電鏡下掃描，孔徑如圖I所示，(7)包裝及滅菌將凍干后的產品密封包裝后，進行輻照或環氧乙烷滅菌。實施例2 (I)預處理選用檢驗檢疫合格的新鮮牛心包，僅用物理方法如手撕，剪刀鑷子等去除組織上的多余脂肪，血跡等。(2)腫脹處理將(I)中預處理后的牛心包用IN的NaOH浸沒I小時，(3)滲透壓調節將(2)中腫脹處理后的牛心包用生理鹽水清洗6次，每次10分鐘。(4)化學交聯將(3)中滲透壓調節后的牛心包用乙二醇二縮水甘油醚浸沒進行化學交聯15日，(5)清洗將⑷中化學交聯后的牛心包用生理鹽水清洗6次，每次10分鐘。(6)凍干采用圖4所示的預凍裝置B進行預凍，將一個導熱系數為200-300W/m· °C的鋁合金方塊預凍至-80°C后，將(5)中清洗后的牛心包一面置于鋁合金方塊上，一起置于_80°C環境中預凍2小時后取出；然后放入_40°C至_20°C真空凍干機中進行凍干15小時。取出后在電鏡下掃描，孔徑如圖2所示。(7)包裝及滅菌將凍干后的產品密封包裝后，進行輻照或環氧乙烷滅菌。實施例3
(I)預處理選用檢驗檢疫合格的新鮮牛心包， 僅用物理方法如手撕，剪刀鑷子等去除組織上的多余脂肪，血跡等。(2)腫脹處理將(I)中預處理后的牛心包用O. 8N的NaOH浸沒I小時。(3)滲透壓調節將⑵中腫脹處理后的牛心包用質量濃度為2% NaCl溶液清洗6次，每次10分鐘。(4)化學交聯將(3)中滲透壓調節后的牛心包用乙二醇二縮水甘油醚進行化學交聯15日，(5)清洗將⑷中化學交聯后的牛心包用質量濃度為2% NaCl溶液清洗6次，每次10分鐘。(6)凍干采用圖4所示的預凍裝置B進行預凍，將一個導熱系數為200-300W/m· °C的鋁合金方塊7預凍至-60°C后，將(5)中清洗后的牛心包一面置于鋁合金方塊上，一起置于_60°C環境中預凍2小時后取出；然后放入_40°C至_20°C真空凍干機中進行凍干15小時。取出后在電鏡下掃描,顯不孔徑為5-30 μ m。(7)包裝及滅菌將凍干后的產品密封包裝后，進行輻照或環氧乙烷滅菌。
權利要求
1.一種制備多孔生物材料的方法，包括以下具體步驟 (1)預處理使用來自動物組織的膠原材料，去除組織上的雜質； (2)腫脹處理將(I)中處理后的膠原材料用O.01N-2N濃度的酸或堿液處理以改變膠原纖維之間的空隙和膠原材料的含水性； (3)滲透壓調節根據需要不同，將(2)中處理后的膠原材料用不同滲透壓的溶液進行清洗； (4)化學交聯將(3)中處理后的膠原材料完全浸沒在交聯劑中對膠原進行固定，所述交聯劑為醛類、碳亞二胺或/和環氧類化合物； (5)清洗根據需要不同，將(4)中處理后的膠原材料用不同滲透壓的溶液進行清洗； (6)凍干先將(5)中處理后的膠原材料于0°C至-200°C環境中進行預凍，然后再置于凍干機中于0°C至-100°C進行凍干； (7)包裝及滅菌將￠)中凍干后的產品密封包裝后，進行輻照或環氧乙烷滅菌。
2.如權利要求I所述的方法，其中，所述堿為NaOH、KOH和/或Ca(OH)20
3.如權利要求I所述的方法，其中，所述酸為HCl和/或過氧乙酸。
4.如權利要求I所述的方法，其中，所述不同滲透壓的溶液為蒸餾水、生理鹽水、PBS緩沖液、12. 5g/L的NaHCO3溶液或/和質量濃度為I % -10%的NaCl溶液。
5.如權利要求I所述的方法，其中⑵中腫脹處理時間為1-2小時。
6.如權利要求I所述的方法，其中，(4)中所述交聯劑為戊二醛、碳化二亞胺和/或乙二醇二縮水甘油醚。
7.如權利要求I所述的方法，其中，(6)中預凍過程中所述膠原材料的降溫速率為O.I °C /min-50°C /min。
8.如權利要求I所述的方法，其中，(6)中所述預凍為將所述膠原材料置于兩個可感應并可調控溫度的平面介質之間，并使膠原材料降至預凍溫度；或將平面介質預凍至與環境一致的溫度后，迅速將膠原材料置于平面介質上，再置于預凍環境中預凍至與環境溫度—致。
9.如權利要求8所述的方法，其中，所述平面介質的導熱系數大于2W/m·°C。
10.如權利要求9所述的方法，其中，所述平面介質為鋁合金板、銅板和/或不銹鋼板。
全文摘要
本發明涉及一種制備多孔生物材料的方法，包括使用來自天然組織的膠原材料，用物理方法去除組織上的雜質，并通過預處理、腫脹處理、滲透壓調節、化學交聯、清洗以及凍干等一系列步驟制備；從而得到具有良好生物相容性，適當力學性能，降解速率可控的多孔性生物材料，所述多孔生物材料可進行植入，起到支架作用，供受損部位周圍的細胞進入其中生長，從而修復人體受損組織，也可作為培養一般細胞或干細胞等的基質材料。
文檔編號A61L27/24GK102921047SQ201210468909
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月19日 優先權日2012年11月19日
發明者楊軍 申請人:上海欣吉特生物科技有限公司