一種靶向egfr受體的肽及其應用的制作方法

專利名稱：一種靶向egfr受體的肽及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種靶向EGFR受體的多肽及其應用，尤其涉及其在修飾的納米脂質載體中的應用，屬藥物制劑領域。
背景技術：
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)廣泛分布于人體各組織細胞膜上，是一種多功能跨膜糖蛋白，屬受體型酪氨酸蛋白激酶(RTK)。與正常細胞相比，腫瘤細胞特別是EGFR陽性腫瘤細胞的生長明顯依賴于EGFR信號轉導，且有顯著的降調節機制缺陷，其EGFR表達水平可比正常細胞高幾千倍。EGFR的信號傳導網絡在腫瘤的形成和發展過程中占據了重要地位，是治療腫瘤的一個很有前景的靶分子，是研究的熱點。
然而越來越多的研究發現，以單克隆抗體或其片段作為配基介導腫瘤靶 向治療， 因靶向配基具有免疫原性在臨床應用具有一定局限性。目前，人源化、小型化的小分子多肽幾乎不被免疫系統注意，且能有效穿透組織并具有被癌細胞選擇性結合和內化的能力使其在提高腫瘤治療靶向性方面具有較大優勢。
據文獻報道，EGFR含有3個可以調控EGFR活性的主要自磷酸化作用位點，分別為 Y1068, Y1148和Y1173。采用序列比較/結構分析的方法設計和篩選了來源于三個主要作用位點的氨基酸序列作為靶向EGFR小分子多肽配體。
納米脂質載體(Nanostructrued lipid carries, NLC)是由固體脂質納米粒 (Solid lipid nanoparticles, SLN)發展而來的一種新型載藥系統。NLC采用生物相容性好、毒性低的類脂材料為載體，制備過程中通過向固態脂質中加入化學差異很大的液態油， 使納米粒以結晶缺陷型或無定型結構存在，可避免放置過程中脂類由高能態的α、β型結晶向規則的β型轉變，避免或減小SLN放置過程中藥物外排的現象，提高藥包封率及穩定性。
普通納米粒如SLN或聚合物納米粒進入體內后，被機體視為異物，易被單核巨噬細胞系統及網狀內皮系統(RES)識別并吞噬，在靜脈給藥時只能作用于吞噬細胞比較豐富的器官，如肝臟、脾等。但若病灶部位不在網狀內皮系統，該類制劑則會增加藥物對網狀內皮系統的毒性。長循環納米脂質載體(long-circulating NLC)是以PEG對NLC表面進行修飾，PEG鏈與水分子的相互作用可在NLC表面形成一層固定水化層，由于血漿蛋白不能與親水表面結合，因此，固定水化層的形成可以防止調理素及蛋白的吸附，避免RES吞噬，延長納米粒在體內的循環時間，使其進入腫瘤等病變部位的機會增加，提高藥物在病灶靶部位的療效。
靶向EGFR的多肽作為靶向配基，并將其與包載抗腫瘤藥物的長循環納米脂質載體偶聯，基于肽配體可與腫瘤細胞表面過度分泌的EGFR特異性結合的原理，將包載化療藥物的長循環納米脂質載體靶向濃集于腫瘤組織，經部分生物降解后，NLC通過EPR效應進入腫瘤組織，對腫瘤進行特異性治療，改善化療藥物的治療效果，降低對正常組織的毒副作用。發明內容
1.本發明的目的是提供與EGFR具有親和性的小分子肽，并提供該相關小肽的分子結構。
2.本發明的另一目的是提供上述小肽在構建腫瘤靶向給藥系統中的用途。
3.本發明通過下述技術方案實施首先設計來自于EGFR主要自磷酸化作用位點的小肽 EY1ci68INQ ( SEQ ID NO:1), PDY1148QQD (SEQ ID NO:2)，AEY1173LR (SEQ ID N0:3),選擇 LARLLT (Shuxian Song, et al. Novel peptide ligand directs liposomes toward EGFR high-expressing cancer cells in vitro and in vivo, FASEB J. 23(2009) 1396-1404.)作為對照，對上述各肽進行FITC標記。采用流式細胞術分析上述各肽與表達 NC1-H1299及K562不同細胞系的結合率。獲得與EGFR高表達的NC1-H1299細胞具有較高的親和活性的肽AEY1173LR,包含氨基酸序列Ala Glu Tyr Leu Arg (以下簡稱PE5)的肽。
4.經體內外親和性及靶向性評價，結果證實，所述的小肽具有與EGFRG高表達的細胞特異親和的特性；所述的小肽用于修飾載藥納米粒、脂質體、泡囊或膠束，構建成腫瘤靶向給藥系統，該類系統能夠提高藥物在腫瘤組織的濃度，增強治療效果，降低全身性的毒副作用。
5.本發明的小肽可用本領域熟知的多肽合成儀或固相方法進行合成。如采用有機化學固相合成Fmoc法合成小分子肽，由C端至N端合成，即將該小肽C端的第一個Fmoc-AA 的羧基活化后與HMP樹脂結合，再脫去Fmoc-保護基，與第二個羧基活化的Fmoc-AA結合， 再脫去Fmoc-保護基，循環重復，直至合成得到肽樹脂，然后用TFA將肽從肽樹脂上切下，得到粗品小肽。
采用高效液相色譜法對小肽粗品進行純化和純度檢測。洗脫系統為①A液: O. 1%TFA的水溶液。②B液B為 含O. 1%TFA的乙腈溶液。用95%A, 5%B 60%A, 40%B，手動進樣，1 mL/次,流速4 mL/min,線性梯度,20 min內。275.5 nm處檢測紫外吸收,按峰收集組分，凍干，進行純度檢測，貯藏在-20 ° C冰箱中備用。純化后的肽以質譜法進行鑒定。
通過液相色譜純化，純度在98%以上，外觀為白色粉末，并通過質譜進結構鑒定 本發明小肽的分子量是650. 74，質譜特征峰651. 27。
6.本發明的肽與納米脂質載體(NLC)的結合為通過接頭的共價結合。
接頭為能夠共價連接本發明的肽和納米脂質載體的物質的交聯劑。交聯劑通常與本發明的肽和納米脂質載體上存在的功能基團(例如-NH2，-C00H，-mal)反應。由于不同交聯劑與不同功能基團反應的能力不同，可以選擇不同的交聯劑。
所述的本發明的肽偶聯的納米脂質載體的制備方法為首先采用具有 DSPE-PEG-C00H、DSPE-PEG-NH2、DSPE-PEG-mal的脂質制備納米脂質載體，然后加入交聯劑將PE5連接到納米粒上。
具體步驟如下(1)將固態脂質材料、液態油、脂溶性乳化劑溶于有機溶劑中，該有機溶劑選自二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙醇或異丙醇，并加熱至60 100°C熔融，以構成有機相；(2)將PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑溶于注射用水中，并加熱至60 100°C， 以構成水相；(3)在60 100°C的溫度下，在攪拌或/和高剪切條件下將所述有機相和水相混合，以制備初乳；(4)對所述初乳進行超聲或高壓均質處理，并傾入冰水中，從而制得長循環納米脂質載體。
(5)長循環納米脂質載體混懸于適當緩沖液中(pH 4. O 6. O)中，分別加入 EDC和S · NHS的水溶液，室溫下反應10 15m in。然后調pH至7. O 8. 5，加入PE5， 室溫孵育過夜，除去游離PE5，即得PE5修飾的長循環納米脂質載體。
可用于實施本發明的抗腫瘤藥物包括但不限于羥基喜樹堿、阿霉素。
7.本發明具有以下有益的技術效果(I)本發明得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，與EGFR親和力高，特異性強。
(2)本發明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于構建靶向治療EGFR高表達的腫瘤的載體。


圖1為流式細胞術測定肽與腫瘤細胞表面結合圖；圖2為腫瘤細胞對FITC標記肽的內吞圖；圖3為非小細胞肺癌組織免疫熒光圖； 圖4為人非小細胞肺癌組織冰凍切片圖；圖5為AEYLR與NLC偶聯的電鏡圖；圖6為AEYLR與NLC偶聯的粒徑分布圖；圖7為NC1-H1299細胞對納米粒的攝取及流式細胞術檢測結果；A. FITC-AEYLR-PEG-NLC, B. FITC-RALEL-PEG-NLC, C. FITC- PEG-NLC0具體實施方式
下面結合實施例對本發明做進一步的說明，但不以任何形式限制本發明。
實施例1EGFR含有3個可以調控EGFR活性的主要自磷酸化作用位點，分別為Y1068，Y1148和 Y1173。采用序列比較/結構分析的方法設計來源于三個主要作用位點的氨基酸序列作為靶向 EGFR 小分子肽配體EY1ci68INQ , PDY1148QQD , AEY1173LR。
為篩選與EGFR結合的特異性強的活性小肽，我們合成了 FITC標記的 EYINQ、PDYQQD, AEYLR、RALEL (無關肽)、NYQQN (Mineo Abe, et al.1nhibition of Autophosphorylation of Epidermal Growth Factor Receptor by a Small Peptide Not Employing an ATP-Competitive Mechanism, Biopolymers 89 (2007) 40-51.)，并選擇了 LARLLT作為對照，對LARLLT也進行了 FITC標記。釆用流式細胞術分析上述各肽與表達 EGFR(NC1-H1299)(圖1A)及幾乎不表達EGFR (K562)(圖1B)的不同細胞系的結合率。
如圖1C，結果表明，上述肽與腫瘤細胞的結合率隨著濃度的增加而增加， FITC-AEYLR (箭頭I所示曲線)與NC1-H1299細胞的結合率都高于FITC-EHNQ、 FITC-PDYQQD，FITC-NYQQN，FITC-RALEL (箭頭之外的 4 條曲線)以及對照肽 FITC-LARLLT (箭頭I所示曲線XFITC-LARLLT與NC1-H1299細胞的結合率都高于FITC-EHNQ、FITC-PDYQQD，FITC-NYQQN, FITC-RALEL。圖1D現顯示上述FITC標記的肽與K562細胞均無顯著的結合。 說明FITC-AEYLR與高表達EGFR的細胞具有較高的結合活性。
實施例2為進一步考察各肽與腫瘤細胞的結合情況，我們進行了細胞內吞實驗(FITCSE 的肽10 μ M與NC1-H1299及Κ562細胞37 °C孵育I小時)，如圖2所示，FITC-AEYLR與 FITC-LARLLT均能有效介導細胞內吞，而K562細胞則無此作用。實驗結果與實施例1 一致。
實施例3為進一步鑒別這種靶向配體是否對人肺癌活檢標本有親和力，我們用免疫組化測試了 AEYLR和RALEL與肺癌患者肺腺癌的反應性。制備人肺腺癌石蠟切片，封閉內源性過氧化酶活性，然后與生物素標記的AEYLR和RALEL —起保溫，用HRP-str印tavidin以常規免疫組化染色來檢測，以EGFR單克隆抗體做對照。
結果如圖3所示，生物素標記的AEYLR能識別人肺腺癌活檢標本中的腫瘤細胞， 所顯示的顏色與EGFR單克隆抗體接近，而生物素標記的無關肽RALEL不能結合肺腺癌活檢標本，無明顯顏色變化。這些數據表明，AEYLR能識別肺腺癌患者癌細胞表面的EGFR。
實施例4制備人肺腺癌冰凍切片，封閉內源性過氧化酶活性，然后與FITC標記的AEYLR和RALEL 顯色，用FITC標記的EGFR抗體做對照。
結果如圖4所示，FITC-AEYLR能識別人肺腺癌活檢標本中的腫瘤細胞,所顯示的熒光比FITC標記的EGFR抗體稍弱，而無關肽FITC-RALEL不能結合肺腺癌患者癌細胞表面的EGFR，未見有明顯熒光。
實施例5為進一步檢測AEYLR作為靶向配基的安全性，進行了 MTT實驗，將NC1-H1299細胞以 5000個/孔的密度接種與96孔板，以不同濃度的AEYLR接種于96孔板，培養96小時。結果顯示AEYLR對細胞沒有明顯的促進增殖和抑制的作用，是一個比較安全的靶向配基。
實施例6為進一步檢驗AEYLR的靶向性，我們采用近紅外染料Cy5. 5標記AEYLR和無關肽 RALEL,通過尾靜脈向 NC1-H1299 移植荷瘤小鼠注射 PBS、Cy5. 5、AEYLR- Cy5. 5、RALEL-Cy5. 5，隨后在不同時間點麻醉小鼠，并用Optix體內熒光成像系統(GE Healthcare)成像。 每組至少3只鼠。注射后不同時間點對小鼠體內Cy5. 5的熒光分布成像。
Cy5. 5染料注射的小鼠中，腫瘤區域的熒光信號與背景一致，但是在AEYLR-Cy5. 5注射的小鼠中，注射后I到6小時之間，與周圍組織相比，腫瘤組織的熒光信號更強， 而無關肽RALEL- Cy5. 5注射的小鼠在腫瘤區域內未顯示出任何熒光聚集。
實施例7將輕基喜樹堿O. 5mg,單硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-C00H 6mg加入適量乙醇溶解，旋轉蒸干除去有機溶劑，80°C熔融作為油相。 將PEG分子量為2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加熱至80°C作為水相。在 600r/min攪拌條件下緩慢將水相加至有機相中，制備初乳；滴加后繼續攪拌lOmin，探頭超聲(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速攪拌冷卻，制得長循環納米脂質載體。
長循環納米脂質載體混懸于Mes buffer ( pH 5.0)中，分別加入EDC和S *NHS的水溶液，室溫下反應10 m in，超濾；加入pH7.4 PBS重懸，加入PE5，室溫孵育過夜，透析除去游離PE5，即得PE5修飾的長循環納米脂質載體。
實施例8按上述納米粒的方法制備過程中加入DSPE-PEG-biotin，滴加avidin_FITC制備熒光標記的NLC。NC1-H1299細胞加入12孔板中過夜培養，加入上述FITC標記的納米粒，37°C 孵育I小時，熒光顯微鏡觀察形態，流式細胞技術測定納米粒與細胞的結合率。
如圖7所示，AEYLR連接的納米粒可有效地使NLC進入細胞，無關肽RALEL連接的納米粒與沒有連接肽的納米粒相比，沒有顯著性差異。
實施例9將PE5與對照肽RALEL溶解在PBS-EDTA中，N-琥珀酰亞胺-3- (2-吡啶二硫代)-丙酸酯(STOP)溶解于DMSO中，室溫下與肽以1. 2:1的摩爾比混合I小時后凍干，得到硫化的肽。DSPE-PEG2000-Mal溶于氯仿中，蒸干形成薄膜，在Ifepes緩沖液(pH7. 4)中水化，濃度大約為0.4馳。將已經硫化的肽加到三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中，室溫下加氮氣孵育I 小時，立刻與DSPE-PEG2000-Mal膠束以5:1的摩爾比混合，在氮氣流下10°C保持攪拌反應過夜。通過HPLC分析，幾乎所有的DSPE-PEG2000-Mal都被修飾。過量的肽可以使用標準的技術除去，凝膠過濾、透析等。
將阿霉素O. 5mg,單硬脂酸甘油酯40mg,大豆油IOmg,磷脂15mg, DSPE-PEG2000-PE5 6mg加入適量乙醇溶解，旋轉蒸干除去有機溶劑，80°C熔融作為油相。將 PEG分子量為2000的硬脂酸酯18mg溶于4. 7ml注射用水中，加熱至80°C作為水相。在 600r/mi n攪拌條件下緩慢將水相加至有機相中，制備初乳；滴加后繼續攪拌lOmin，探頭超聲(20%功率，20s)，然后至冰浴中迅速攪拌冷卻，制得PE5修飾的長循環納米脂質載體。
權利要求
1.一種靶向EGFR受體的肽，其特征在于靶向EGFR受體的肽的序列如SEQ ID NO:1、 SEQ ID N0:2 或 SEQ ID N0:3 所示。
2.根據權利要求1所述的肽，其由SEQID NO:3組成。
3.—種靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于，所述的修飾的納米脂質載體包含下列的序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3。
4.根據權利要求4所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于，其包含位于所述納米脂質載體與所述肽之間的交聯劑。
5.根據權利要求4所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于，所述的納米脂質載體包括固態脂質材料、液態油、脂溶性乳化劑、PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑。
6.根據權利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于，所述的 PEG 修飾的脂類選自 DSPE-PEG-C00H，DSPE-PEG-NH2, DSPE-PEG-mal。
7.根據權利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于所述固態脂質材料為硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三硬脂酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、三月桂酸甘油酯、三肉豆蘧酸甘油酯、蜂蠟、十六醇、十六醇酯、山崳酸甘油酯、卵磷脂、PEG-40硬脂酸酯、PEG-100硬脂酸酯中的任意一種或任意兩種的混合物。
8.根據權利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于所述液態油為大豆油、油酸、花生油、三油酸甘油酯、Miglyol 812、維生素E、維生素A中的一種或任意兩種的混合物。
9.根據權利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于所述脂溶性乳化劑選自磷脂類、脂肪酸山梨坦類、聚山梨酯類、聚氧乙烯、聚氧丙烯共聚物類、聚氧乙烯脂肪酸脂類、聚氧乙烯脂肪醇醚類或其任意組合。
10.根據權利要求5所述的靶向EGFR受體的肽修飾的納米脂質載體，其特征在于還包含一種選自下列的藥物羥基喜樹堿或阿霉素。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及一種靶向EGFR受體的多肽及其應用，本發明的設計來自于EGFR主要自磷酸化作用位點的小肽EY1068INQ(SEQ ID NO:1)，PDY1148QQD(SEQ ID NO:2)，AEY1173LR(SEQ ID NO:3)，所述的肽用于修飾納米脂質載體，所述的納米脂質載體包括固態脂質材料、液態油、脂溶性乳化劑、PEG修飾的脂類、水溶性乳化劑、附加劑。本發明具有如下特點(1)得到的多肽，分子量小，合成方便，成本低廉，與EGFR親和力高，特異性強。(2)本發明得到的小肽，具有良好的EGFR靶向性，可用于構建靶向治療EGFR高表達的腫瘤的載體。
文檔編號A61K47/42GK102993272SQ201210491720
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月28日 優先權日2012年11月28日
發明者潘衛三, 韓翠艷, 楊星鋼, 太玲鈺, 孫明爽, 李靜 申請人:沈陽藥科大學