一種重組人血管內皮抑素顯像劑及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及重組人血管內皮抑素制備分子靶向顯像劑【技術領域】。具體為提供一種新型的正電子放射性核素或釓標記重組人血管內皮抑素顯像劑及其在對多種腫瘤新生血管狀況進行的無創性、動態觀測，進行抗血管生成治療的療效評價及療效預測中的應用。本發明還提供了該顯像劑的制備方法，通過雙功能螯合劑將正電子放射性核素或釓與重組人血管內皮抑素結合。
【專利說明】一種重組人血管內皮抑素顯像劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學領域，具體涉及一種重組人血管內皮抑素制備新型血管生成顯像劑及其在腫瘤血管生成顯像診斷中的用途。
【背景技術】
[0002]腫瘤血管生成在腫瘤生長和轉移過程中起著重要的作用。早在上個世紀70年代，Folkman教授就提出“腫瘤生長和轉移有賴于新生血管形成”的理論。根據這一理論所建立
的抗腫瘤血管生成治療-休眠療法(dormancy therapy)已成為當今腫瘤治療的熱門研究領域之一。一些抗血管生成靶向藥物已應用于臨床，例如貝伐單抗、恩度等。大量的臨床研究證實這些藥物聯合化療或放療給患者帶來了更高的治療有效率。根據藥物作用機理，抗血管生成治療并非直接殺死腫瘤細胞，其治療并不能使腫瘤迅速縮小，而是抑制其生長和轉移。目前用于評價化療療效的RECIST標準及WHO標準均是根據傳統影像學觀測治療前后腫瘤大小變化來判定療效。這樣的療效評價標準顯然不能及時、準確地評價抗血管生成的治療。隨著越來越多的腫瘤抗血管生成治療在臨床的推廣應用，臨床上迫切需要一種新的方法來預測及評價抗血管生成治療。
[0003]正電子發射體層顯像(Positron Emission Tomography, PET)以正電子放射性核素標記的藥物為顯像劑，可以顯示和測定所標記的顯像劑在活體的分布。其可通過標記不同的生物分子顯示不同的生理和病理代謝變化，例如葡萄糖、蛋白質、脂肪及核酸在活體的代謝，在疾病的早期診斷、療效監測、病因學探討及藥物研發等方面起到了重要作用。PET/CT的發明，更是將PET高靈敏度的代謝圖像與CT高分辨率的解剖圖像相融合，使其在疾病的診斷中具有更高的準確性。利用正電子放射性核素進行腫瘤血管生成通路相關分子的標記，就可以通過PET或PET/CT在活體直接反映腫瘤新生血管狀況，使得腫瘤血管生成分子顯像成為可能。
[0004]磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)是基于核磁共振原理的成像技術，已廣泛應用于多種疾病的診斷。MR顯像具有無創、無害性，特別是其對軟組織具有極高的分辨率。釓(Gd)絡合物作為MR造影劑在上世紀80年代就已應用于臨床。目前臨床常用的 Gd 造影劑有:gadopentetate dimeglu-mine (gadoliniumdiethylenetriaminopenta-acetic acid-Gd-DTPA), gadoteridol(Gd-HP-D03A), gadoterate meglumine(gadolinium tetra-azacy-clododecanetetre-aceticacid-Gd-DOTA)和 gadodiamide(Gd-DTPA-bismethylamide)。應用這些Gd造影劑，可以增加腫瘤病灶的檢出率。但目前應用于臨床的Gd造影劑無腫瘤和器官特異性，利用Gd標記某種抗體或生物分子進行特異性的靶向MR分子顯像已成為一個新的研究方向。最近，Tan等報道了利用一種特異性靶向腫瘤基質中的纖維蛋白-纖維鏈接蛋白復合物的MR分子顯像劑，CLT1-G2-(Gd-DOTA)，進行人前列腺癌荷瘤裸鼠MR顯像的研究(Pharm Res.2012; 29 (4):953-60.)。這證明利用Gd絡合物標記生物分子進行靶向MR分子顯像是科學可行的。
[0005]1997年，O’ Reilly等從小鼠的血管內皮瘤細胞(EOMA)的培養血清中分離出的不同于血管抑素的血管生成抑制劑，命名為Endostatin (血管內皮抑素)。對Endostatin的氨基酸序列分析顯示它是膠原XVDI的C末端非膠原區的氨基酸片段，分子量為20kD，包含有184個氨基酸。Endostatin作用的直接靶點為新生血管的內皮細胞，對其它細胞及正常靜止的內皮細胞沒有抑制作用。2005年,重組人血管內皮抑制素(Endostar,恩度)在我國上市，聯合化療藥物用于治療II1、IV期非小細胞肺癌，具有靶向明確、無耐藥性、毒副作用小、潛在抗腫瘤轉移的優勢。恩度在原始Endostatin序列N端基礎上添加了 9個氨基酸，使其性狀更穩定，保持了其在體內的活性。張金赫等應用mI對Endostatin進行標記，結果顯示對Endostatin可以成功進行131I標記，并且產物對內皮細胞的抑制率還高于單純Endostatin,在體外也具有一定的穩定性。但mI僅能用于SPECT顯像,其顯像分辨率較低，限制了其臨床應用。
[0006]因此，鑒于傳統影像學觀測治療腫瘤療效評價和目前131I標記Endostatin作為顯像劑存在的缺陷以及臨床上對于預測及評價抗血管生成治療效果的迫切需要，研制新型重組人血管內皮抑素分子靶向顯像劑進行PET、PET/CT顯像或MR顯像是非常有必要的。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于，為進行活體無創性、動態觀測腫瘤新生血管狀況提供一種新型的分子靶向顯像劑，可用于PET、PET/CT和MR顯像。本發明的另一目的是提供該顯像劑的制備方法及用途，應用正電子放射性核素或釓通過雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑素結合，制成可以供PET、PET/CT顯像或者MR顯像的分子靶向顯像劑，用于人類或其他哺乳動物進行活體無創性、動態觀測腫瘤新生血管狀況。
[0008]本發明提供了一種重組人血管內皮抑制素顯像劑，其特征在于，所述顯像劑具有下式的通式結構:
[0009]R-雙功能螯合劑-X，
`[0010]其中R為正電子放射性核素或禮，X為重組人血管內皮抑制素。
[0011]本發明所述重組人血管內皮抑制素顯像劑中，所述R選自正電子放射性核素或釓(Gd)，其中正電子放射性核素選自:18F、55Co、6°Cu、61Cu、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、82Rb 和 86Y ;所述R-雙功能螯合劑選自:[18F]SFB、[18F] SFBS, [18F] SFMB, [18F] FPA、[18F]FPPD, [18F]FBEM、[18F]FBBO, [18F]NPFP、R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS ;所述重組人血管內皮抑制素優選為 Endostar。
[0012]上述R-DOTA-NHS 選自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS, [61Cu] DOTA-NHS,[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS、[66Ga] DOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y] DOTA-NHS, [Gd]DOTA-NHS ;所述 R-NOTA-NHS 選自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68GajNOTA-NHS, [Gd]NOTA-NHS。
[0013]本發明還提供了一種制備重組人血管內皮抑制素顯像劑的制備方法，包括如下步驟:將R-雙功能螯合劑用乙腈洗脫，用氮氣吹干，再與重組人血管內皮抑制素緩沖溶液反應，反應完畢后對反應產物進行洗脫分離，獲得目標產物。其中R-雙功能螯合劑選自:[18F]SFB、[18F]SFBS, [18F]SFMB, [18F]FPA、[18F]FPPD, [18F]FBEM, [18F]FBB0、[18F]NPFP。
[0014]本發明還提供了另一種制備重組人血管內皮抑制素顯像劑的制備方法，包括如下步驟:先將雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素緩沖溶液反應，制備雙功能螯合劑-重組人血管內皮抑制素，再應用R與雙功能螯合劑-重組人血管內皮抑制素結合，反應完畢后對反應產物進行洗脫分離，獲得目標產物。此處R-雙功能螯合劑選自:R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS，其中所述 R-DOTA-NHS 選自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS, [61Cu] DOTA-NHS,[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS、[66Ga] DOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y] DOTA-NHS, [Gd]DOTA-NHS ；所述 R-NOTA-NHS 選自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68GajNOTA-NHS,[Gd]NOTA-NHS。
[0015]上述兩種標記制備方法中雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素的摩爾比為10~40: 1，優選20: 1，反應溫度為30~45°C，反應時間為10mirT60min，優選反應溫度為37°C，優選反應時間為30min。反應完畢后用脫鹽柱對反應產物進行洗脫分離。其中所述重組人血管內皮抑制素優選為Endostar。
[0016]本發明還提供了重組人血管內皮抑制素顯像劑應用于觀測腫瘤新生血管狀況的活體顯像中，其中正電子放射性核素標記的顯像劑應用于PET或PET/CT顯像，釓標記的顯像劑應用于MR顯像。所述腫瘤包括:肺癌、腦膠質瘤、子宮內膜異位癥、血管生成性眼底病變、神經內分泌瘤、結腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、鼻咽癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤。 [0017]本發明所述靶向顯像劑經靜脈進入正常小鼠體內后，很快從血液向各臟器分布，主要分布于腎臟，并通過腎臟進行代謝。
[0018]本發明所述靶向顯像劑經靜脈進入荷瘤裸鼠體內后，除上述正常小鼠生理分布外，腫瘤對靶向顯像劑也有明顯攝取。
[0019]本發明的優點和積極效果在于，首次提出并證明，可以應用18F等正電子放射性核素標記重組人血管內皮抑素作為靶向分子顯像劑，用于PET或PET/CT進行分子成像；可以應用Gd標記重組人血管內皮抑素作為靶向分子顯像劑，用于MR分子成像，在活體無創性、動態觀測腫瘤新生血管狀況，有望用于腫瘤抗血管生成治療的療效評價及療效預測。
[0020]此外，將重組人血管內皮抑素通過雙功能螯合劑用正電子放射性核素或釓進行標記，形成靶向顯像劑，在不同PH值標記條件下所獲得的靶向顯像劑，生物學活性與重組人血管內皮抑素原液無明顯差異。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]圖1 18F-SFB 標記 Endostar 路線圖。
[0022]圖2R-TLC分析圖譜。
[0023]圖3不同pH條件下祀向顯像劑與Endostar原藥活性比較。(Pl峰為19F-FB-Endostar) ο
[0024]圖4 18F-FB-Endostar正常小鼠體內時間一生物分布曲線。
[0025]圖5 常小鼠 18F-FB-Endostar 小動物 PET/CT 顯像。
[0026]圖6荷人肺腺癌A549細胞裸鼠18F-FB-Endostar顯像典型圖片(圖中“十”所示為腫瘤部位)。
[0027]圖7荷人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞裸鼠18F-FB-Endostar顯像典型圖片(圖中“十”所示為腫瘤部位)。
[0028]圖8荷人肺腺癌A549細胞裸鼠抑制實驗結果。
[0029]圖9荷人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞裸鼠抑制實驗結果。【具體實施方式】
[0030]具體實施案例是進一步說明本發明但是不構成對本發明保護范圍的限制。
[0031]材料:重組人血管內皮抑制素注射液一恩度(Endostar)由山東先聲麥得津生物制藥有限公司提供，15mg/支。18F離子為RDSlll加速器(美國CTI公司)生產。其他所有材料均為市售可得。
[0032]實施例1: 18F-FB-Endostar標記合成實驗
[0033]合成步驟如下:[0034]1.加速器合成的800mCi18F離子和20mg K2.2.2、5mg K2CO3與5mg 4-三甲基胺苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸鹽在120°C加熱下反應20min，然后先加入1ml0.5mmol/LNa0H溶液水解，再加入15ml 0.1mmoI/LHCL溶液，生成4-[18F]氟苯甲酸(18F-FBA)；
[0035]2.前述18F-FBA與17mg TSTU (2_琥珀酰亞胺基_1，I, 3，3-四甲基脲四氟硼酸酯)加熱15min,再加入由3ml 5%的乙酸和IOmlH2O混合而得的乙酸溶液酸化,經過C-18柱純化后得到18F-SFB (18F-N-琥珀酰亞胺-4-氟苯甲酸酯)。
[0036]3.將上述反應得到的18F-SFB用乙腈洗脫,用氮氣吹干,再將Img Endostar溶于
0.5ml磷酸鹽緩沖液(PH8.2)加入反應管，37°C反應30min。將最終反應產物用中性磷酸鹽緩沖液(PH7.0)做流動相，經過P-1O凝膠柱(GE公司)分離，獲得產物18F-FB-Endostar。
[0037]實施例2.標記物在人血清中的穩定性
[0038]將獲得的500 μ Ci18F-FB-Endostar與Iml正常人血清混合后置于37°C，分別于lh、2h取樣進行R-TLC分析(放射性層析分析)，觀測標記物在人血清中的穩定性。
[0039]結果見圖2分析，在與正常人血清混合I小時和2小時時，標記物放射峰位置未發生變化，也未出現其他放射性雜峰出現。說明標記物在血清中具有良好的穩定性，在37°C血清中2小時仍未出現明顯的降解。
[0040]實施例3.不同PH值進行19F-SFB標記Endostar實驗及標記后Endostar活性檢測
[0041]為了驗證Endostar標記后是否仍具有活性，我們進行了不同PH值條件下進行19F-SFB標記Endostar實驗及標記后Endostar活性檢測。為了避免在檢測活性時發生放射性污染，應用無放射性的19F代替18F進行標記，而19F與18F具有完全相同的化學性質。19F-SFB由常熟華益化工有限公司合成。
[0042]分別在PH值6.5，7.0和8.0條件下，進行19F-SFB與Endostar的標記，19F-SFB與Endostar的摩爾比為20:1，反應溫度為37°C，反應時間為30min。反應完畢后應用脫鹽柱對反應產物進行洗脫分離，洗脫分離時獲得2個峰。第I個峰(pi)為目標產物19F-FB-Endostar，第2個峰(p2)為排除項蛋白，因為峰2蛋白中標記強度較高，導致表位損失，故舍棄。將分離后的目標產物19F-FB-Endostar應用ELISA法檢測與Endostar抗體的結合能力，同時與Endostar原藥進行對比。結果見圖3。從圖3中結果可以看出，19F-FB-Endostar與Endostar原藥的具有相同的Endostar抗體結合能力，而峰2不能與Endostar抗體結合。結果說明目標產物19F-FB-Endostar與Endostar原藥具有相同的活性。
[0043]實施例4 =18F-FB-Endostar正常小鼠體內分布實驗[0044]取正常昆明小白鼠20只，隨機分為5組，每組4只，自尾靜脈注射純化的80Ci18F-FB-Endostar,于注射后15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘分別斷頭處死解剖，測量心、肝、脾、腎、肺、腦、血液、肌肉等組織器官每克組織的百分注射劑量，并繪制時間-生物分布曲線。觀測18F-FB-Endostar在小鼠的正常生物分布數據。
[0045]18F-FB-Endostar在小鼠的正常生物分布如圖4所示。18F-FB-Endostar經靜脈注射進入小鼠體內后，迅速向各器官分布，主要分布于腎臟，在腦中攝取最低，考慮與血腦屏障有關，在肺中攝取也較低。基于這些數據，考慮該顯像劑將來應用于腦及肺部腫瘤可能會獲得更清晰的圖像。
[0046]取同批次正常昆明小白鼠I只，經尾靜脈注射ImCi18F-FB-End0Starl小時后，腹腔注射100mg/kg氯胺酮麻醉，小鼠俯臥位，四肢伸展，保溫固定，進行小動物PET/CT顯像(美國GE Explore VISTA Micro PET / CT)，共兩個床位，每個床位采集約lOmin。正常小鼠18F-FB-Endostar 顯像圖見圖 5.[0047]實施例5:荷瘤裸鼠顯像實驗
[0048]按常規培養腫瘤細胞(肺腺癌A-549細胞，人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞)，細胞購自美國細胞收藏中心(American Type Culture Collection, ATCC),由山東省腫瘤醫院中心實驗室培養和保藏。BALB/c裸小鼠10只，雌性，鼠齡5~6周，體重15~20g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。取對數生長期上述腫瘤細胞，分別調整細胞濃度為IXlO6個/mL。每只裸鼠用Iml的注射器抽取細胞懸液100 μ 1，接種于裸鼠右前肢背部皮下。每種細胞各接種5只裸鼠。裸鼠腫瘤接種后，連續置恒溫(25° C±2° C)、恒濕(45%~50%)、無菌凈化屏障系統內飼養，定期觀察裸鼠精神、飲食和排便，以及腫瘤的生長。待腫瘤直徑長至Icm以上時開始顯像實驗。每只荷瘤裸鼠經尾靜脈注射顯像劑lmCi，注射后I小時進行小動物PET/CT顯像(顯像條件同正常小鼠顯像條件)。
[0049]典型的荷瘤裸鼠18F-FB-Endostar顯像圖像見圖6和圖7。圖6為荷人肺腺癌A549細胞裸鼠18F-FB-Endostar顯像典型圖片。圖7為荷人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞裸鼠18F-FB-Endostar顯像典型圖片。從圖中可以看出，腫瘤對18F-FB-Endostar有明顯的攝取。同時，富血管生成的人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞移植瘤攝取明顯高于肺腺癌A-549細胞移植瘤。肺腺癌A-549細胞移植瘤`中央有較明顯壞死，顯像劑主要分布于腫瘤周邊。以上結果說明，18F-FB-Endostar顯像劑可以進行腫瘤血管顯像。
[0050]實施例6:荷瘤裸鼠“競爭抑制”顯像實驗
[0051]取前述荷瘤裸鼠2只，肺腺癌A-549細胞和人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞移植瘤各I只。每只裸鼠進行兩次顯像，第I天顯像條件同實施例4。第2天，在注射18F-FB-Endostar顯像劑之前I小時，每只裸鼠通過尾靜脈注射Img Endostar原藥,注射顯像劑后顯像時間及條件與第I天顯像完全相同。
[0052]圖8為荷人肺腺癌A549細胞裸鼠抑制實驗結果。圖9為荷人腦惡性膠質瘤U87-MG細胞裸鼠抑制實驗結果。從圖8和圖9結果可以看出，注射Endostar原藥后，18F-FB-Endostar顯像劑在荷瘤裸鼠腫瘤的攝取明顯受到了抑制。說明18F-FB-Endostar顯像劑與Endostar原藥在體內具有相同的祀點，可以如實的反映Endostar原藥在荷瘤裸鼠體內的分布。
【權利要求】
1.一種重組人血管內皮抑制素顯像劑，其特征在于，所述顯像劑具有下式的通式結構: R-雙功能螯合劑-X， 其中R為正電子放射性核素或禮，X為重組人血管內皮抑制素。
2.根據權利要求1所述顯像劑，其特征在于，所述R選自:18F、55C0、6°Cu、61Cu、62Cu、64Cu、66Ga、68Ga、82Rb 和 86Y。
3.根據權利要求1所述顯像劑，其特征在于，所述R也可為:釓(Gd)。
4.根據權利要求1所述顯像劑，其特征在于，所述R-雙功能螯合劑選自:[18F]SFB、[18F] SFBS, [18F] SFMB, [18F] FPA、[18F] FPPD, [18F] FBEM, [18F]FBB0、[18F] NPFP0
5.根據權利要求1所述顯像劑，其特征在于，所述R-雙功能螯合劑也可選自R-DOTA-NHS、R-NOTA-NHS，其中所述 R-D0TA-NHS 選自:[55Co]D0TA_NHS、[60Cu] DOTA-NHS,[61Cu] DOTA-NHS、[62Cu] DOTA-NHS、[64Cu] DOTA-NHS, [66GajDOTA-NHS, [68GajDOTA-NHS, [86Y]DOTA-NHS, [Gd] DOTA-NHS ;所述 R-N0TA-NHS 選自:[Al18F] NOTA-NHS、[66GajNOTA-NHS, [68Ga]NOTA-NHS、 [Gd]NOTA-NHS。
6.一種如權利要求4所述顯像劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 將R-雙功能螯合劑用乙腈洗脫，用氮氣吹干，再與重組人血管內皮抑制素緩沖溶液反應，反應完畢后對反應產物進行洗脫分離，獲得目標產物。
7.—種如權利要求5所述`顯像劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 先將雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素緩沖溶液反應，制備雙功能螯合劑-重組人血管內皮抑制素，再應用R與雙功能螯合劑-重組人血管內皮抑制素結合，反應完畢后對反應產物進行洗脫分離，獲得目標產物。
8.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素的摩爾比為10-40:1。
9.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素的摩爾比為20:1。
10.根據權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素結合的反應溫度為3(T45°C，反應時間為10mirT60min。
11.根據權利要求11所述的制備方法，其特征在于，雙功能螯合劑與重組人血管內皮抑制素結合的反應溫度為37°C，反應時間為30min。
12.權利要求1所述的重組人血管內皮抑制素顯像劑應用于觀測腫瘤新生血管狀況的活體顯像中，其中正電子放射性核素標記的顯像劑應用于PET或PET/CT顯像，釓標記的顯像劑應用于MR顯像；所述腫瘤包括:肺癌、腦膠質瘤、子宮內膜異位癥、血管生成性眼底病變、神經內分泌瘤、結腸癌、骨癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、口腔癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、鼻咽癌、肉瘤、腎癌、膽癌、惡性黑色素腫瘤。
13.根據權利要求1所述顯像劑、權利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，所述重組人血管內皮抑制素為Endostar。
【文檔編號】A61K49/14GK103861129SQ201210532923
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月11日 優先權日:2012年12月11日
【發明者】于金明, 胡旭東, 邢力剛, 岳德勝, 張弢, 林歡 申請人:山東省腫瘤防治研究院, 江蘇先聲藥物研究有限公司, 江蘇先聲藥業有限公司