仿生三維立體組織工程支架及其制備方法

專利名稱：仿生三維立體組織工程支架及其制備方法
技術領域：
本發明涉及生物材料，特別涉及對組織具有長期誘導再生作用的仿生三維立體組織工程支架及其制備方法。
背景技術：
對于復雜、大面積創傷的修復不僅僅需要依靠支架材料，同時也需要生長因子對細胞分化、組織發育過程中特殊結構的形成進行調節。由于蛋白和基因的不穩定性，傳統蛋白質或基因藥物劑型，例如針劑，并不利于長時間內保持蛋白質與基因的結構以及活性。同時，生長因子在有水及酶環境下很容易失去生物學活性。所以直接使用生長因子時常會面臨生物學活性保持時間短的困境，達不到所期望的生物學效率。因此，一個成功的組織工程 支架需要在為細胞生長提供空間的同時，與控制釋放系統相結合，以組織工程支架作為生長因子的載體，在組織再生的過程中對生長因子的局部釋放及釋放時間進行控制，達到促進細胞增殖、組織修復的目的。藥物控釋型組織工程支架的制備方法主要分為吸附方式和包裹方式。以吸附方式將藥物攜載于組織工程支架的方法，是將蛋白類或基因類藥物通過化學接枝法或電相互作用的方法固定于已制備好的支架上。這種支架攜載藥物面臨的問題是，在組織修復過程時生物活性大分子直接與組織液相接觸，藥物的擴散速度過快，以及易于被酶類物質降解，不利于對修復過程進行長期調控。以包裹方式制備載藥組織工程支架的方法是指，將藥物直接與構成支架的聚合物混合，再進行支架制備。以包裹方式載藥支架主要包括水凝膠支架、多孔支架、微球支架以及靜電紡纖維支架。這種攜載方式主要面臨的難題是制備過程對蛋白及基因的結構完整性和生物學活性的保持。靜電紡絲技術是目前唯一能夠直接、連續制備納米或微米級聚合物纖維的技術。近年來，這項技術被越來越多的應用于藥物傳遞系統以及組織工程支架的制備，與其它的載藥劑型與組織工程支架制備技術相比，靜電紡纖維主要有以下幾個特點(1)超細纖維具有小尺寸、大比表面積的特點，為細胞生長提供更多的表面，也可以提高藥物的攜載效率；(2)可以將藥物以共混、包裹或吸附的方式攜載于超細纖維上，不同的攜載和釋放機制可以滿足不同藥物和疾病治療的要求；(3)超細纖維較好的模擬了 ECM的結構，雜亂排列和定向排列的纖維可以滿足不同結構組織的要求；(4)纖維膜高孔隙率，利于營養物質和代謝產物的輸送，纖維間較弱的作用力，利于細胞在整個支架中的遷移；(5)通過調節聚合物材料以及電紡參數，易于滿足纖維對基質材料、應用形狀的要求；(6)將生物活性分子控釋纖維應用于組織工程支架中，可以在組織修復中釋放生物學信號，調控組織再生的過程。相比于混紡工藝，同軸電紡及乳液電紡等技術因將藥物包裹在纖維內部，充分保持了藥物活性且避免了藥物突釋的問題。以同軸共紡法制備包裹蛋白質或基因的芯殼纖維時，由于蛋白或基因的水溶液與聚合物溶液分裝在兩個容器中同時紡絲，減少了與有機溶劑的接觸，因此有利于提高穩定性。但是由于蛋白質和基因溶液本身的粘度過低，不具備可紡性，因此通過同軸共紡技術獲得具有完整芯殼結構的載蛋白或基因的芯殼纖維就具有更為苛刻的實驗參數。另外，同軸共軛電紡畢竟是一個動態的過程，受許多因素的影響，例如核殼部位兩種溶液的流速、界面張力、兩種聚合物溶液的粘度等，從而使其無法制備出理想的核殼結構。除此之外，復雜的儀器要求和苛刻的控制參數的選擇同樣使其應用受到限制。而在乳液電紡過程中，蛋白或基因溶液僅需要與纖維載體材料簡單乳化，即可以普通電紡裝置紡制成芯殼結構纖維。細胞色素酶C和NGF等都被使用乳液電紡的方法包裹于聚合物芯殼纖維中，并不會對蛋白質的結構和功能造成明顯的影響。因此，乳液電紡制備藥物負載的核殼結構納米纖維得到尤為廣泛的關注。乳液電紡法是將水溶性的藥物溶液分散于聚合物有機溶液中，制備穩定的油包水微乳液，再使用普通的靜電紡絲設備獲得芯殼纖維的技術。對油包水乳液進行電紡的過程中，油包水液滴在電場作用下拉伸成絲，內外層溶劑的揮發使得液滴從表面向芯層垂直方向濃縮，由于有機溶劑的揮發速度快于內層水相的揮發速度，纖維外層的粘度增加大大快于內層，這種粘度的區別使得纖維具有芯殼的結構，并且被包裹的藥物主要存在于纖維內部而不是表面。纖維的芯殼結構可在整個釋放持續時間內保護藥物的結構和生物活性。Xu等最早使用乳液靜電紡絲的方法將聚氧化乙烯(PEO)與鹽酸阿霉素(Dox)共混包裹于聚乳 酸一聚乙二醇共聚物(PELA)纖維內部，制備了芯殼結構的PEO-Dox/PELA纖維，并研究了Dox在芯殼纖維中的釋放行為以及對腫瘤細胞的毒性作用，研究結果表明芯殼結構纖維在釋放過程中保護了 Dox的生物學活性，對神經膠質瘤細胞具有明顯的殺傷作用。清華大學的齊宏旭等人用此法從水/油和油/水乳液中制得了具有“水珠掛線”結構的復合材料纖維，他們用鈣藻酸鹽微球作為親水性藥物載體，對牛血清白蛋白(BSA)進行載藥。纖維的主體由生物降解性的聚(L-乳酸)(PLLA)構成，親水性蛋白質則進入水珠掛線結構的水珠部分。體外釋放實驗表明，經過這樣處理的纖維，釋藥時問增加，突釋速率也低于裸露的鈣藻酸鹽微球。然而對于乳液電紡來說，為確保電紡乳液的穩定性，藥物負載率往往偏低。

發明內容
本發明的目的之一是提供具有高效負載活性生長因子、良好生物相容性、足夠的力學強度、可生物降解、生長因子可控釋放，具有促進新生組織再生功能的仿生三維立體組織工程支架。本發明的目的之二是提供上述仿生三維立體組織工程支架的制備方法。本發明的目的之三是提供活性生長因子在支架中的高效負載方法，即支架對活性生長因子的吸附與包裹相結合的負載方法。本發明的目的之四是活性生長因子包裹負載方式中涉及的乳液電紡及吸附負載方式中混合電紡技術或大孔海綿的制備技術。為實現上述目的，本發明采用以下技術方案一種仿生三維立體組織工程支架，包括由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的高分子纖維膜，高分子纖維膜上負載有活性生長因子，以生物高分子物質為100重量份計，活性生長因子為0-0.1重量份但不為零；所述高分子纖維膜是由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的納米纖維膜，或由生物高分子物質與親水性生物高分子物質通過靜電紡絲形成的復合納米纖維膜，活性生長因子均勻分布在納米纖維膜內部。一種仿生三維立體組織工程支架，包括由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的高分子纖維膜，在高分子纖維膜上覆蓋有一層大孔海綿層，在高分子纖維膜和大孔海綿層上負載有活性生長因子；所述高分子纖維膜是由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的納米纖維膜，或由生物高分子物質與親水性生物高分子物質通過靜電紡絲形成的復合納米纖維膜；以生物高分子物質為100重量份計，活性生長因子為0-0.1重量份但不為零；所述100重量份生物高分子物質中，用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質為50-100重量份但不為100，用于形成大孔海綿層的生物高分子物質為0-50重量份但不為零。上述仿生三維立體組織工程支架，其中，用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物；用于形成高分子纖維膜的親水性生物高分子物質和用于形成大孔海綿層的生物高分子物質的分子量為5 100萬，選自透明質酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物； 活性生長因子選自表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子bFGF、內皮細胞生長因子VEGF、轉化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子IGF、⑶31抗體、⑶24抗體、層粘連蛋白、趨化因子SDF-1、神經細胞生長因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生長肽0PG、血小板衍生生長因子TOGF、富血小板血漿(PRP)、含多種生長因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，包括以下步驟a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入活性生長因子，得到高分子紡絲液；b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到可作為仿生三維立體組織工程支架的負載有活性生長因子的高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm。一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，包括以下步驟a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入活性生長因子，得到高分子紡絲液；b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ；C、在步驟b所獲得的高分子纖維膜上涂覆一層2%的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架；或者將步驟b所獲得的高分子纖維膜浸泡到第一交聯劑溶液中，于室溫反應6 12小時后，再在纖維膜表面上涂覆一層2%的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架；d、將步驟c所獲得的復合支架浸泡于含有活性生長因子的溶液中，然后取出置于真空干燥機中抽干水分，即得到負載有高濃度活性生長因子的仿生三維立體組織工程支架。一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，包括以下步驟a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入第二交聯劑溶液，得到高分子紡絲液；b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ；C、在步驟b所獲得的高分子纖維膜上涂覆一層2%的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架；d、將步驟c所獲得的復合支架浸泡于含有活性生長因子的溶液中，然后取出置于 真空干燥機中抽干水分，即得到負載有高濃度活性生長因子的仿生三維立體組織工程支架。上述仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其中，用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物；用于形成高分子纖維膜的親水性生物高分子物質和用于形成大孔海綿層的生物高分子物質的分子量為5 100萬，選自透明質酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物；活性生長因子選自表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子bFGF、內皮細胞生長因子VEGF、轉化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子IGF、⑶31抗體、⑶24抗體、層粘連蛋白、趨化因子SDF-1、神經細胞生長因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生長肽0PG、血小板衍生生長因子TOGF、富血小板血漿、含多種生長因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。上述仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其中，所述第一溶劑選自1，2- 二氯甲烷、二甲苯、氟代試劑、氯仿、DMF、THF中的一種或幾種；所述第二溶劑選自水、氟代試劑或水與乙酸、乙醇、DMF、甘油的混合溶劑；所述表面活性劑選自司盤或吐溫。上述仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其中，所述第一交聯劑溶液是由碳二亞胺與丙酮和水的混合溶劑新配制的溶液，溫度為4°C，其中碳二亞胺的濃度為50mM 200mM，丙酮和水的混合溶劑中，丙酮與水的重量比為80 20 ;所述第二交聯劑溶液為新配制的碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液，其中碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾質量比為1: 3。上述仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其中，所述的靜電紡絲的工藝條件為溶液的供料速率為5 50ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為8 20cm ;環境溫度為20 50°C ;靜電壓為10 30kV。本發明基于生長因子對細胞分化、組織發育過程中特殊結構形成的促進作用，將生長因子負載于可降解生物聚合物組織工程支架中，設計構建了具有良好生物相容性、足夠的力學強度、可生物降解、生長因子可控釋放，具有促進新生組織再生功能的仿生三維立體組織工程支架。其中，為克服乳液電紡膜負載因子濃度低的問題，本發明將藥物包裹與吸附兩種負載方式相結合，即在乳液電紡纖維膜的基礎上引入了負載高濃度生長因子的冷凍海綿層或可高濃度負載因子的混合電紡工藝。這種攜載方式不僅為細胞生長提供了適宜生長的空間，而且制備過程保持了所負載活性生長因子的結構完整性和生物學活性。支架中，纖維內部及吸附于海綿層或分布于水溶性電紡納米纖維表面生長因子不同的緩釋機制，可協調組織再生過程中的不同需求，滿足了對修復過程進行的長期調控。在組織再生的過程中，對生長因子的局部釋放及釋放時間進行控制，可促進細胞增殖、組織修復的目的。本發明克服了乳液電紡纖維膜負載活性分子濃度低的問題，將乳液電紡纖維膜與大孔海綿或混合電紡工藝相結合，極大地提高了活性因子的負載率；解決了混合電紡工藝及支架吸附活性因子初期存在的大量突釋導致的后期無法供應的問題，部分因子通過乳液電紡的核殼結構，保留在纖維內部，實現了對釋放時間的有效控制，及修復過程進行的長期調控。大孔海綿層的引入在一定程度上為新生組織的再生提供了更好的生長空間及表面接觸環境。而纖維支架的存在又充分保證了支架的力學支撐。活性分子在支架中的引入，為新生細胞增殖、定向分化、細胞遷移粘附、捕獲干細胞從而誘導新生組織的再生功能起到了引導、促進作用。本發明給予通過支架材料自身性能的功能性實現受損組織的再生與重建，為再生醫學產業的發展提供新思路和新途徑。


圖1是本發明實施例1新乳液電紡含活性生長因子納米纖維SEM ；圖2是本發明實施例1中乳液電紡含活性生長因子納米纖維的熒光圖像；圖3是本發明實施例3的復合支架表面大孔海綿形貌圖；圖4是本發明實施例2的支架中細胞密度圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。實施例1(I)將O. 40克聚己內酯(PCL，分子量6萬)溶解在3. 5ml的1，2_ 二氯甲烷和O. 5ml的二甲苯中，并用移液槍滴入20微升的司盤。在磁力攪拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的富含活性生長因子的PRP(含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將明膠(GE，分子量10萬)與成纖維細胞生長因子bFGFb、內皮細胞生長因子VEGF溶解在三氟代乙醇中，配制成總濃度為12w/V%的混合溶液，其中活性生長因子的占固體份的O. 05%。(2)選用單噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的含有PRP的PCL電紡乳液與明膠和活性因子的混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為20ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為25cm ;環境溫度為25°C ;靜電壓為24kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纖維膜材料。纖維直徑為400-1000nm(見圖1和圖2)；(3)待消毒滅菌后，將步驟(2)制備的高分子纖維膜材料置于新西蘭大白兔皮膚缺損處，以不做處理的皮膚缺損做對照。結果隨時間增加，白色纖維膜移植物逐漸降解，創面及移植物新鮮濕潤，用纖維膜治療組創面愈合時間比對照組短，兩組新西蘭大白兔傷口愈合時間分別為16天和20天，3w左右移植物完全形成新生皮膚；冰凍切片HE染色結果顯示形成的新生皮膚結構和正常皮膚基本相同，形成了正常的表皮層、皮下組織層及真皮層，并可見有皮膚附屬器——毛發、皮脂腺、汗腺等形成。實施例2(I)將O. 40克聚乙丙交酯(PLGA，分子量10萬)溶解在8mL的三氯甲烷中，并用移液槍滴入50微升的司盤80。在磁力攪拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP (含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將明膠(GE，分子量10萬)、透明質酸(HA，分子量50萬)與成纖維細胞生長 因子bFGFb、內皮細胞生長因子VEGF溶解在DMF和水體積比為1:1的混合溶劑中，其中固定透明質酸濃度為1% ;透明質酸與明膠的質量比為100 20;活性分子所占固體份的O. 08%。(2)選用單噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的含有PRP的PLGA電紡乳液與明膠/透明質酸/活性因子的混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為20ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ;環境溫度為25V ;靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纖維膜材料。纖維平均直徑為100-1000nm。將成纖維細胞種到纖維膜材料上，細胞能粘附并增殖(見圖4)。(3)待消毒滅菌后，將步驟(2)制備的高分子纖維膜材料縫合于新西蘭大白兔膀胱缺損處，以不含生物活性因子的纖維膜做對照，分別于術后2周、4周、8周行X線膀胱造影后處死動物，行一般情況、缺損區大體觀察、組織學染色分析及免疫組織化學染色檢測膀胱缺損修復情況。結果移植了含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纖維膜材料的膀胱修復效果最好，組織學分析結果顯示新生的膀胱組織結構層次與原膀胱一致。實施例3(I)將聚乙丙交酯(PLGA，分子量8萬)溶解在SmL的三氯甲烷中，并用移液槍滴入50微升的司盤80。在磁力攪拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP (含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將明膠(GE，分子量10萬)溶解在水與乙醇體積比為9 I的混合溶劑中，配制成總濃度為15W/v%的混合溶液。(2)選用雙噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的PLGA溶液與含有活性分子的GE混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為15ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ;環境溫度為25°C ；PLGA電紡靜電壓為18kV，GE電紡靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纖維膜材料。其中PLGA平均纖維直徑在680nm，GE平均纖維直徑約360nm。(3)將⑵所獲得的纖維膜浸泡到新配置的、在4°C冰箱中儲存2h以上的、含50mM 200mM的碳二亞胺的80/20的丙酮和水的混合溶液中，于4°C冰箱中交聯反應12h后，用大量的去離子水浸泡沖洗。(4)將2%的明膠粘稠水溶液鋪展到(2)所獲得的纖維膜表面，然后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，在纖維膜表面得到一層大孔海綿。隨后置于浸泡到含lOOmM/lOOmM的碳二亞胺與N-羥基馬來酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對水溶性組分進行交聯，于室溫反應8小時后,用大量的去離子水浸泡沖洗。(5)將(3)所得的雙層支架浸泡到含有2%濃度的PRP水溶液中，待取出后置于真空干燥機中抽干水分，即得最終負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架。(見圖3)(6)將步驟(5)制備的負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架植入于新西蘭大白兔軟骨缺損處，術后4、8、12周分批處死動物，行一般情況、缺損區大體觀察、X線、micix)-CT、組織學染色分析及免疫組織化學染色檢測軟骨缺損修復情況，以不處理或未負載生長因子的支架材料做對照，比較各組修復軟骨缺損的效果。結果顯示負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架組的軟骨缺損能完全愈合，能明顯促進軟骨缺損的修復。實施例4(I)將聚己內酯(PCL，分子量8萬)溶解在3.5ml的1，2_ 二氯甲烷和O. 5ml的二甲苯中，并用移液槍滴入20微升的司盤。在磁力攪拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將明膠(GE，分子量10萬)溶解在水與乙醇體積比為9 I的混合溶劑中，配制成總濃度為15W/v%的 混合溶液。(2)選用雙噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的PCL溶液與含有活性分子的GE混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為15ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ;環境溫度為25°C ；PCL電紡靜電壓為24kV，GE電紡靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收的高分子纖維膜材料。(3)將2%的明膠粘稠水溶液鋪展到(2)所獲得的纖維膜表面，然后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，在纖維膜表面得到一層大孔海綿。隨后置于浸泡到含lOOmM/lOOmM的碳二亞胺與N-羥基馬來酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對水溶性組分進行交聯，于室溫反應8小時后,用大量的去離子水浸泡沖洗。(4)將(3)所得的雙層支架浸泡到含有2%濃度的成纖維細胞生長因子(bFGF)及骨形成蛋白-2(BMP-2)的水溶液中，待取出后置于真空干燥機中抽干水分，即得最終負載高濃度活性生長因子的雙層生物支架。(5)將步驟(4)制備的雙層生物支架置于大鼠顱骨缺損處，以不處理或未負載生長因子的支架材料做對照，術后4、8、12周分批處死動物，行一般情況、缺損區大體觀察、X線、micro-CT、組織學染色分析及免疫組織化學染色檢測軟骨缺損修復情況，比較各組修復顱骨缺損的效果。結果顯示負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架組的顱骨缺損修復效果最好，表明該生物支架能誘導骨再生促進骨缺損的修復。實施例5(I)將聚乙丙交酯(PLGA，分子量8萬)溶解在SmL的三氯甲烷中，并用移液槍滴入50微升的司盤。在磁力攪拌下使PLGA完全溶解后，滴入250微升的PRP(含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將明膠(GE，分子量10萬)溶解在水與乙醇體積比為9 I的混合溶劑中，配制成總濃度為15W/v%的明膠溶液，隨后將摩爾質量比為1: 4的EDC與NHS快速溶解在該溶液中。(2)選用雙噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的PLGA溶液與含有活性分子的GE混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為15ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ;環境溫度為25°C ；PLGA電紡靜電壓為18kV，GE電紡靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纖維膜材料。
(3)將2%的明膠粘稠水溶液鋪展到(2)所獲得的纖維膜表面，然后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，在纖維膜表面得到一層大孔海綿。隨后置于浸泡到含lOOmM/lOOmM的碳二亞胺與N-羥基馬來酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對水溶性組分進行交聯，于室溫反應8小時后,用大量的去離子水浸泡沖洗。(4)將(3)所得的雙層支架浸泡到含有2%濃度的PRP水溶液中，待取出后置于真空干燥機中抽干水分，即得最終負載高濃度活性生長因子的雙層生物支架。(5)將步驟(4)制備的雙層生物支架植入到皮質缺損的大鼠腦缺損處，以植入不含生物活性因子的生物支架為對照，分別于術后2周、4周處死動物，進行腦組織切片，HE染色，免疫熒光染色，比較各組生物支架上神經細胞生長、遷移及分化情況。結果顯示負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架組神經細胞和血管內皮細胞長入最多，且大量表達神經干細胞標志物，表明該生物支架具有誘導干細胞遷移、增殖及分化等作用，可有效用于修復中樞神經系統損傷。 實施例6(I)將聚己內酯(PCL，分子量8萬)溶解在3.5ml的1，2_ 二氯甲烷和O. 5ml的二甲苯中，并用移液槍滴入20微升的司盤。在磁力攪拌下使PCL完全溶解后，滴入250微升的富含生物活性因子的PRP(含有5%的dextran作為保護劑)。在磁力攪拌下攪拌45分鐘。同時將海藻酸鈉與明膠按質量比10 90為(GE，分子量10萬)溶解在水中，明膠濃度固定為10%的混合溶液。(2)選用雙噴頭紡絲裝置，將步驟(I)的PCL溶液與含有活性分子的GE混合溶液分別裝入兩個不同的輸液通路中，調整溶液的供料速率為15ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為12cm ;環境溫度為25°C ；PCL電紡靜電壓為24kV，GE電紡靜電壓為22kV，在收集器上得到含活性分子的可生物降解及可生物吸收高分子纖維膜材料。(3)將⑵所獲得的纖維膜浸泡到新配置的10% CaCl2的乙醇和水體積比為80 20的混合溶液中，待反應12h后，用大量的去離子水浸泡沖洗。(3)將2%的明膠粘稠水溶液鋪展到(2)所獲得的纖維膜表面，然后置于冷凍干燥機中冷凍干燥，在纖維膜表面得到一層大孔海綿。隨后置于浸泡到含lOOmM/lOOmM的碳二亞胺與N-羥基馬來酸的80/20的乙醇和水的混合溶液中，對水溶性組分進行交聯，于室溫反應8小時后,用大量的去離子水浸泡沖洗。(4)將(3)所得的雙層支架浸泡到含有2%濃度的內皮細胞生長因子(VEGF)及成纖維細胞生長因(bFGF)的水溶液中，待取出后置于真空干燥機中抽干水分，即得最終負載高濃度活性生長因子的雙層生物支架。(5)將步驟(4)制備的負載高濃度活性生長因子的雙層生物支架植入到新西蘭大白兔尿道缺損處，以植入不含生物活性因子的生物支架為對照，分別于術后2周、4周及8周行尿路造影等檢查后處死動物，行一般情況、缺損區大體觀察、組織學染色分析及免疫組織化學染色檢測尿道缺損修復情況，比較各組修復缺損的效果。結果顯示負載高濃度活性生長因子的表面大孔海綿結構的生物支架組的尿道缺損修復效果最好，新生的尿道組織與正常尿道組織結構一致。表明該生物支架能誘導尿道上皮細胞再生，促進尿道缺損的修復。
權利要求
1.一種仿生三維立體組織工程支架，其特征在于包括由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的高分子纖維膜，高分子纖維膜上負載有活性生長因子，以生物高分子物質為100重量份計，活性生長因子為0-0.1重量份但不為零；所述高分子纖維膜是由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的納米纖維膜，或由生物高分子物質與親水性生物高分子物質通過靜電紡絲形成的復合納米纖維膜，活性生長因子均勻分布在納米纖維膜內部。
2.一種仿生三維立體組織工程支架，其特征在于包括由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的高分子纖維膜，在高分子纖維膜上覆蓋有一層大孔海綿層，在高分子纖維膜和大孔海綿層上負載有活性生長因子；所述高分子纖維膜是由生物高分子物質通過靜電紡絲形成的納米纖維膜，或由生物高分子物質與親水性生物高分子物質通過靜電紡絲形成的復合納米纖維膜；以生物高分子物質為100重量份計，活性生長因子為0-0.1重量份但不為零；所述100重量份生物高分子物質中，用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質為50-100重量份但不為100，用于形成大孔海綿層的生物高分子物質為0-50重量份但不為零。
3.如權利要求1或2所述的仿生三維立體組織工程支架，其特征在于所述的用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物； 所述的用于形成高分子纖維膜的親水性生物高分子物質和用于形成大孔海綿層的生物高分子物質的分子量為5 100萬，選自透明質酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物； 所述的活性生長因子選自表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子bFGF、內皮細胞生長因子VEGF、轉化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子IGF、⑶31抗體、⑶24抗體、層粘連蛋白、趨化因子S D F-1、神經細胞生長因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生長肽OPG、血小板衍生生長因子TOGF、富血小板血漿(PRP)、含多種生長因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。
4.一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入活性生長因子，得到高分子紡絲液； b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到可作為仿生三維立體組織工程支架的負載有活性生長因子的高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm。
5.一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入活性生長因子，得到高分子紡絲液； b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ； C、在步驟b所獲得的高分子纖維膜上涂覆一層2%的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架；或者將步驟b所獲得的高分子纖維膜浸泡到第一交聯劑溶液中，于室溫反應6 12小時后，再在纖維膜表面上涂覆一層2 %的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架； d、將步驟c所獲得的復合支架浸泡于含有活性生長因子的溶液中，然后取出置于真空干燥機中抽干水分，即得到負載有高濃度活性生長因子的仿生三維立體組織工程支架。
6.一種仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 a、將生物高分子物質溶解在第一溶劑中，然后加入表面活性劑和活性生長因子，得到高分子紡絲液；或將生物高分子物質和親水性生物高分子物質的混合物溶解在第二溶劑中，然后加入第二交聯劑溶液，得到高分子紡絲液； b、選用多噴頭或單噴頭紡絲裝置，將步驟a所得高分子紡絲液裝入靜電紡絲設備的儲液裝置中進行靜電紡絲，得到高分子纖維膜，纖維直徑為50nm 5000nm ； C、在步驟b所獲得的高分子纖維膜上涂覆一層2%的明膠粘稠水溶液，然后將纖維膜冷凍干燥，然后置于第一交聯劑溶液中進行交聯反應過夜，用大量的去離子水浸泡沖洗，得到高分子纖維膜上覆蓋大孔海綿層的復合支架； d、將步驟c所獲得的復合支架浸泡于含有活性生長因子的溶液中，然后取出置于真空干燥機中抽干水分，即得到負載有高濃度活性生長因子的仿生三維立體組織工程支架。
7.如權利要求4或5或6所述的仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，用于形成高分子纖維膜的生物高分子物質的分子量為5 20萬，選自乳酸-羥基乙酸的共聚物PLGA、聚乳酸、聚己內酯或聚乙交酯中的一種或幾種的混合物； 用于形成高分子纖維膜的親水性生物高分子物質和用于形成大孔海綿層的生物高分子物質的分子量為5 100萬，選自透明質酸、絲蛋白、硫酸軟骨素、肝素、膠原蛋白、明膠、殼聚糖、核酸、血清纖維結合蛋白或多肽中的一種或幾種的混合物； 所述活性生長因子選自表皮生長因子EGF、成纖維細胞生長因子bFGF、內皮細胞生長因子VEGF、轉化生長因子TGF-β、胰島素樣生長因子IGF、CD31抗體、CD24抗體、層粘連蛋白、趨化因子SDF-1、神經細胞生長因子NGF、骨形成蛋白BMP-2、成骨生長肽OPG、血小板衍生生長因子PDGF、富血小板血漿(PRP)、含多種生長因子的富血小板血漿中的一種或幾種的混合物。
8.如權利要求4或5或6所述的仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述第一溶劑選自1，2_ 二氯甲烷、二甲苯、氟代試劑、氯仿、DMF、THF中的一種或幾種；所述第二溶劑選自水、氟代試劑或水與乙酸、乙醇、DMF、甘油的混合溶劑；所述表面活性劑選自司盤或吐溫。
9.如權利要求5或6所述的仿生三維立體組織工程支架的制備方法，其特征在于，所述第一交聯劑溶液是由碳二亞胺與丙酮和水的混合溶劑新配制的溶液，溫度為4°C，其中碳二亞胺的濃度為50mM 200mM，丙酮和水的混合溶劑中，丙酮與水的重量比為80 20 ;所述第二交聯劑溶液為新配制的碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的混合溶液，其中碳二亞胺與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾質量比為1: 3。
10.如權利要求4或5或6所述的仿生三維立體組織工程支架，其特征在于所述的靜電紡絲的工藝條件為溶液的供料速率為5 50ul/min，噴絲頭與接地的收集器之間的距離為8 20cm ;環境溫度為20 50°C ;靜電壓為10 30kV。
全文摘要
仿生三維立體組織工程支架，由高分子纖維膜負載活性生長因子構成，或由高分子纖維膜與大孔海綿層組成的復合支架上負載活性生長因子構成。本發明克服了乳液電紡纖維膜負載活性分子濃度低的問題，將乳液電紡纖維膜與大孔海綿或混合電紡工藝相結合，極大地提高了活性因子的負載率；部分因子通過乳液電紡的核殼結構，保留在纖維內部，實現了對釋放時間的有效控制，及修復過程進行的長期調控。活性分子在支架中的引入，為新生細胞增殖、定向分化、細胞遷移粘附、捕獲干細胞從而誘導新生組織的再生功能起到了引導、促進作用，為再生醫學產業的發展提供了新途徑。
文檔編號A61L27/26GK103006359SQ201210566089
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月24日 優先權日2012年12月24日
發明者聶華榮, 汪泱, 郭菲, 易應萍, 鄧志鋒 申請人:汪泱