專利名稱：脂聯素在制備治療老年缺血性腦卒中藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥制備領域，特別涉及脂聯素在制備治療老年缺血性腦卒中藥物中的應用。
背景技術：
缺血性腦卒中是嚴重威脅人類健康的常見病、多發病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高的特點。目前缺血性腦卒中已成為西方發達國家僅次于癌癥和心血管疾病的第三大主要死因，占全球死因10%;而我國第三次國民死因調查結果顯示，腦卒中已上升成為我國第一位死因。每年新發腦卒中約200萬人，死于腦卒中約有150萬，75%存活者伴有不同程度的殘疾。卒中致殘和致死的危害給社會和家庭造成沉重的經濟和心理負擔。盡管腦卒中可發生于各個年齡段，但隨著年齡增加腦卒中發病率顯著升高。老齡是缺血性腦卒中最重要的危險因素。研究發現，55歲以后，腦卒中發病率以指數方式成倍增長；75-89%腦卒中患者發病在65歲以上，50%患者發生在70歲以上，約25%發生在85歲以上。隨著當今社會人口結構老齡化進程的加快，老年缺血性腦卒中發病率將進一步升高，腦卒中已成為老年人致死的重要病因。脂聯素是脂肪組織分泌的一種特異性細胞因子，具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化的特點。脂聯素在血循環中濃度較高，通過與脂聯素受體(adiponectinreceptor)結合發揮生物學作用，脂聯素受體存在兩種即AdipoRl、AdipoR2。由于其具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化、抗炎、抑制腫瘤生長等特性，成為國內外學者研究的熱點。衰老可直接影響脂肪因子的分泌，造成脂聯素分泌異常。中年以后，脂肪重新分布導致的腹型肥胖可致多種脂 肪因子分泌紊亂，脂聯素表達下調，瘦素、IL-6、TNF-α及抵抗素等過度生成，造成系統性炎癥反應及胰島素抵抗。老年時期，脂肪代謝障礙和脂肪萎縮引起脂肪因子分泌異常，引發或促進胰島素抵抗。動物學實驗證實，快速老化小鼠(SAPPjn^)的脂聯素水平明顯低于對照 組小鼠。臨床上對老年人脂聯素水平的觀察結果并不一致，目前尚未證實脂聯素與年齡有顯著相關性。脂聯素水平與腦卒中嚴重程度呈負相關，與腦卒中死亡率及致殘率密切相關，老年缺血性腦卒中比年輕患者愈后更差，而卒中后腦內脂聯素的表達高低是否與愈后相關，目前這方面的研究仍是空白。現有的文獻也沒有記載脂聯素在治療老年缺血性腦卒中的應用。
發明內容
本發明的目的是提供脂聯素在治療老年缺血性腦卒中藥物中的新用途，為臨床上更合理的將脂聯素(以下簡稱APN)用于老年缺血性腦卒中的治療及治療的時間靶點提供合理實驗數據和科學依據。本發明涉及脂聯素在制備治療老年缺血性腦卒中藥物中的應用。本實驗采用缺血/再灌注小鼠模型，通過AAV載體基因治療，將脂聯素分別轉染至老年小鼠、成年小鼠腦內，使脂聯素在小鼠腦內局部聞表達。tMCAO造I旲,觀察脂聯素對老年小鼠及成年小鼠腦后缺血后腦萎縮程度、血管新生、神經變化等的影響；比較老年小鼠、成年小鼠腦缺血的神經功能學改變，而后進一步觀察老年小鼠、成年小鼠腦缺血后脂聯素的表達時程、表達部位，從而可評估脂聯素與老年缺血性腦損傷中的關系，得出脂聯素在老年小鼠腦缺血性腦卒中的治療效果，為臨床上合理使用脂聯素提供實驗數據。本發明具有以下優點1、脂聯素對老年小鼠腦缺血后腦萎縮的改善效果比成年小鼠更顯著，具有抗缺血的腦保護作用；2、脂聯素對老年小鼠神經學功能的恢復效果明顯；
3、脂聯素可促進老年、成年小鼠腦缺血區域血管生成，而且脂聯素治療的老年小鼠缺血后血管生成比成年小鼠治療后更多；4、脂聯素對促進老年組小鼠腦內動脈增生效果顯著；5、脂聯素對老年小鼠、成年小鼠腦缺血后均有促進神經發生的作用，且對老年小鼠腦缺血后神經發生促進作用較成年小鼠更顯著，神經發生的促發作用對脂聯素改善腦缺血神經功能亦非常關鍵。
圖1是AAV-GFP轉染后GFP在老年組、成年組小鼠大腦中的表達圖。圖2是AAV-APN轉染后APN在老年組、成年組小鼠大腦中的表達圖。圖3是AAV-APN定位注射后APN蛋白在老年組、成年組小鼠大腦中的表達圖。圖4是轉染AAV-APN后APN在缺血腦組織中的表達圖。圖5是過表達APN減輕老年組、成年組小鼠缺血后腦萎縮的測試圖。圖6是老年組、成年組小鼠經APN治療后腦缺血后mNSS評分圖。圖7是老年組、成年組小鼠經APN治療后平衡木行走時間測試圖。圖8是老年組、成年組小鼠經APN治療后轉棒行走時間測試圖。圖9是老年組、成年組小鼠經APN治療后轉角實驗結果圖。圖10是tMCAO手術后2周，老年組、成年組缺血腦組織微血管圖。圖11是tMCAO手術后4周，老年組、成年組缺血腦組織微血管圖。圖12是tMCAO手術后4周，老年組、成年組缺血腦組織動脈密度圖。圖13是tMCAO手術后2周，老年組、成年組SVZ區神經變化圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發明作進一步說明實驗用的小鼠模型本次實驗中，采用清潔級雄性CD-1成年小鼠30只，年齡10-12周，體重25-30g，清潔級雄性CD-1老年小鼠30只，年齡20-24月，體重45_50g，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，以上小鼠在人工控制的晝夜節律光環境中飼養，小鼠的飲水與飲食不受任何限制。實驗用的基因載體攜帶脂聯素(以下簡稱APN)治療基因的2型重組腺相關病毒載體rAAV2-APN (以下簡稱A AV-APN)，空白對照載體rAAV2_EGFP (以下簡稱AAV-GFP)，兩種載體均購自本元正陽基因技術有限公司，兩種載體均含有CMV啟動子，病毒滴度均為4.3 X1011 (vector genomes)/mL。1、小鼠大腦立體定位載體注射
將小鼠分成AAV-APN轉基因老年組、AAV-GFP轉基因老年對照組、AAV-APN轉基因成年組、AAV-GFP轉基因老年對照組共四組。應用氯胺酮/賽拉嗪(100/10mg/kg)腹腔注射麻醉上述四組小鼠，麻醉成功后固定于腦立體定向儀上。碘伏消毒小鼠頭部的皮膚，行頭頂部正中手術切口，長約Icm,暴露前囟，于前囟后1_、旁開中線2mm為定位點，電鉆磨開頡骨直到顯露硬膜。將IOul微量注射器固定于立體定向儀，在注射定位點上方垂直進針，以微螺旋定量推進器勻速緩慢注射病毒載體，其中向脂聯素治療組注射病毒載體為rAAV2-APN，注射量為5ul (4X109v. g.)，向空白對照組注射病毒載體為rAAV2-GFP，注射量為5ul (4X109v. g.)，注射速率為O. 2ul/min0注射完畢待15min后緩慢拔針。骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合皮膚。接受AAV-APN、AAV-GFP定位注射的各組動物術后均未出現神經功能缺損體征、皮毛正常，進食無異，體重無減輕，未發生動物死亡。證明腦室內注射rAAV2載體對動物的生理狀況無明顯影響，安全可行。2、定位注射后各組小鼠接受tMCAO手術在大腦立體定位注射載體后7天，四組小鼠行tMCAO術。小鼠稱重，將小鼠面罩扣于口鼻部，連接麻醉氣體，手術顯微鏡下做頸部正中切口，暴露胸骨舌骨肌后，鈍性分離頜下腺，暴露左側胸鎖乳突肌和二腹肌，先后分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，分別依次結扎，在頸外動脈另栓一根絲線，只打虛結不系緊。剪斷頸外動脈遠端，將栓線從頸外動脈處逆行插向頸總動脈的分叉處，將栓線轉至與頸內動脈平行，輕緩地將栓線小心經顱內段頸內動脈插入至感到輕微阻力，此時栓線頭端大致已經通過大腦中動脈開口處到達大腦前動脈處。進線深度約為9± 1mm。監測腦血流量的變化，謹慎調節插入栓線深度使血流值下降到20%以下，表明缺血術成功。結扎固定線栓，分層縫合皮膚線栓。插入栓線I小時后，回抽栓線使其頭端回到頸外動脈內，恢復頸內動脈血流,經多普勒腦血流儀測定血流恢復到缺血前基線水平，表明再灌注成功。3、實驗測試結果如下(I)、老年組、成年組小鼠腦組織內腺相關病毒介導的基因轉染及表達檢測各組小鼠AAV-GFP基因轉染后腦內GFP的表達。結果如圖1所示(其中，CTX 皮質；BG :基底神經節；CC :胼胝體)，AAV-GFP腦內定位注射兩周后，老年組及成年組注射部位、注射部位周圍區和注射部位遠端均有多量GFP信號表達，老年組與成年組間無明顯差異，而對側非注射半球未見GFP表達。檢測各組小鼠AAV-APN轉染后注射側脂聯素在腦內的表達。AAV-APN轉染7天后小鼠腦內注射側有多量APN信號表達，檢測結果如圖2b和圖2d所示(Bar=IOOym,箭頭為脂聯素陽性細胞)，而非注射側無表達，具體見圖2a和圖2c。定量比較老年組、成年組腦內APN表達陽性的細胞數目，未見統計學差異。由此證明，AAV-APN在老年組及成年組小鼠均可實現轉染，轉染效率無明顯差異。通過Western Blot法觀察各組小鼠注射側腦組織的APN蛋白表達。結果如圖3顯示(其中，GFP為AAV-GFP轉染；APN為AAV_APN轉染'Y為成年組;A為老年組)，老年組及成年組AAV-APN基因轉導后注射側APN蛋白表達較GFP對照組顯著增加，7天達到高峰，持續維持三周左右；老年組與成年組 小鼠轉染后腦內APN蛋白表達無明顯差異。采用免疫熒光雙染法，以細胞標記物⑶31、NeuN、GFAP分別標記血管內皮細胞、神經元細胞、星性膠質細胞，以觀察AAV-APN基因轉染后脂聯素在腦組織各類細胞的定位表達。檢測結果如圖4所示，從圖中可看出，脂聯素(見圖4d、圖4e和圖4f)與⑶31 (見圖a)、NeuN (見圖b)有大量共表達，與GFAP (見圖d)也可共表達(其中，Bar=IOO μ m，箭頭處為共表達重疊處)。檢測結果說明AAV-APN基因轉染后使腦內脂聯素表達增加，正常腦組織血管內皮細胞、神經元細胞及星性膠質細胞均有表達，多表達于血管內皮細胞及神經元細胞。(2)、脂聯素減少缺血后腦萎縮分別測量了 APN-老年組、APN-成年組、GFP-老年組、GFP-成年組小鼠在tMCAO后14天時缺血側大腦半球體積，以檢測脂聯素對缺血性腦卒中后腦萎縮程度的影響，比較脂聯素對老年組、成年組缺血后的治療作用，焦油紫染色，具體見圖5所示成年組小鼠tMCAO后14天，GFP-成年組小鼠缺血側大腦有明顯萎縮，而APN-成年組缺血半球萎縮程度較輕；老年組小鼠亦得到類似結果，APN-老年組小鼠缺血側大腦萎縮程度較GFP-老年組明顯減輕。結果說明脂聯素可減少缺血后腦萎縮。(3)、脂聯素改善缺血后小鼠的長期神經功能為了評估脂聯素對老年組、成年組小鼠缺血后神經功能修復作用，于術前、術后I天、7天、14天和28天分別進行了行為學檢測，包括mNSS評分、平衡木行走試驗(Beam walktest)、轉棒行走試驗(Rotor-rod test)以及轉角實驗(Corner test)。mNSS評分結果，具體見圖6所示，APN-成年組小鼠tMCAO術后14天及28天評分均低于GFP-成年組小鼠；APN-老年組小鼠術后7天、14天、28天mNSS分值均顯著低于GFP-老年組小鼠。比較tMCAO術后28天，老年組、成年組經APN治療后mNSS評分改善程度，檢測結果說明APN對老年組改善比成年組更大。平衡木行走試驗結果如圖7所示，APN-成年組小鼠tMCAO術后14天及28天平衡木通過時間少于GFP-成年組小鼠；APN-老年組小鼠術后7天、14天、28天均顯著低于GFP-老年組小鼠。轉棒行走實驗結果見圖8所示，術后28天，APN-成年組小鼠行走持續時間高于GFP-成年組；術后14天及28天，APN-老年組小鼠轉棒行走持續時間較GFP-成年組明顯增加。轉角實驗結果見圖9所示，術后14天及28天時，APN-成年組、APN-老年組小鼠左側轉角比例分別低于對照成年組、對照老年組。( 4 )、 脂聯素刺激缺血腦組織血管新生分別于短暫性腦缺血術后2周及4周，對APN-老年組、GFP-老年組、APN-成年組、GFP-成年組小鼠缺血側腦組織進行血管計數。AAV-APN基因轉導小鼠缺血后2周開始出現血管增粗、管徑擴大，2-4周發展成新生血管。tMCAO術后2周，Lectin染色觀察腦內缺血周邊區血管密度，結果如圖10所示APN-成年組缺血周邊區血管密度較GFP-成年組有明顯升高(196. 0±5. 6vs. 134. 4±4. 7，P<0. 01) ;APN_老年組缺血周邊區與GFP-老年組比較，血管密度也明顯升高(183. 2±6. 3vs. 103. 84±5. 0，P<0. 01) ;tMCA0術后4周，也得到類似的結果，具體見圖11，APN-成年組、APN-老年組分別較對照組血管密度升高(成年組245. 2±3· 6vs. 157. 2±7· 7，Ρ〈0· 01;老年組:237. 5±8· 2vs. 135. 5±4· 7，Ρ〈0· 01)。計算tMCAO術后APN組與GFP對照組腦缺血周邊區血管數差值，比較觀察脂聯素對老年組、成年組小鼠缺血腦組織血管增生的影響，結果提示APN治療后老年組小鼠腦缺血區血管增生較成年組更多(2 周79. 3±7· 5vs. 61. 6±9· 3，Ρ〈0· 01 ；4 周:102. 2±7· 5vs. 88. 1±8，P〈0. 05)。說明，APN治療對于老年組的效果更為顯著。應用alpha-smooth muscle act in染色標記動脈,觀察腦缺血區動脈血管密度,檢測結果如下tMCAO術后4周，a-SMA染色觀察APN-老年組、GFP-老年組、APN-成年組、GFP-成年組缺血腦周邊區動脈血管密度變化，檢測結果具體見圖12所示，APN-成年組、APN-老年組缺血區動脈血管數較對照組亦明顯增高(成年組16. 3±1. 9vs. 6. 0±0. 8，P〈0. 01 ;老年組13. 5 ±1. 3vs. O. 8±0. 7，P〈0. 01)。差值計算發現，APN老年組小鼠腦內動脈增生較成年組更多(12. 7±1· 6vs. 10. 3±1· 2，P=O. 05)。(5)、脂聯素促進缺血腦組織神經發生腦缺血后大量神經細胞變性壞死，導致缺血性腦卒中致殘率高，死亡率高，如何使新生的神經細胞遷移至腦損傷區恢復神經功能是研究的關鍵。Doublecortin (DCX)是神經元前體細胞標記物，PCNA是細胞新生標記物。在短暫性腦缺血術后2周,觀察APN-成年組、GFP-成年組、APN-老年組、GFP-老年組,進行側腦室室下區(Subventricular zone, SVZ)DCX染色細胞計數。結果顯示，APN-成年組SVZ區DCX的表達較GFP-成年組有明顯升高；APN-老年組缺血后SVZ區與GFP-老年組比較，DCX表達顯著增加，具體見圖13所示。計算tMCAO術后APN組與GFP對照組腦SVZ區DCX陽性細胞差值，比較觀察脂聯素對老年組、成年組小鼠缺血腦組織神經發生作用，結果說明APN轉導的老年組小鼠腦缺血后SVZ區神經發生較成年組更多。對缺血周圍區(per1-1nfarction)及海馬回齒狀區(Dentate Gyrus, DG)也進行了上述觀察，結果顯示APN-成年組在缺血周圍區，DCX陽性細胞數量較GFP-成年組有明顯升高；APN-老年組缺血周圍 區與GFP-老年組比較，DCX陽性細胞表達明顯升高。在缺血周圍區及DG區進行了 DCX+/PCNA+共染色細胞計數分析，結果提示APN-成年組、APN-老年組分別較GFP對照組升高，具有統計學差異。同樣的，差值比較發現，APN治療的老年組小鼠腦缺血周圍區、DG區神經發生較成年組更顯著。
權利要求
1.脂聯素在制備治療老年缺血性腦卒中藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬于醫藥制備領域，特別涉及脂聯素在制備治療老年缺血性腦卒中藥物中的應用，本發明采用缺血/再灌注小鼠模型，通過AAV載體基因治療，將脂聯素分別轉染至老年小鼠、成年小鼠腦內，使脂聯素在小鼠腦內局部高表達。tMCAO造模，觀察脂聯素對老年小鼠及成年小鼠腦后缺血后腦萎縮程度、血管新生、神經變化等的影響。結果表面脂聯素對老年小鼠腦缺血后腦萎縮的改善效果比成年小鼠更顯著，具有抗缺血的腦保護作用；脂聯素對老年小鼠神經學功能的恢復效果明顯；脂聯素可促進老年小鼠腦缺血區域血管生成；脂聯素對促進老年組小鼠腦內動脈增生效果顯著；脂聯素對老年小鼠腦缺血后神經發生促進作用較成年小鼠更顯著。
文檔編號A61K38/19GK103041371SQ201210594640
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者寧光, 繆婕, 沈琳輝, 趙詠桔 申請人:上海市內分泌代謝病研究所