針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區及相應Fab和全長抗體的制作方法
【專利摘要】本發明涉及針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區及相應的Fab和全長抗體。更具體而言，本發明利用人源單克隆抗體噬菌體展示文庫篩選到針對人VEGFR2的單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區并利用所述可變區制備出了相應的Fab片段和全長抗體。本發明的抗體可以有效影響VEGF/VEGFR2的相互作用。
【專利說明】針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區及相應Fab和全長抗體
【技術領域】
[0001]本發明涉及針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區及相應的Fab和全長抗體。更具體而言，本發明涉及用噬菌體展示技術篩選出的針對VEGFR2的全人源抗體重鏈和輕鏈可變區以及含有所述可變區的抗體Fab片段和全長抗體。
【背景技術】
[0002]血管新生不僅在正常發育過程中起著關鍵作用，而且還在一些疾病發生過程中起著重要的作用，比如腫瘤。腫瘤細胞增殖、腫瘤體積變大必須伴隨著血管新生為腫瘤細胞提供營養和氧氣，同時排除代謝廢物。
[0003]血管增生是一個復雜的生理過程，現有的證據表明失控的血管新生是腫瘤增殖及轉移的主要原因。血管增生也和其他疾病密切相關，包括糖尿病視網膜病變，風濕性關節炎及銀屑病等疾病。所以抑制血管新生成為治療這些疾病的可行方法。
[0004]在血管新生過程中，血管內皮細胞生長因子VEGF (vascular endothelialgrowthfactor)起著及其重要的作用，VEGF能強烈地刺激血管內皮細胞增殖。VEGF也被稱作VEGF-A，VEGF家族還包括PIGF、VEGF-B, VEGF-C及VEGF-D等成員。VEGF調控正常及病理血管的生長，而VEGF-C和VEGF-D主要調控淋巴血管新生。其中VEGF基因表達通過選擇性拼接其外顯子產生4個異構體，分別是VEGF121 (含有121個氨基酸)、VEGF165 (含有165個氨基酸)>VEGF189 (含有 189個氨基酸)和VEGF2tl6 (含有206個氨基酸)。其中VEGF165是主要的VEGF表達異構體，和各種生理及病理密切相關，它是一種分泌性蛋白質，但同時也能通過肝素結合到細胞表面和細胞外基質。分泌的VEGF以二聚體的形式存在，其中兩個單體之間被兩個二硫鍵連接在一起。VEGF是一種多功能的細胞激素，在低氧及致癌突變過程中能被誘導表達。VEGF是很強的血管滲透誘導劑、內皮細胞趨化劑、內皮細胞生存及增殖生長因子。
[0005]VEGF結合的受體包括VEGFRl(也被稱作Flt-1)及VEGFR2 (也被稱作Flk-1)。現有的證據表明VEGFR2介導VEGF的多種效應，包括內皮細胞增殖、血管增生及滲透，盡管VEGF結合到VEGFRl的親和力更高。而VEGFRl似乎并沒有直接參與內皮細胞增殖和血管增生，但是VEGFRl參與了 VEGF誘導單核細胞和巨噬細胞的遷移。
[0006]VEGFRl和VEGFR2屬于III型受體酪氨酸激酶家族，其特征是胞外區由7個IgG樣的結構域組成，中間含有一個細胞跨膜區，胞內含有一個酪氨酸激酶結構域。VEGFR3結合VEGF 一 C和VEGF — D，在淋巴管的發育過程中起作用。VEGF 二聚體結合到VEGFR2以后誘發受體二聚體化，胞內酪氨酸激酶結構域的酪氨酸磷酸化，從而激活下游信號通路，包括激活磷脂酶C，增加細胞內鈣離子濃度等。
[0007]所以VEGF及VEGFR2是很好的治療靶點，抑制該信號通路理論上能夠抑制血管新生，從而達到治療血管新生相關的疾病。目前已有多個抑制VEGF信號通路的方法，包括VEGF人源化單克隆抗體、VEGFR小分子抑制劑等。鑒于VEGFR2在VEGF信號通路中的重要作用，抑制VEGFR2應該是一種抑制血管新生的策略。
[0008]針對VEGFR2的抑制性抗體可以用于治療血管新生相關疾病，包括腫瘤如固體瘤和非固體瘤、新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病比如風濕性關節炎、眼科疾病比如糖尿病視網膜疾病和老年性視網膜黃斑退化等疾病。
[0009]抗體是一類重要的蛋白質分子用于治療人類疾病。單克隆抗體由于其針對靶點的高度特異性已在臨床上被廣泛作為藥物使用。抗體是一類糖蛋白，它們具有相同的結構特征。天然抗體通常是一類分子量為150kD的四聚體糖蛋白，由兩個相同的輕鏈和兩個相同的重鏈組成。其中每一條輕鏈通過二硫鍵和重鏈相連，兩條重鏈之間也通過二硫鍵相連。每一條重鏈和輕鏈分別由可變區和恒定區組成。重鏈恒定區分為α、δ、ε、Y和μ，輕鏈恒定區分為kappa(K)和IambdaO )。可變區決定了抗體的特異性及其和抗原的親和力。可變區包括3個高變區(⑶R區)和4個框架區(FR區)，兩個框架區之間由一個高變區連接。重鏈的恒定區包含三個結構域(CH1、CH2和CH3)，輕鏈的恒定區包含一個結構域CL。
[0010]由于動物來源的抗體用于人體會產生免疫反應，所以必須對動物來源的抗體進行人源化。另外，隨著技術的發展，已經可以通過噬菌體展示技術及其他技術，如核糖體展示技術，抗體人源化小鼠技術等方法，得到全人源的單克隆抗體。目前臨床上使用的治療性單克隆抗體包括嵌合單克隆抗體、人源化單克隆抗體及全人源單克隆抗體。其中全人源單克隆抗體由于其高度的親和力及低度的致人體免疫性等特征最受青睞。
[0011]抗體的噬菌體展示技術就是將抗體V區片段融合噬菌體表面蛋白(g3)后展示到噬菌體表面，然后針對不同抗原對噬菌體庫進行篩選，最終得到特異的抗體。噬菌體表面的抗體片段的展示和篩選實際上是模擬機體免疫篩選，抗體能夠從人工建立的噬菌體文庫中篩選得到。同一個文庫可以針對不同的抗原篩選到多個不同的單克隆抗體。噬菌體抗體文庫所包括的抗體分子的多樣性及該文庫的庫容量的大小決定篩選的抗體的親和力。目前有多種方法構建得到抗體文庫，包括從B細胞cDNA通過PCR直接擴增重鏈和輕鏈的V區片段，在體外隨機組合后克隆到不同載體上得到scFv或者Fab文庫。這些B細胞既可以來源于抗原免疫后的個體，也可以來源于非免疫的個體。這種直接來源于個體的抗體文庫可以針對不同的抗原篩選到高親和力的抗體，包括自身的抗原及毒性抗原。同時，還可以將抗體V區片段中不同的區域分別擴增或人工合成的片段在體外進行重組得到抗體scFv或者Fab文庫。
[0012]抗體噬菌體展示的功能除了能篩選針對不同的抗原得到特異的抗體外，還能對得到的抗體進一步突變其高變區以提高其親和力、增強其治療效力。
[0013]因此，本發明試圖利用噬菌體展示技術來篩選針對VEGFR2的全人源單克隆抗體的重鏈和輕鏈序列，并繼而利用基因工程的方法得到完整的抗體，從而為針對血管新生的疾病治療提供相應的藥物。
【發明內容】
[0014]因此，本發明的技術目的在于利用噬菌體展示技術獲得針對VEGFR2的全人源單克隆抗體的重鏈和輕鏈序列，并繼而利用基因工程的方法得到完整的抗體或其功能片段。
[0015]因此，本發明的第一方面涉及一種針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其重鏈的互補決定區⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與SEQID N0.3USEQ ID N0.32和SEQ ID N0.33所示的序列具有至少80%的同一性，其輕鏈的互補決定區⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與選自下述組的序列具有至少80%的同一性:
[0016]組1:SEQ ID N0.34，SEQ ID N0.35 和 SEQ ID N0.36 ；
[0017]組2:SEQ ID N0.37，SEQ ID N0.38 和 SEQ ID N0.39 ；
[0018]組3:SEQ ID N0.40，SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 ；
[0019]組4:SEQ ID N0.43，SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45 ；
[0020]組5:SEQ ID N0.46，SEQ ID N0.47 和 SEQ ID N0.48 ；
[0021]組6:SEQ ID N0.49，SEQ ID N0.50 和 SEQ ID N0.51 ；
[0022]組7:SEQ ID N0.52，SEQ ID N0.53 和 SEQ ID N0.54 ；
[0023]組8:SEQ ID N0.55，SEQ ID N0.56 和 SEQ ID N0.57 ；
[0024]組9:SEQ ID N0.58，SEQ ID N0.59 和 SEQ ID N0.60 ；
[0025]組10:SEQ ID N0.61，SEQ ID N0.62 和 SEQ ID N0.63 ；
[0026]組11:SEQ ID N0.64，SEQ ID N0.65 和 SEQ ID N0.66 ；
[0027]組12: SEQ ID N0.67，SEQ ID N0.68 和 SEQ ID N0.69 ；
[0028]組13: SEQ ID N0.70，SEQ ID N0.71 和 SEQ ID N0.72 ;或
[0029]組14:SEQ ID N0.73，SEQ ID N0.74 和 SEQ ID N0.75。
[0030]優選地，所述同一性為至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
[0031]優選地，所述全人源單克隆抗體的重鏈恒定區選自α、δ、ε、Y或μ或與α、δ、ε、Y或μ具有至少80%同一1丨生的序列,輕鏈恒定區選自K或λ或與K或λ具有至少80%同一性的序列，優選地，所述同一性為至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
[0032]優選地，其重鏈序列與如SEQ ID N0.2所示的序列的同一性為至少80%，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優選地，100%ο
[0033]優選地，其輕鏈序列與如選自下述序列之一的序列的同一性為至少80%:SEQ IDN0.4、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.12、SEQ ID N0.14、SEQ IDN0.16,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0.20,SEQ ID N0.22,SEQ ID N0.24,SEQ ID N0.26,SEQ IDN0.28或SEQ ID N0.30，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。 [0034]優選地,所述抗體的類型為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
[0035]優選地，所述抗體的類型為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。
[0036]優選地,所述功能片段或衍生物為(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv、多價單鏈抗體、雙特異性抗體或三特異性抗體。
[0037]本發明的第二方面涉及一種編碼如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物的核苷酸序列。
[0038]優選地，其重鏈的編碼序列與如SEQ ID N0.1所示的序列的同一性為至少80%，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優選地，100% ;輕鏈的序列與選自下述序列的序列的同一性為至少80%:SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.9、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.13、SEQ IDN0.15,SEQ ID N0.17,SEQ ID N0.19,SEQ ID N0.2USEQ ID N0.23,SEQ ID N0.25,SEQ IDN0.27或SEQ ID N0.29，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
[0039]本發明的第三方面涉及一種根據如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據如上第二方面所述的核苷酸序列在制備阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的藥物中的用途。
[0040]本發明的第四發明涉及一種根據權如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據如上第二方面所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤和非腫瘤疾病的藥物中的用途。
[0041]優選地，所述腫瘤為原發性的、轉移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤，優選地，固體腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌或皮膚癌，非固體瘤選自各種白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；優選地，所述非腫瘤疾病選自新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病優選風濕性關節炎、眼科疾病優選糖尿病視網膜疾病或老年性視網膜黃斑退化。
[0042]本發明的第五方面涉及一種主要活性成分為根據如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據如上第二方面所述的核苷酸序列的組合物。
[0043]優選地，所述組合 物還含有化療藥物、腫瘤抑制劑優選小分子化合物抑制劑或單克隆抗體，優選抗EGFR、IGFlR或TOGFR的單克隆抗體。
[0044]優選地，根據如上第一方面所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物偶聯有細胞毒素。
[0045]換言之，本發明的VEGFR2單克隆抗體的重鏈及輕鏈(包括框架區及⑶R區)均是通過噬菌體展示技術得到的全人源序列(通過篩選含有全人源序列的噬菌體文庫)。該抗體能結合到VEGFR2的胞外區，阻斷VEGF結合到VEGFR2，抑制VEGF促進內皮細胞增殖的活性，從而抑制腫瘤的生長。
[0046]本發明篩選鑒定的重鏈及輕鏈序列可以利用基因工程的方法得到完整的抗體IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。這些抗體的重鏈恒定區分別對應α、δ、ε、Y和μ，這些抗體的輕鏈恒定區可以是kappa( κ )和lambda(A)。這些抗體可以包括其各亞型，比如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAU IgA2等等。還可以通過基因工程的方法得到其他形式的單克隆抗體，包括(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv(SCFV)、多價單鏈抗體、雙特異性抗體、三特異性抗體等其他任何形式的抗體。
[0047]本領域技術人員公知，決定抗體特異性等性質的關鍵因素在于其重鏈和輕鏈的可變區序列(尤其是重鏈和輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3的序列)，恒定區以及互補決定區間的框架區序列可以做適當的改變而不至于實質性影響抗體的特異性等性質。所述適當的改變如保守氨基酸的替換等。
[0048]該發明的抗體可以治療以下腫瘤，包括但不限于以下腫瘤，包括原發性的、轉移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤。固體腫瘤包括乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌、皮膚癌。非固體瘤包括各種白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等疾病。
[0049]該發明的抗體還可以治療以下非腫瘤疾病，包括但不限于以下非腫瘤疾病，包括新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病比如風濕性關節炎、眼科疾病比如糖尿病視網膜疾病和老年性視網膜黃斑退化等疾病。
[0050]該發明的抗體可以單獨使用，也可以聯合其他藥物一起使用，包括各種化療藥物、腫瘤抑制劑比如小分子化合物抑制劑和單克隆抗體(如針對EGFR、IGF1R、PDGFR的單抗)。
[0051]該發明的抗體還可以偶聯其他化合物，比如細胞毒素，以用于治療腫瘤。
[0052]本發明的抗體為針對血管新生的疾病治療提供了新的藥物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0053]圖1:噬菌體Elisa值。
[0054]圖2:鑒定具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆。 [0055]圖3:陽性克隆Fab蛋白質阻斷VEGF/VEGFR2相互作用。
[0056]圖4:陽性克隆Fab蛋白質阻斷VEGF刺激人臍帶內皮細胞的增殖。
[0057]圖5:陽性克隆IgGl全長抗體阻斷VEGF/VEGFR2相互作用。
[0058]圖6:陽性克隆IgGl全長抗體阻斷VEGF刺激人臍帶內皮細胞的增殖。
【具體實施方式】
[0059]下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的范圍。
[0060]下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。
[0061]實施例
[0062]實施例1、人源單克隆抗體噬菌體展示文庫的構建
[0063]本發明首先根據Marks J等人的文獻報道(J Mol Biol, 1991，222，p581_597)構建了一個scFv噬菌體展示文庫，該庫容量很大，共有超過1.0X 101°獨立克隆數，宿主為XLl-Blue 細菌。
[0064]實施例2、篩選scFv噬菌體文庫得到抗人VEGFR2的陽性單克隆
[0065]篩選步驟如下:
[0066]1、從scFv文庫中取10毫升XLl-Blue細菌，接種到IL的2YTAG培養基中，30°C常規培養到對數生長期，加M13-K07輔助性噬菌體，擴增過夜(30°C，2YTAK培養基)。擴增的噬菌體用20%的PEG8000沉淀，然后重懸在100ml PBS (20mM磷酸鹽pH7.4)中并對噬菌體
滴度定量。
[0067]2、將抗原VEGFR2 — Fe采用常規技術手段固定到Maxisorp Star管，加牛奶封閉I小時(37°C)，然后加入噬菌體，用PBST (20mM磷酸鹽0.05%Tween-20pH7.4)洗15次，用PBS洗15次。結合的噬菌體用0.1M、pH2.2的HCL洗脫下來。
[0068]3、將洗脫下來的噬菌體感染XLl-Blue細菌，然后感染的細菌涂布在幾個2YTAG平板上，37 °C溫育過夜。
[0069]4、隨機挑選200個克隆用于噬菌體Elisa。[0070]5、單個XLl-Blue克隆接種到96孔平板，加入M13K07輔助性噬菌體，過夜。擴增的噬菌體用牛奶阻斷，加入到已包被人VEGFR2 - Fe的96孔平板，溫育I小時后，平板用PBST (同上)洗4次，再加入兔抗M13噬菌體一 HRP偶聯物。平板用PBST (同上)洗4次，加入TMB過氧底物，于450nm讀數，結果見圖1。噬菌體Elisa結果顯示:噬菌體上清液在1:50稀釋后單克隆1D4B5、1E10C3、3D2G1、3E10G9和3F1G10的Elisa讀數大于1.1，表明這些克隆對VEGFR2蛋白質具有很高的親和力。利用相似的方法，本發明獲得的單克隆A8E2、1H4D7、1H6D8、3E7G7、1G2C10、1F3C5、1G4C11、3C4F5 和 3D8G3 對 VEGFR2 蛋白質也具有很高的親和力。上述獲得的十四株抗體的共同特征是它們的重鏈序列相同，區別僅在于輕鏈序列不同，但都具有很高的針對VEGFR2蛋白質的親和力。
[0071]實施例3、篩選具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性單克隆抗體
[0072]隨機挑選單克隆1D4B5、1E10C3、3D2G1、3E10G9、3F1G10 進行 VEGF/VEGFR2 相互作用的阻斷篩選試驗，篩選步驟簡述如下:
[0073]1、將能結合到VEGFR2的陽性克隆XLl-Blue細菌接種到2YTAG培養基，加M13-K07輔助性噬菌體，擴增過夜(30°C，2YTAK培養基)。將得到的噬菌體同VEGFR2混合溫育I小時，然后轉移到包被VEGF的96孔平板。溫育I小時后，平板用PBST (同上)洗4次，再加入山羊抗人IgG-Fc - HRP偶聯物。平板用PBST (同上)洗4次，加入TMB過氧底物，于450nm讀數。
[0074]2、鑒定具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆，噬菌體Elisa結果顯示:單克隆1D4B5、1E10C3、3D2G1、3E10G9和3F1G10均具有阻斷效果，結果見圖2。同樣地，噬菌體Elisa 結果顯示單克隆 A8E2、1H4D7、1H6D8、3E7G7、1G2C10、1F3C5、1G4C11、3C4F5 和 3D8G3 也都有阻斷效果。
[0075]3、將具有阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的陽性克隆進行DNA測序，得到陽性克隆重鏈及輕鏈可變區序列，其中所述抗體的重鏈序列均如SEQ ID N0.2所示，其核苷酸編碼序列如SEQ ID N0.1所示，其CDR1、CDR2和CDR3的序列分別如SEQ IDN0.31-33所示。上述十四株抗體的輕鏈序列及其互補決定區的序列如表1所示。
[0076]表1
[0077]
【權利要求】
1.一種針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其重鏈的互補決定區CDRU CDR2和CDR3的序列分別與SEQ ID N0.31、SEQ ID N0.32和SEQID N0.33所示的序列具有至少80%的同一性，其輕鏈的互補決定區⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列分別與選自下述組的序列具有至少80%的同一性:
組 1:SEQ ID N0.34，SEQ ID N0.35 和 SEQ ID N0.36 ；
組 2:SEQ ID N0.37，SEQ ID N0.38 和 SEQ ID N0.39 ；
組 3:SEQ ID N0.40，SEQ ID N0.41 和 SEQ ID N0.42 ；
組 4:SEQ ID N0.43，SEQ ID N0.44 和 SEQ ID N0.45 ；
組 5:SEQ ID N0.46，SEQ ID N0.47 和 SEQ ID N0.48 ；
組 6:SEQ ID N0.49，SEQ ID N0.50 和 SEQ ID N0.51 ；
組 7:SEQ ID N0.52，SEQ ID N0.53 和 SEQ ID N0.54 ；
組 8:SEQ ID N0.55，SEQ ID N0.56 和 SEQ ID N0.57 ；
組 9:SEQ ID N0.58，SEQ ID N0.59 和 SEQ ID N0.60 ；
組 10:SEQ ID N0.61，SEQ ID N0.62 和 SEQ ID N0.63 ；
組 11:SEQ ID N0.64，SEQ ID N0.65 和 SEQ ID N0.66 ；
組 12: SEQ ID N0.67，SEQ ID N0.68 和 SEQ ID N0.69 ；
組 13:SEQ ID N0.70，SEQ ID N0.71 和 SEQ ID N0.72 ;或
組 14:SEQ ID N0.73，SEQ ID N0.74 和 SEQ ID N0.75。
2.根據權利要求1所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述同一性為至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
3.根據權利要求1或2所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述全人源單克隆抗體的重鏈恒定區選自α、δ、ε、Y或μ或與α、δ、ε、Y或μ具有至少80%同一'I"生的序列,輕鏈恒定區選自K或λ或與K或λ具有至少80%同一性的序列，優選地，所述同一性為至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
4.根據權利要求1至3任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于其重鏈序列與如SEQ ID N0.2所示的序列的同一性為至少80%，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%,98% 或 99%，最優選地，100%。
5.根據權利要求1至4任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于其輕鏈序列與如選自下述序列之一的序列的同一性為至少 80%:SEQ ID N0.4,SEQ ID N0.6,SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.10,SEQ ID N0.12,SEQID N0.14,SEQ ID N0.16,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0.20,SEQ ID N0.22,SEQ ID N0.24,SEQID N0.26,SEQ ID N0.28或SEQ ID N0.30，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
6.根據權利要求1至5任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述抗體的類型為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。
7.根據權利要求1至6任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述抗體的類型為IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl或IgA2。
8.根據權利要求1至7任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其特征在于所述功能片段或衍生物為(Fab’)2、Fab、單鏈抗體、單鏈sv、多價單鏈抗體、雙特異性抗體或三特異性抗體。
9.一種編碼根據權利要求1至8任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物的核苷酸序列。
10.根據權利要求9所述的核苷酸序列，其特征在于重鏈的編碼序列與如SEQIDN0.1所示的序列的同一性為至少80%，優選地，至少85%，優選地至少90%，更優選地，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%，最優選地，100% ;輕鏈的序列與選自下述序列的序列的同一性為至少 80%:SEQ IDN0.3、SEQ ID N0.5, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.9, SEQ IDN0.11、SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.21、SEQ IDN0.23、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.27 或 SEQ ID N0.29，優選地，至少 85%，優選地至少 90%，更優選地，至少 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99%，最優選地，100%。
11.一種根據權利要求1至8任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據權利要求9或10所述的核苷酸序列在制備阻斷VEGF/VEGFR2相互作用的藥 物中的用途。
12.—種根據權利要求1至8任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據權利要求9或10所述的核苷酸序列在制備治療腫瘤和非腫瘤疾病的藥物中的用途。
13.根據權利要求12所述的用途，其特征在于所述腫瘤為原發性的、轉移性的以及難治愈性的各種固體腫瘤和非固體腫瘤，優選地，固體腫瘤選自乳腺癌、肺癌、結腸癌、胰腺癌、膠質瘤、頭頸癌、前列腺癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、胃癌、腎癌或皮膚癌，非固體瘤選自各種白血病、淋巴瘤或骨髓瘤；優選地，所述非腫瘤疾病選自新生血管性青光眼、冠狀動脈疾病、炎癥性疾病優選風濕性關節炎、眼科疾病優選糖尿病視網膜疾病或老年性視網膜黃斑退化。
14.一種主要活性成分為根據權利要求1至8任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物或根據權利要求9或10所述的核苷酸序列的組合物。
15.根據權利要求14所述的組合物，其特征在于其還含有化療藥物、腫瘤抑制劑優選小分子化合物抑制劑或單克隆抗體，優選抗EGFR、IGFlR或PDGFR的單克隆抗體。
16.一種根據權利要求1至8任一項所述的針對哺乳動物包括人VEGFR2的全人源單克隆抗體、其功能片段或其衍生物，其偶聯有細胞毒素。
【文檔編號】A61P29/00GK103965355SQ201310047022
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月6日 優先權日:2013年2月6日
【發明者】常永生, 方福德, 董學雨, 左瑾 申請人:中國醫學科學院基礎醫學研究所