ang2在制備ECTC血管類型肝癌診斷試劑及治療藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種蛋白編碼基因ang2及其應用。本發明進行了人肝癌標本組織免疫組化和血液標本Elisa檢測，表明肝癌病人組織或血液標本中ang2的表達可以指示病人組織血管類型；另外，小鼠成瘤實驗的結果表明體內敲低ang2的表達可顯著抑制肝癌細胞的體內成瘤能力和ECTC類型血管的生成能力。因此，ang2可用于制備ECTC血管類型肝癌的指示劑以及治療ECTC血管類型肝癌的藥物。
【專利說明】ang2在制備ECTC血管類型肝癌診斷試劑及治療藥物中的 應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程領域，具體涉及ang2及其在制備ECTC血管類型肝癌診斷試 劑及治療藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 原發性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見的惡性腫 瘤之一，其發生率和死亡率均高居各種惡性腫瘤前列。眾所周知，癌癥難以根治的主要原因 是局部復發和遠處轉移。一般認為，肝臟豐富的血管系統以及肝癌活躍的血管生成，是肝 癌患者易于發生血行轉移，尤其是早期肝內播散的重要因素。但是，肝癌中微血管的數量 與肝癌復發轉移的相關性尚存爭議。而我們發現：肝癌中存在ECTC (endothelium-coated tumor cell clusters,內皮細胞包繞腫瘤團塊）和非ECTC (non-ECTC)兩種血管結構，前 者的血管呈網絡狀連接，將腫瘤塊包繞分割；后者的血管則為分散的管狀結構。更為重要的 是，與non-ECTC肝癌相比，ECTC肝癌組織中鏡下微小轉移灶更多，行根治性切除術后復發 率更高、生存時間更短。這提示：ECTC血管結構很可能為癌細胞生長及轉移提供了更強大 的便利條件，因此制備ECTC血管類型肝癌診斷試劑及治療藥物具有重要的應用價值。
[0003] Sugino等最早報道了腫瘤中類似ECTC的血管結構的存在。他們將低侵襲高轉移 的鼠乳腺癌細胞株接種小鼠乳房脂肪墊成瘤后，觀察到腫瘤中血管發展成融合的血竇樣結 構，并包繞腫瘤團塊；而且，該細胞株雖然促血管生成能力強，但分泌MMP和侵襲能力弱。此 后，該課題組在人肝癌、腎癌和甲狀腺癌中都觀察到癌栓被內皮細胞包繞的現象。我們之前 的報道首次證明了 ECTC結構與腫瘤的轉移復發密切相關，是獨立的預后不良預測因素。至 今，關于ECTC形成的潛在機制研究只有兩篇報道，他們發現：過表達VEGF-A或分泌型白細 胞蛋白酶抑制因子（SLPI)可促進腫瘤細胞株成瘤組織中ECTC結構血管的形成。
[0004] Angiopoietin/Tie介導了血管的成熟，是血管生成尤其是腫瘤血管生成的重要調 控通路。Angiopoietin (血管生成素）家族主要包括Aangl，ang2和ang4,其受體tie家族 主要包括tie-Ι和tie-2。angl是tie-2的激活劑，而ang2則作為angl的拮抗劑，可與 angl競爭性的結合tie-2。ang4目前報道不多，其功能可能與angl相似。而tie-Ι的配體 尚未鑒定，tie-Ι可能作為tie-2的負調節因子存在。Angl/tie-2信號激活可以維持內皮 細胞處在靜息狀態，同時angl還可以刺激壁細胞(血管平滑肌細胞和周細胞)覆蓋到內皮細 胞表面以及基底膜的沉積，使血管連接更加緊密，表現出成熟血管的特征。腫瘤中，angl可 以促進內皮細胞存活和血管成熟幫助腫瘤生長，但同時促進血管的成熟抑制腫瘤細胞侵襲 血管。而ang2可拮抗angl，使內皮細胞由靜息態變為激活狀態，開始增殖和出芽，生成新 的血管。同時ang2還可以降低壁細胞的覆蓋，使血管通透性增加，并表現出不成熟的特征。 由此可見，angl在腫瘤發展中起到雙面作用。而目前多數研究認為ang2主要起到促腫瘤 的作用，是抗血管藥物潛在的靶分子。
[0005] 國內外文獻中至今未見有關ang2與ECTC血管類型的相關性研究報道。因此，進 一步研究ang2在ECTC類型血管生成中的作用及其在肝癌診治中的應用，對于制備高效的 抗腫瘤血管生成藥物以及腫瘤個體化治療意義重大。
【發明內容】
[0006] 為了解決以上技術問題，本發明的一個目的是提供肝癌患者肝組織中的ang2表 達水平作為ECTC血管類型肝癌的標記的應用。
[0007] 本發明的另一個目的是提供肝癌患者血液標本中ang2的表達水平作為ECTC血管 類型肝癌的標記的應用。
[0008] 本發明的再一個目的是提供ang2在制備用于ECTC血管類型肝癌診斷及預后的試 劑中的應用。其中患者肝癌組織或血液標本中ang2的高表達指示ECTC血管類型的可能性 更高，從而預測患者更容易轉移和復發。本發明還提供了檢測ang2表達水平的試劑在制備 用于ECTC血管類型肝癌診斷預測及預后的試劑中的應用。
[0009] 此外，本發明還提供了檢測ECTC血管類型肝癌的試劑盒，其包含用于檢測肝癌組 織或血液標本中ang2的表達水平的試劑。優選地，所述檢測肝癌組織或血液標本中ang2 表達水平的試劑，包括ang2特異抗體。
[0010] 本發明的另一目的在于提供ang2在制備治療ECTC血管類型肝癌的藥物中的應 用。
[0011] 為證實ang2的表達水平在作為ECTC血管類型肝癌的標記中的應用，設置了 A、B 兩個實驗，具體如下：
[0012] 實驗A :免疫組化檢測肝癌病人組織中⑶34 (血管內皮細胞標記分子)、ang2的表 達。
[0013] 實驗B :Elisa法檢測肝癌病人血液標本中ang2的表達。
[0014] 對實驗結果進行對比分析及相關性統計表明：實驗A的140份肝癌病人組織中， 經過⑶34標記血管內皮細胞，以及軟件得到的ang2陽性信號值，我們發現，在ECTC組織中 ang2表達水平顯著更高；實驗B中的69份肝癌病人血液標本標本中，肝癌病人血液標本中 的ang2的表達在組織血管類型為ECTC的標本中顯著更高。以上結果均表明，ang2在肝癌 病人肝組織中的表達或是血液標本的表達水平可以指示組織血管類型，從而預測肝癌病人 的預后。
[0015] 本發明通過小鼠成瘤實驗研究ang2在體內表達對肝癌細胞生長和ECTC類型血 管的影響。上述小鼠成瘤實驗設置陰性對照組和實驗組。陰性對照組的腫瘤細胞株中轉 染NC或感染control病毒，實驗組的腫瘤細胞株中轉染si-ang2或感染表達sh-mAng2的 病毒。上述小鼠成瘤實驗所采用的腫瘤細胞株為人原代肝癌細胞66#T和小鼠肝癌細胞株 Hepal_6〇
[0016] 對實驗結果進行對比分析及相關性統計表明：與陰性對照組形成ECTC類型血管 不同，實驗組的腫瘤的血管形態轉變為更多的no-ECTC血管，統計學分析具有顯著差異。
[0017] 小鼠成瘤實驗結果表明，體內抑制ang2表達可以顯著抑制肝癌細胞形成ECTC類 型血管的能力，降低轉移復發率，從而改善肝癌患者的預后。
[0018] 因此，本發明還提供了抑制ang2表達的試劑在制備治療ECTC血管類型肝 癌的藥物中的應用。優選的，所述抑制ang2表達的試劑包含抗ang2抗體、siRNA 和/或sh RNA。更優選地，所述siRNA為Si-ang2,其RNA序列從5'端到3'端為： 5' -GATGATAGAAATAGGGACAAAdTdT-3'。或者，所述 sh RNA 為 sh-mAng2,其引物序列如下，
[0019] shmAng2#l 正向引物：5' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3' ；
[0020] 反向引物：
[0021] 5 ' -CATCTCGAGGCGGCCGCCCGGGCTATCCGTAAAGAAGAGCAACTCGAGTTGCTCTTCTTTACGGAT AGCTTTTTGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3 ' ；
[0022] shmAng2#2 正向引物：5' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3' ；
[0023] 反向引物：
[0024] -CATCTCGAGGCGGCCGCCCGGCGTGCTTAAGATCCAGCTGAACTCGAGTTCAGCTGGATCTTAAGC ACGTTTTTGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3 '。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 圖1為免疫組化檢測血管內皮細胞標記⑶34和ang2表達代表圖及統計圖。圖1 是實施例1中的實驗A的實驗結果。
[0026] 圖2為Elisa檢測肝癌病人血液標本ang2表達的統計圖。圖1是實施例1中的 實驗B的實驗結果。
[0027] 圖3為66#T小鼠成瘤實驗結果圖。圖3A為轉染si_ang2后，66#Tang2表達檢測 圖；圖3B為血管類型及統計圖。圖3是實施例2的實驗結果.
[0028] 圖4為Hepal-6小鼠成瘤實驗結果圖。其中，圖4A為免疫組化標記的小鼠腫瘤表 達ang2的代表圖和統計圖；圖4B免疫組化標記的小鼠腫瘤血管內皮細胞染色代表圖和血 管類型的統計圖。圖4是實施例2的實驗結果.
【具體實施方式】
[0029] 以下結合具體實施例，進一步說明本發明的技術方案。應理解，以下實施例只用于 說明本發明而不以任何形式限制本發明。
[0030] ang2 (Angiopoietin2)基因的序列如 NCBI 數據庫所收錄（NCBI. Annotation:Chr omosome8, NC_000008. 10)〇
[0031] 本發明所采用的ang2免疫組化特異抗體由Abeam公司（美國）購得；⑶34免疫組 化抗體由北京中衫公司（中國）購得；血液標本中ang2的Elisa檢測試劑盒由R&D公司（美 國）購得。
[0032] 本發明所采用的si_ang2序列從NCBI數據庫獲得，其RNA序列從5'端到3'端為： 5 ' -GATGATAGAAATAGGGACAAAdTdT-3 '，由上海吉瑪公司合成。陰性對照組的陰性對照RNA序 列（也稱NC)為上海吉瑪公司合成的用于siRNA實驗的標準陰性對照序列，其RNA序列從5' 端到 3' 端為：5' -UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3'。
[0033] 本發明所采用的sh_mAng2序列從NCBI數據庫獲得，引物序列如下，
[0034] shmAng2#l 正向引物：5' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3' ；
[0035] 反向引物：
[0036] 5 ' -CATCTCGAGGCGGCCGCCCGGGCTATCCGTAAAGAAGAGCAACTCGAGTTGCTCTTCTTTACGGAT AGCTTTTTGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3 ' ；
[0037] shmAng2#2 正向引物：5' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3' ；
[0038] 反向引物：
[0039] -CATCTCGAGGCGGCCGCCCGGCGTGCTTAAGATCCAGCTGAACTCGAGTTCAGCTGGATCTTAAGC ACGTTTTTGGAATTCCGCGTCCTTTCCACAAG-3'。由上海英俊公司合成，通過pCDH慢病毒表達系統 合成表達病毒。
[0040] 實施例1 :人組織標本ang2表達指示肝癌組織血管類型
[0041] 1.1免疫組化檢測
[0042] 人肝癌組織的切片由中山大學附屬腫瘤醫院標本庫提供。制成石蠟切片4°C保存。 后續檢測步驟為：
[0043] (1)預處理：取出55°C烤片lh，放于二甲苯中脫蠟兩次，每次lOmin ;依次用 100 %、95 %、90 %、80 %、70 %的乙醇洗一次，每步3min，后用雙蒸水洗3min ;0. 3 %的雙氧 水處理lOmin，雙蒸水再洗3次，每次3min ;浸泡于修復液中，用微波爐進行熱修復，室溫冷 卻半小時；用1XPBS洗三次，每次3min ;
[0044] (2)雜交染色：用⑶34或ang2抗體進行孵育,4°C過夜；恢復室溫，棄去抗體液，用 1XPBS洗三次，每次5min ;加入二抗，37°C半小時；用1XPBS洗三次，每次5min ;加入DAB 顯色液進行顯色，然后用蘇木精復染。
[0045] (3)計數：⑶34染色判斷血管類型；ang2染色后400倍鏡下隨機拍10個視野，通 過Imagine Pro Plus軟件計數ang2陽性面積。
[0046] 1.2Elisa 檢測
[0047] 人肝癌病人的血液標本由中山大學附屬腫瘤醫院提供，相關實驗獲得中山大學倫 理委員會的批準。_80°C保存。后續檢測步驟為試劑盒提供，具體如下
[0048] (1)加樣：加一定稀釋的待檢樣品0. 1ml于上述已包被之反應孔中，置37°C孵育1 小時。然后洗漆。
[0049] 空白對照組：空白孔，僅加入顯色液；
[0050] 陰性對照組：樣品為樣品稀釋液；
[0051] 實驗組：經樣品稀釋液稀釋的樣品檢測液；
[0052] (2)加酶標抗體：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的一抗0. 1ml。37°C孵育2小時，洗 滌。加入二抗工作液〇. lml。37°C孵育1小時，洗滌。
[0053] (3)加底物液顯色：于各反應孔中加入新鮮配制的TMB底物溶液0. 1ml，室溫15-30 分鐘。
[0054] (4)結果判定：在ELISA檢測儀上，于450nm處測定各個樣品孔的0D值。
[0055] 1. 3結果分析
[0056] 實驗A，如圖1所示，我們共檢測了 140份肝癌組織標本，通過⑶34染色血管內 皮細胞，根據血管形成分型，發現所檢測的肝癌組織中有53份（38%)為ECTC血管類型，87 (62%)為ηο-ECTC血管類型。通過Imagine Pro Plus軟件計數ang2陽性值，與血管類型 進行相關性分析，我們發現形成ECTC類型血管的肝癌組織ang2的平均表達值0. 073,而形 成no-ECTC類型血管的肝癌組織其平均表達值為0. 022, ECTC類型組織顯著高表達ang2 (Ρ〈0· 001，T 檢驗)。
[0057] 實驗Β，如圖2所示，我們通過Elisa共檢測了 69份肝癌病人的血液標本，在所檢 測血液標本對應的肝癌組織中，通過CD34染色血管內皮細胞，進行血管形態分型。發現所 檢測血液標本對應的肝癌組織中有32份（46%)為ECTC血管類型，37 (54%)為no-ECTC血管 類型。通過酶標儀讀取ang2的光密度值，與血管類型進行相關性分析，我們發現形成ECTC 類型血管的肝癌組織對應的血液標本中ang2的平均光密度值為0. 22,而形成no-ECTC類型 血管的肝癌組織對應的血液標本中，ang2平均光密度值為0. 14, ECTC類型的肝癌病人的血 液標本中顯著高表達ang2 (P〈0. 01，T檢驗)。
[0058] 上述結果顯示，肝癌病人組織或血液標本中ang2的表達水平可以作為ECTC血管 類型肝癌的指示分子。
[0059] 實施例2 :小鼠成瘤實驗
[0060] 2. 1細胞轉染或感染
[0061] 將目的RNA或病毒導入細胞。具體實驗步驟為：
[0062] (1)轉染：取胰蛋白酶消化細胞重懸于含有10% FBS的無雙抗DMEM培養基(購自 Invitrogen公司）中，使得細胞密度為3X104個細胞/ml ;將30p mol目的RNA稀釋于100μ 1 opti-MEM (購自Invitrogen公司）中，輕敲管壁混勻；每管加入Ιμ? Lipofectamine RNAi MAX，輕敲管壁混勻，室溫放置15min ;得到RNAi MAX/siRNA稀釋液；每孔加入100μ 1 RNAi MAX/siRNA稀釋液，再加入500 μ 1細胞稀釋液，該細胞稀釋液可使細胞密度在轉染24h后大 約為30-50%匯合。上述目的1?^可為8卜&1^2、陰性對照1?^(也稱％)。4811后，選取部 分細胞進行RT-PCR檢測敲低效率。
[0063] 上述實施例為24孔板，其他孔板可根據孔的大小按比例放大或者縮小試劑用量。
[0064] (2)感染：包括病毒包裝和感染靶細胞兩個步驟。
[0065] A.包裝：以24孔板為例，加入0. 3 μ g包裝混合質粒和0. 3 μ g表達質粒以及50 μ 1 的 opti-MEM，輕柔混勻，室溫孵育 5min。取 1 μ 1 Lipofectamine2000(購自 Invitrogen 公 司)溶于50 μ 1 opti-MEM中。輕柔混勻，室溫孵育5min。將上述兩管試劑混合，輕柔混勻，放 置15min后加入預先貼好的293T包裝細胞中。轉染后48-72h收獲含病毒的上清。0. 45um 孔徑的濾器過濾獲得病毒上清，于-80° C貯存。
[0066] B.感染靶細胞：在24孔板中種植適當密度的靶細胞，加入病毒感染，24h后更換培 養基，換入新鮮的培養基。48h后使用含有抗生素的新鮮培養基進行陽性細胞的篩選或是通 過流式分選GFP陽性的細胞。篩選到陽性細胞后進行RT-PCR檢測敲低效率。
[0067] 2. 2小鼠成瘤
[0068] 選用5只5周齡的BALB/c裸鼠，在其兩只后腿分別皮下注射1X106的表達 si-ang2或NC的66#T細胞。或是選用5只5周齡的C57小鼠，在其后腿分別皮下注射1 X 106表達sh-mAng2或control的hepal-6細胞。指定時間后，完整剝離腫瘤組織，以備后續實 驗。
[0069] 2. 3免疫組化
[0070] 小鼠的腫瘤組織取自步驟2.2,制成石蠟切片4°C保存。兩者后續檢測步驟為：
[0071] (1)預處理：取出55 °C烤片lh，放于二甲苯中脫錯兩次，每次10min ;依次用 100 %、95 %、90 %、80 %、70 %的乙醇洗一次，每步3min，后用雙蒸水洗3min ;0. 3 %的雙氧 水處理10min，雙蒸水再洗3次，每次3min ;浸泡于修復液中，用微波爐進行熱修復，室溫冷 卻半小時；用1XPBS洗三次，每次3min ;
[0072] (2)雜交染色：用鼠特異性的⑶34抗體和ang2抗體進行孵育，4°C過夜；恢復室 溫，棄去抗體液，用1XPBS洗三次，每次5min ;加入二抗，37°C半小時；用1XPBS洗三次，每 次5min ;加入DAB顯色液進行顯色，然后用蘇木精復染。
[0073] (3)計數：⑶34染色判斷血管類型，并計數形成血管內皮細胞包繞腫瘤細胞團的 ECTC血管個數；ang2染色后400倍鏡下隨機拍5個視野，通過Imagine Pro Plus軟件計數 ang2陽性面積。
[0074] 2. 4結果分析
[0075] 如圖3所示，A圖顯示我們所設計合成的si_ang2能夠顯著地敲低人原代肝癌細 胞66#T的ang2表達。而如B圖所示，敲低ang2表達的人肝癌原代細胞66#T在小鼠體內 形成的腫瘤，其組織血管類型發生了顯著的改變，通過計數ECTC類型血管的數量，我們發 現敲低ang2的肝癌細胞腫瘤形成ECTC血管的能力顯著減弱（％￥8.5;[-3叩2=11.14￥8.4· 22;ρ〈0· 01)。
[0076] 如圖4所示，利用shRNA敲低ang2表達的鼠肝癌細胞株Hepal-6在小鼠 體內形成的腫瘤，其ang2的表達顯著降低(平均表達值為control :sh-mAng2#l : sh-mAng2#2=0. 15:0. 06:0. 06, p〈0. 05)，而且計數 ECTC 類型血管的數量，敲低 ang2 表 達的小鼠肝癌細胞腫瘤形成ECTC血管的能力顯著減弱（平均ECTC個數為control : sh-mAng2#l ：sh-mAng2#2=ll. 7:1. 4:2. 3, p<0. 05)〇
[0077] 綜上所述，敲低內源ang2表達可以顯著抑制人或鼠肝癌細胞于小鼠體內形成 ECTC類型血管的能力。這表明降低Ang2的表達以及抑制ang2表達的試劑可以用于制備治 療ECTC血管類型肝癌的藥物。
【權利要求】
1. ang2在制備用于ECTC血管類型肝癌診斷預測及預后的試劑中的應用。
2. 檢測ang2表達水平的試劑在制備用于ECTC血管類型肝癌診斷預測及預后的試劑中 的應用。
3. 檢測ECTC血管類型肝癌的試劑盒，其包含用于檢測肝癌組織或血液標本中ang2表 達水平的試劑。
4. 根據權利要求3的試劑盒，其中所述檢測肝癌組織或血液標本中ang2表達水平的試 齊II，包括ang2特異抗體。
5. 抑制ang2表達的試劑在制備治療ECTC血管類型肝癌的藥物中的應用。
6. 根據權利要求5的應用，其中所述抑制ang2表達的試劑包括抗ang2抗體、siRNA和 / 或 sh RNA。
7. 根據權利要求6的應用，其中所述siRNA為si-ang2,其RNA序列從5'端到3'端為： 5' -GATGATAGAAATAGGGACAAAdTdT-3'。
8. 根據權利要求6的應用，其中所述sh RNA為sh-mAng2,其引物序列如下， shmAng2#l 正向引物：5' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA-3'，反向引物：5' -CATCTC GAGGCGGCCGCCCGGGCTATCCGTAAAGAAGAGCAACTCGAGTTGCTCTTCTTTACGGATAGCTTTTTGGAATTCCG CGTCCTTTCCACAAG-3' ； shmAng2#2 正向引物：5 ' -CATGGATCCTCGGGCAGGAAGAGGGCCTA3 '，反向引物：5 ' -CATCTCG AGGCGGCCGCCCGGCGTGCTTAAGATCCAGCTGAACTCGAGTTCAGCTGGATCTTAAGCACGTTTTTGGAATTCCGC GTCCTTTCCACAAG-3'。
【文檔編號】A61K39/395GK104062432SQ201310095817
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年3月22日 優先權日:2013年3月22日
【發明者】莊詩美, 方堅鴻, 周慧超, 鄭利民, 許靜, 丁童 申請人:中山大學