專利名稱：中藥組合物及其在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用的制作方法
中藥組合物及其在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用技術領域
本發明屬于藥物領域，尤其涉及一種中藥組合物及其在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用，具體是能夠增強仔豬偽狂犬病疫苗免疫效力的中藥復方注射液。
背景技術：
豬偽狂犬病是危害全球養豬業最嚴重的傳染病之一。偽狂犬病毒又稱Aujeszky病毒，主要侵害豬的神經系統，容易引起并發癥乃至豬的死亡。偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科皰疹病毒I型，雙股DNA病毒，可引起種豬繁殖障礙。新生仔豬感染該病毒后死亡率較高，有時可達100%。成年豬呈隱性感染，可導致豬群處于免疫抑制狀態。鑒于偽狂犬病對養豬業的危害如此嚴重又無有效的抗病毒藥物進行治療，只有采取防重于治的方法。
疫苗免疫效果受多方面因素影響，如疫苗本身差異、個體的差異、母源抗體水平的影響、接種方法等。有些豬場免疫采用基因缺失疫苗，這類疫苗免疫原性較低，因此需要一種有效的佐劑能激活潛在的免疫反應。佐劑是一種潛在的免疫調節劑，尤其中藥類免疫增強劑，因其具有資源豐富、毒性小、功能廣等特點，成為近年來研究的熱點。發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種毒性小、免疫作用好的中藥組合物及其在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用。
為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案:中藥組合物，含有天門冬多糖和三七皂苷。
上述中藥組合物，天門冬多糖和三七皂苷各占組合物總重的70 90%和10 30%。
上述中藥組合物在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用。
上述仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑為中藥復方注射液。
上述中藥復方注射液由每100克的中藥組合物用1500 2500mL注射用水溶解制成。
上述中藥復方注射液還含有注射液總重0.5 1%的吐溫-80。
上述中藥復方注射液按以下方法制備:
〈1> 配制
按配方重量稱取天門冬多糖和田七皂苷混合均勻，加注射用水并超聲溶解，注射用水加至接近配方注射用水量時，加入配方重量的吐溫-80，調節pH值至5.5 7.0，再用注射用水稀釋至配方注射用水量；
〈2>過濾、分裝
用0.65 μ m的濾膜進行過濾，灌裝入2mL安瓿瓶，封口，100°C滅菌30min，即得。
天門冬多糖采用堿提醇沉法提取，冷凍干燥后密封保存備用；田七皂苷采用95%乙醇提取，冷凍干燥后密封保存備用。
針對目前偽狂犬病對養豬業危害嚴重的現狀，發明人采用中草藥有效成分天門冬多糖和田七皂苷，經合理配比獲得了本發明的中藥組合物，具體方析如下:天門冬多糖具有抗菌抗炎、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、調節免疫力等藥理作用，同時天門冬多糖還具有殺滅蚊蠅幼蟲軟體動物的作用和降血糖的作用；田七皂苷對中樞神經系統具有鎮靜、鎮痛、益智作用，對心血管系統具有保護心肌、抗心律失常、降血脂，防止動脈粥樣硬化，對腦血管系統可改善腦血循環，對實驗性腦缺血具有保護作用，對血液和造血系統可對抗血栓的形成，促進造血細胞的生長，在對免疫系統上可起到抗炎、抗菌、增強免疫力的作用，同時田七皂苷還具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等功效。
注射偽狂犬疫苗后第I天起，復方注射液按0.0625 0.25mL/kg肌肉注射，I天I次，連用3天。實驗證明，本發明的中藥組合物和中藥復方注射液能夠增強仔豬偽狂犬疫苗免疫效力，具有資源豐富、毒性小、效果好的優點。
具體實施方式
實施例1中藥復方注射液的制備
<1> 配制
按配方重量稱取檢驗合格的天門冬多糖45g和田七皂苷5g混合均勻，加注射用水并超聲溶解，注射用水加至接近配方注射用水量900ml時，加入IOml吐溫-80，調節pH值至6.8，再用注射用水稀釋至配方注射用水量IOOOml ；
〈2>過濾、分裝
用0.65 μ m的濾膜進行過濾，灌裝入2mL安瓿瓶，封口，100°C滅菌30min，滅菌后經燈檢,記錄燈檢結果。
實施例2中藥復方注射液的制備
制備基本同實施例1，天門冬多糖40g和田七皂苷10g，配方注射用水量1000ml，7.5ml 吐溫-80，pH 值 5.5。
實施例3中藥復方注射液的制備
制備基本同實施例1，天門冬多糖35g和田七皂苷15g，配方注射用水量1000ml，5ml 吐溫-80，pH 值 6.0。
上述實施例中天門冬多糖和田七皂苷分別按以下方法制備。
天門冬多糖采用堿提醇沉法提取，具體如下:取烘干至恒重的天門冬，按照1:6 15的比例加5 50%的乙醇溶液(PH=7 13)，浸泡0.5 2.5h，浸泡末再調節pH —次到7 13，于60 100°C水浴提取0.5 2.5h，四層紗布過濾，殘渣用pH為7 13的溶液浸泡后同上再處理一次，合并濾液病濃縮至1/4。濃縮液放置室溫冷卻。緩慢加入5倍量的95%的乙醇進行醇沉，邊加邊攪拌，室溫靜置過夜12h以上，隨后棄掉上清液，加入5倍量的蒸餾水溶解沉淀，3000r/min離心十分鐘，收集上清，再加入5倍量95%乙醇進行醇沉，室溫放置過夜。靜置過夜后，3000r/min離心IOmin,棄上清,加入適量的95%乙醇攪拌離心同前，再棄上清，加入無水乙醇攪拌，再離心，最后收集沉淀，冷凍干燥后既得天門冬多糖。
田七皂苷采用95%乙醇提取法 提取，具體如下:稱取50g田七粗粉置于圓底燒瓶中，加入95%乙醇500ml，浸泡0.5h后，90°C水浴回流提取2h，過濾，將濾渣重倒回圓底燒瓶中，再加入95%乙醇400ml,回流提取1.5h,合并兩次濾液。3000r/min離心30min,取上層清液用旋轉蒸發儀回收乙醇，剩余少量液體時，加蒸餾水定容至150ml。上述醇提取物150ml倒入分液漏斗中，然后用正丁醇進行液液萃取4次，正丁醇的用量依次為150ml、130ml、100ml、70ml，取正丁醇層合并，真空濃縮，90°C回收溶劑，得正丁醇提取物，溶于少量95%乙醇中，然后滴加入攪拌中的大量乙醚，待沉淀完全析出為止，過濾，將沉淀90°C水浴烘干或冷凍干燥器烘干備用。
本發明中藥復方注射液對仔豬偽狂犬疫苗免疫效力的研究
以下實驗使用的實施例1制得的中藥復方注射液。
1.方法
1.1動物分組及處理
從42日齡 56日齡的杜洛克X長白X大約克三元雜交豬中篩選40頭豬，用豬偽狂犬野毒抗體檢測試劑盒檢測母源抗體，至母源抗體下降到臨界線下或檢測不出抗體，并檢測豬野毒抗體。選擇30頭，隨機分為6組，每組5頭，1、I1、111組分別為豬偽狂犬疫苗+中藥復方注射液(高:0.25mL/kg、中:0.125mL/kg、低:0.0625mL/kg)三個劑量組，IV組為豬偽狂犬疫苗+陽性藥物對照組(瘟毒清)，V組為疫苗對照組，VI組為空白對照組。I V組，第I天頸部肌內注射豬偽狂犬病活疫苗2mL。I組:第I天開始，復方注射液按0.25mL/kg肌內注射，I次/d，連用3d。II組 第I天開始，復方注射液按0.125mL/kg肌內注射，I次/d,連用3d。III組:第I天開始，復方注射液按0.0625mL/kg肌內注射，I次/d,連用3d。IV組:第I天開始，鹽酸左旋咪唑+黃芪多糖可溶性粉0.4g/L飲水，I次/d，連用3天。V組:疫苗對照組，不用藥。VI空白對照組，不免疫、不用藥。
1.2飼養條件、用藥觀察與日常管理
實驗在同一棟豬舍進行，豬舍為半敞開式，平養，定時采食，自由飲水，飼料為豬場購買的全價料。實驗期間，每周對豬舍進行二次常規消毒，仔細觀察豬只健康狀況，對試驗期間感染疾病的病例及時隔離剔除處理，并進行針對性用藥治療，以減少損失。嚴格按照豬場的免疫程序進行免疫。
1.3檢測指標
1.3.1樣本采集
于疫苗接種前(0d)、疫苗接種后的7d、14d、21d、28d對每頭試驗豬前腔靜脈采血10mL，血液樣品于室溫下靜置2小時，然后以2500rpm離心5min，取上層血清，-20°C保存，用于抗體、IL-2測定和血液生化指標分析。
1.3.2利用以下公式計算阻斷率
%INH= (ODm NC-OD Sample) X100/0Dm NC。
試驗滿足ODm NC - ODm PC > 0.6 ；%1nh PC > 60%。
1.3.3偽狂犬抗體的判斷標準
陰性:%INH.<45% ;可疑:45% ( %INH.( 50% ;陽性:%INH.> 50%。
1.3.4豬血液生理生化指標的檢測
總蛋白(TPR)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)溶菌酶等指標分析。
1.3.5 體重
稱量試驗前和接種疫苗后28d的體重，計算增重和飼料消耗量。
1.3.6數據處理
數據以MeaniSD表示，用SPSS18.0軟件進行單因子方差分析。顯著性用P值表示，其中P < 0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。
2.結果
2.1豬群偽狂犬野毒抗體的檢測結果
40份樣本送廣西獸醫研究所檢驗，均不含野毒抗體。
2.2中藥復方注射液對豬偽狂犬抗體的影響(見表I)
復方高劑量組和復方低劑量組配合疫苗注射7天后，抗體水平呈下降趨勢，到21天時抗體水平逐漸上升。陽性藥物配合疫苗免疫7天后，抗體水平呈下降趨勢，到14天時抗體水平逐漸上升，然后逐漸下降。復方中劑量組抗體水平一直保持穩定。空白對照組、疫苗對照組抗體水平一直呈現下降的趨勢。
表1中藥復方注射液對豬偽狂犬抗體的影響(％INH)
權利要求
1.一種中藥組合物，其特征在于含有天門冬多糖和三七皂苷。
2.根據權利要求1所述的中藥組合物，其特征在于:所述天門冬多糖和三七皂苷各占組合物總重的70 90%和10 30%。
3.根據權利要求1或2所述中藥組合物在制備仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑方面的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于:所述仔豬偽狂犬病疫苗免疫增強劑為中藥復方注射液。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于:所述中藥復方注射液由每100克的中藥組合物用1500 2500mL注射用水溶解制成。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:所述中藥復方注射液還含有注射液總重0.5 1%的吐溫-80。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于所述中藥復方注射液按以下方法制備: 〈1>配制 按配方重量稱取天門冬多糖和田七皂苷混合均勻，加注射用水并超聲溶解，注射用水加至接近配方注射用水量時，加入配方重量的吐溫-80，調節pH值至5.5 7.0，再用注射用水稀釋至配方注射用水量； <2>過濾、分裝 用0.65 μ m的濾膜進行過濾，灌裝入2mL安瓿瓶，封口，100°C滅菌30min，即得。
8.根據權利要求7所 述的應用，其特征在于:所述天門冬多糖采用堿提醇沉法提取，冷凍干燥后密封保存備用；所述田七皂苷采用95%乙醇提取，冷凍干燥后密封保存備用。
全文摘要
本發明公開了一種中藥組合物，由中草藥有效成分天門冬多糖和田七皂苷經合理配比獲得。本發明的中藥組合物及其中藥復方注射液能夠增強仔豬偽狂犬疫苗免疫效力，具有資源豐富、毒性小、效果好的優點，在應對養豬業面臨的偽狂犬病方面有廣闊應用前景。
文檔編號A61K31/704GK103143012SQ20131009825
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月26日 優先權日2013年3月26日
發明者胡庭俊, 潘貴珍, 曾蕓, 韋現色, 尹丹, 施君 申請人:廣西大學