一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法

一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種防治皮膚瘢痕增生的藥物組合物及其制備方法，其中治療增生性瘢痕中以青蒿琥酯和珍珠水解液為活性成分，然后用于制成的各類復方藥劑。配方中的兩種主要活性成分在治療皮膚瘢痕的機制上具有協同作用，相對于現有技術僅使用青蒿琥酯、珍珠水解液、水蛭素等單方藥劑能夠更為明顯地抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖促進其凋亡；抑制瘢痕組織中膠原蛋白合成；調節瘢痕組織內細胞因子和生長因子的表達和信號傳導，從而對瘢痕的增殖起到抑制作用，對于增生性瘢痕具有良好的治療或預防作用。同時，本發明制成各種醫學上治療和預防皮膚瘢痕增生的外用劑型能夠直接作用于皮膚表面的瘢痕組織，治療效果好、副作用小、生產成本低等特點。
【專利說明】一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法，尤其涉及一種用于防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002]皮膚病理性瘢痕是人類特有的一種病理現象，在臨床上可分為增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕挖瘡(keloid)兩種類型。臨床上主要表現為皮膚表面凹凸不平，顏色潮紅，容易充血，質地堅硬且形狀不規則。常有灼痛和瘙癢感。光鏡下表現為從病理學角度看，病理性瘢痕的特征為大量成纖維細胞增生，膠原纖維在表皮下相當于真皮部位的大量沉積，細胞外基質中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過度沉積、膠原纖維增厚，排列不規則常呈旋渦形或纏繞成繩索狀。最終給患者造成畸形、功能障礙、影響美觀或奇癢等嚴重后果，而且燒傷及創傷后瘢痕的發生率也在不斷增長。
[0003]皮膚病理性瘢痕一直是比較棘手的臨床病癥之一。皮膚作為人體最大的器官，具有保護和防御、調節體溫、分泌和排泄、吸收、感覺、代謝及參與免疫等功能，承擔著機體第一道屏障的作用。當外傷等各種因素導致其完整性遭受破壞，甚而累及真皮層時，作為創傷修復產物的瘢痕形成了。這種創傷修復和瘢痕形成與許多細胞的功能活動有關，其中，以成纖維細胞為主的修復細胞被認為是創傷愈合與瘢痕形成過程的決定性因素。
[0004]當前，市面上的中藥類外用防治皮膚瘢痕藥物多而雜，且作用也是多靶點、多環節、多層次，因而對于治療瘢痕的作用機理研究尚不夠深入，也有很大難度，且多為硅酮類制劑，雖然有一定的治 療效果，但可能帶來導致皮疹、瘙癢等副作用，甚至見到使用后導致黑變病的病例報道。其他一些如放射治療、中藥制劑產品或配方療效沒有經過嚴格的實驗檢測實驗、藥理機制不明、毒副作用較大、治療效果不明顯。因而對于治療瘢痕的作用機理研究尚不夠深入，也有很大難度。
[0005]此外，現有技術的研究多集中在單味藥物或是其提取物對瘢痕成纖維細胞的增殖、膠原合成等方面的作用，而對細胞間質、各類細胞因子和介質、細胞內信號轉導等的影響和作用則報道很少，研究水平也停留在生化、細胞水平，較深層次的分子、基因水平的研究基本尚未開展，具體作用機理未能闡明清楚，藥效和影響均有待于進一步探索，而且其治療皮膚瘢痕的效果也并不盡如人意。

【發明內容】

[0006]本發明要解決的技術問題是提供一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物及其制備方法，以青蒿素衍生物一青蒿琥酯和珍珠水解液按照一定質量比的組分加入醫學上的輔料，克服了現有技術中存在的上述缺點和不足，比單一藥物對于瘢痕的防治效果更好，而且無明顯毒副作用，解決了人們一直渴望解決但始終未能獲得成功的技術難題。
[0007]本發明是通過以下技術方案實現:
所述藥物組合物以100g計，由下列成分組成:(1)青蒿琥酯0.48~1.92g;
(2)珍珠水解液0.3^6.0g，其中珍珠水解液的質控標準為:鈣濃度:30~80mg/ml，蛋白濃度:1.5 ~3mg/ml,含氮量:0.3 ~0.5 mg/ml。
[0008]進一步的:該組合物中還包括常規藥劑輔料。
[0009]本發明以100克該組合物計，優選下列成分:
(1)青 蒿琥酯0.48~1.92g;
(2)珍珠水解液0.3^6.0g，其中珍珠水解液的質控標準應在下列范圍內:鈣濃度:30~80mg/ml,蛋白濃度:1.5 ~3mg/ml,含氮量:0.3 ~0.5 mg/ml ；
(3)其余為常規藥劑輔料。
[0010]制備該組合物的方法，所述步驟如下:
步驟①基質按常規方法制成藥劑輔料基質。
[0011]步驟②制備青蒿琥酯含藥培養液:將青蒿琥酯用質量百分比為5%的NaHCO3溶液溶解，稀釋成藥液備用。
[0012]步驟③在藥劑輔料基質中加入青蒿琥酯藥液和珍珠水解液這兩種活性成分，同時均勻攪拌獲得，按照上述的方法制備基質與活性成分混合后制成液體制劑或固體制劑。
[0013]本發明使用的青蒿琥酯、重量百分比為濃度5%的NaHCO3溶液(廣西南藥集團桂林制藥廠生產)、珍珠水解液(北海寶珠林珍珠保健品有限公司)生產，其質控標準為:鈣濃度:30 ~80mg/ml,蛋白濃度:1.5 ~3mg/ml,含氮量:0.3 ~0.5 mg/ml)。
[0014]本發明可以根據不同需要制成膏劑、膠劑、水劑、油劑或面膜或醫學上所用的外用劑型。
[0015]制成各種劑型的輔料:
膏劑:包括白凡士林(基質)，十八醇(基質)，單硬脂酸甘油酯(基質)，十二烷硫酸鈉(乳化劑)，甘油(保濕劑)，對羥基苯甲酸乙酯(防腐劑)，蒸餾水。
[0016]水劑:包括月桂氮卓酮(溶劑)，乙醇(溶劑)。
[0017]油劑:包括硬脂酸(基質)，單硬脂酸甘油酯(基質)，蜂蠟(基質)，白凡士林(基質)，地蠟(基質)，雙硬脂酸鋁(乳化劑)，氫氧化鈣(乳化劑)，液狀石蠟(防腐劑)，羥苯乙酯(防腐劑)，蒸餾水。
[0018]膠劑:包括羧甲基纖維素鈉，甘油，穩定劑，防腐劑，蒸餾水。
面膜:包括高分子膠，水，酒精。
[0019]本發明具備以下的效果和優點:
1.療效好、不良影響小。
[0020]2.成本低，配方簡單，可配置成多種外用型復方劑型。
[0021]3.有較強的協同和增效作用，較單一的硅酮類藥物、水蛭素、青蒿琥酯防治皮膚瘢痕的效果更為明顯。
[0022]4.根據實驗結果可以看出，該藥物組合物以100g計，在活性成分青蒿琥酯0.96g，珍珠水解液3g的條件下，既能夠有效防止皮膚瘢痕產生，并達到最佳療效，毒副作用也小，以此作為復方藥劑，解決了長期以來人們渴望解決的技術難題。
[0023]長期以來人們主要通過青蒿素及其衍生物結合輔料等進行皮膚瘢痕的治療，效果并不比單獨采用青蒿素及其衍生物的治療效果要好，而本發明采用的技術方案，能夠較單獨采用青蒿素及其衍生物、珍珠水解液的技術方案要達到更為顯著的治療效果，因此不僅克服了技術偏見，還解決了長期以來人們渴望解決的技術難題，在治療皮膚瘢痕上取得了顯著的技術進步。
[0024]本發明藥物組合物的協同作用和增效作用可以通過以下實驗室藥效研究和實驗研究報告來說明。
[0025]一、藥物作用機理研究
本發明的藥理機制是，采用青蒿素(英文名=Arteannuin)衍生物——青蒿琥酯(拉丁文名:Artesunatum)、珍珠水解液兩種藥物作為防治皮膚瘢痕的外用藥物組合物，青蒿素于1998年前后在治療增生性瘢痕的療效上已經有所報道，其衍生物青蒿琥酯同時，具有治療皮膚瘢痕、抗皮膚組織纖維化等藥物作用。
[0026]本發明采用青蒿素(英文名=Arteannuin)衍生物——青蒿琥酯(拉丁文名:Artesunatum)、珍珠水解液兩種藥物作為防治皮膚瘢痕的外用藥物組合物。
[0027]20世紀70年代，我國學者從中藥黃花蒿中分離出有效單體成分青蒿素。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，化學名為二氫青蒿素-ΙΟ-α - 丁二酸單酯，分子式為C19H28O8,分子量為384.43。
[0028]青蒿琥酯最初作為抗瘧疾藥物被研究開發，隨著對青蒿素類藥物藥理作用的研究的不斷深入，科研人員證實了青蒿素類藥物還具有抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲、抗腫瘤等方面的效用。尤其在抗纖維化方面，已經證實青蒿琥酯具有誘導肝、肺成纖維細胞凋亡，抑制增生的作用。但未見公開文獻報告青蒿琥酯能用于治療皮膚瘢痕的內容。
[0029]珍珠，是一味古老而悠久的中醫藥材及營養補品，是珍珠貝類和珠母貝類軟體動物內分泌而生成的含碳酸鈣的礦物珠粒，是由大量微小的礦物晶體集合而成的。珍珠作為藥物治病在我國已有悠久的歷史，早在秦漢時期就被珠民用來治療刀傷出血、疔瘡潰爛、燒傷、燙傷等，內服則可清熱解毒。明代的《本草綱目》中就有記載:“珍珠安神定魄、養顏、點目去翳、塞耳去聾、去腐生肌、催生死胎”，認為珍珠具有鎮心安神、清熱益陰、化痰明目等功效。
[0030]珍珠水解液是珍珠的水解液，主要成分為CaC0391.6%、H2O和有機質各4%、其他成分0.4%，其含有少量蛋白質、多種微量元素、維生素等。本實驗所用的廣西北海合浦珍珠，又被稱為南珠，為自古以來中醫入藥之首選。含有豐富的碳酸鈣、人體必需微量元素、微量有機質等，含全部8種人體必需氨基酸，以及十多種與代謝密切相關的其他氨基酸。
[0031]病理性瘢痕的典型的特征就是瘢痕增厚、攣縮，一種藥物或者復合藥物能否有效防治瘢痕，其簡單可靠的反映指標是:瘢痕厚度、顏色、質地的變化本發明主要采取外用型藥物的形式，其能夠直接作用于人體皮膚表面，經皮膚或粘膜表面吸收后，藥力直達病區，具有藥效維持時間長、簡便易行、毒副作用小、避免口服用藥發生消化道滅活等優點。
[0032]青蒿琥酯聯合珍珠水解液抑制瘢痕組織成纖維細胞的檢測及相關機制原理 所選用的實驗藥劑和儀器:青蒿琥酯(桂林制藥廠生產)、5%的NaHCO3溶液(桂林制藥
廠生產)、 珍珠水解液(北海寶珠林珍珠保健品有限公司生產，鈣濃度56mg/ml，蛋白濃度:
2.45mg/ml,含氮量:0.39 mg/ml)、醫用硅酮凝膠噴霧劑(疤復新，上海上大吉申科技開發有限公司生產)、Smad3鼠抗人單克隆抗體(美國Santa Cruz公司生產)、羊抗鼠抗兔通用型二抗(上海長島公司)生產、TGF-β I鼠抗人單克隆抗體(福州邁新生物技術公司生產)、免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術公司生產)、DAB試劑盒(北京中杉公司生產)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海Generay生物制品公司生產)、蛋白質提取試劑(上海捷瑞生物公司生產)、羊抗兔抗鼠IgG/堿性磷酸酶標記二抗(美國Santa Cruz公司生產)、鼠抗人GAPDH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司生產)、DMR+Q550型病理圖像分析儀(德國Leica公司生產)。
[0033](一)人皮膚瘢痕成纖維細胞的體外原代培養 1.皮膚瘢痕組織來源
人體皮膚瘢痕組織標本供體均來自廣西醫科大學整形外科的患者，全部患者近期沒有使用瘢痕抑制藥物，不伴有腫瘤或其他嚴重疾病。取材前均經患者同意。
[0034]2.原代培養在無菌條件下采取手術切除的皮膚瘢痕組織后立即放入含500U/ml青霉素和500mg/L鏈霉素的培養基中。于4 h內在超凈工作臺內取出標本。標本置于含青霉素100U/ml,鏈霉素100mg/L的D’hanks液中，無菌條件下用手術刀片和剪刀去除表皮和基底層,用D’ hanks液將標本反復洗滌。將清洗干凈的皮膚瘢痕組織剪成3X 3X 2mm大小的組織塊。將組織塊移入50ml培養瓶中，均勻地貼在瓶壁上，間距約1cm。瓶內加入含有15%胎牛血清，青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/L，PH 7.2~7.4的DMEM培養基1.5ml，密閉瓶口。將培養瓶反轉，令組織塊在上，置37°C、含5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養4小時后，將培養瓶翻轉，使培養基浸泡組織塊。2d以后再補加3~5ml培養液，此后3~4d更換一次培養液。待成纖維 細胞長滿瓶底時以0.25%胰蛋白酶消化傳代(I:3)培養。反復傳代去除非成纖維細胞成分后，建立人皮膚瘢痕細胞系。取第3 — 4代的成纖維細胞做檢測。
[0035](二)人皮膚瘢痕成纖維細胞形態學觀察
原代培養和傳代過程中倒置顯微鏡觀察細胞的形態。取3~4代培養的成纖維細胞，消化后將玻片放入細胞懸液中，待細胞貼附在玻片上生長后將玻片取出，稍晾干，用95%的乙醇固定5min進行HE染色，普通光鏡觀察。
[0036](三)人皮膚瘢痕成纖維細胞的培養與鑒定
采用免疫細胞化學SP法，取對數生長期的細胞消化、調整細胞濃度，將處理后的蓋玻片置于培養瓶中，培養24 h后，取出生長細胞后的蓋玻片，用4%多聚甲醛固定，晾干后，PBS沖洗3次,每次5 mirio 0.3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶,用Tritonx-100處理10 min,熱修復8min,自然冷卻,血清封閉15min,加1:200 I抗(鼠抗人波形蛋白抗體)4°C過夜,于第二日拿出室溫下孵育30分鐘，PBS沖洗3次，每次5min，加II抗，經PBS沖洗，加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，PBS沖洗，DAB顯色6min，沖洗，蘇木素核復染，中性樹脂封片，在普通光學顯微鏡觀察。
[0037](四)以碳酸氫鈉溶液、青蒿琥酯、珍珠水解液、青蒿琥酯結合珍珠水解液分組實驗測定各組對人體皮膚瘢痕組織標本的影響
實驗分組為①空白對照組、②1%。碳酸氫鈉溶液組、③青蒿琥酯(240μ g/ml)組、④珍珠水解液(以鈣離子含量為計，10mg/ml)組、⑤青蒿琥酯(120μ g/ml)+珍珠水解液(5mg/ml)組、⑥青蒿琥酯(240 μ g/ml) +珍珠水解液(5mg/ml)組、⑦青蒿琥酯(240 μ g/ml) +珍珠水解液(10mg/ml)組共七組，分別簡稱為 control group, 1%。SB group, Art (240 μ g/ml)group, HPL(lOmg/ml)group, Art(120 μ g/ml)+HPL (5mg/ml)group, Art (240 μ g/ml)+HPL(5mg/ml) group, Art (240 μ g/ ml) +HPL (lOmg/ml) group? 將各組溶液分別作用于第3~5代成纖維細胞24h后，以四唑鹽比色法(MTT)檢測青蒿琥酯聯合珍珠水解液對人皮膚瘢痕成纖維細胞增殖作用的影響；以流式細胞儀檢測細胞凋亡；以實時熒光定量PCR法檢測藥物作用后細胞因子IL-1 β、INF- Y mRNA的表達情況；以Werstern-Blot法檢測藥物作用后細胞因子IFN-Y、IL-1 β蛋白表達。
[0038](五)青蒿素和青蒿琥酯對人皮膚瘢痕成纖維細胞的作用
1.MTT法測定青蒿素對人皮膚瘢痕成纖維細胞的增殖影響作用取前述實驗分離的對數生長期的3 - 5代人皮膚瘢痕成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調為0.5 X 105/ml，分別接種于96孔塑料培養板，密度為0.5 X IO4個/孔，每孔加入100 μ I的細胞懸液和100 μ I的培養基，常規培養24小時后吸棄原培養液。青蒿素用無水乙醇溶解成3.3g/L，再用培養基稀釋為0.206g/L，0.103g/L，0.052g/L,
0.026g/L，0.013g/L 5 種濃度。乙醇的濃度相對應為 6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%。實驗分組:1、青蒿素組:加入已經配置的含青蒿素濃度為0.206g/L，0.103g/L，0.052g/L,
0.026g/L，0.013g/L的培養基200 μ I ;2、乙醇溶劑對照組:加入已經配置的含乙醇濃度為
6.25%, 3.13%, 1.56%, 0.78%, 0.39%的培養基200 μ L.空白對照組:每孔只加200 μ I的培養基。每孔設3個復孔。于37°C，5% CO2飽合濕度繼續培養24小時后，加入20 μ I 5mg/mlMTT搖勻，繼續培養4小時后吸棄上清，加入200 μ I DMSO,振蕩20min，待結晶顆粒溶解后，采用酶標儀于490nm波長下測定吸光度(A)值。記錄結果，計算藥物對皮膚瘢痕成纖維細胞的抑制率。生長抑制率=(I 一用藥組A/對照組A) X 100%。
[0039]2.MTT法測定青蒿琥酯對人皮膚瘢痕成纖維細胞的增殖影響作用 取對數生長期的人皮膚瘢痕成纖維細胞3 — 5代，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，調為I X 105/ml，分別接種于96孔塑料培養板，密度為I X IO4個/孔，每孔加入100 μ I的細胞懸液和100 μ I的培養基，常規培養24小時后吸棄原培養液。將青蒿琥酯鈉(桂林制藥廠生產)用5%NaHC03溶解成24g/L，再用培養液稀釋成30、60、120、240、480mg/L的含藥培養液，碳酸氫鈉在實驗中的最終濃度為1%。。實驗分組:1、青蒿琥酯組:加入已經配置的含青蒿琥酯濃度為30、60、120、240、480mg/L的培養基200 μ I ;2、碳酸氫鈉溶劑對照組:將1%。濃度的碳酸氫鈉的培養液200 μ I加入孔中；3、空白對照組:每孔只加200 μ I的培養基。每孔設3個復孔。于37°C，5%C02飽合濕度繼續培養24小時后，加入20 μ I 5mg/mlMTT搖勻，繼續培養4小時后吸棄上清，加入200 μ I DMSO,振蕩20min，待結晶顆粒溶解后，采用酶標儀于490nm波長下測定吸光度(A)值。記錄結果，計算藥物對皮膚瘢痕成纖維細胞的抑制率。抑制率計算同上。
[0040]3.流式細胞儀檢測細胞凋亡:本實驗用凱基Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，Annexin V作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。將Annexin V進行突光素(FITC)標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡的發生。用碘化丙唳(Propidium 1dide, PI)與Annexin V匹配使用，將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。具體實驗步驟:取對數生長期3 - 5代的成纖維細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，2 X IO5個/孔密度接種于6孔塑料培養板，常規培養I天，待細胞貼壁生長后分別用0.206g/L的青蒿素，240mg/L、120 mg/L的青蒿琥酯作用于細胞，同時設立乙醇溶劑對照組、碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組，繼續培養ld，將培養基吸出后放入離心管，然后用
0.25%胰酶將貼壁的細胞消化后，用PBS洗滌細胞二次(離心1500rpm，5min)收集I~5X IO5細胞待用。吸取500μL的IXBinding Buffer加入細胞中，制備細胞懸液，用上述的懸浮細胞加入2yL Annexin V-FITC混勻后加入5 μ L Propidium 1dide,然后混勻；避光室溫反應5min后上流式細胞儀，用流式細胞儀檢測(Ex=488 nm; Em=530 nm)細胞凋亡的情況。(綠色熒光通過FITC通道通常為FL2來檢測；紅色熒光通過PI通道通常為FLl來檢測)流式細胞儀的激光波長488nm，以同種未經藥物處理的細胞為標準樣品校對儀器，調整儀器使其變異系數穩定在3% — 5%之間。應用Multicycler for Windows分析軟件，以同種未經藥物處理的細胞為對照，進行雙參數分析，可顯示四類不同的細胞，即FITC —/PI—的活細胞、FITC + /PI —的凋亡細胞、FITC + /PI +的繼發壞死細胞、FITC — /PI +的膜受損傷的活細胞。
[0041](六)用藥后細胞形態學觀察
1.選生長良好的細胞，每種細胞均以每孔I X IO5個細胞接種于6孔板中的玻璃片上，分為青蒿琥酯組、青蒿素組、碳酸氫鈉溶劑對照組和空白對照組，共4組。24h后青蒿琥酯組換濃度為240mg/L的含藥培養液，碳酸氫鈉溶劑對照組換濃度為0.1%的碳酸氫鈉培養液，青蒿素組換濃度為0.206g/L的含藥培養液，空白對照組僅加入等量的培養液，24h后直接將玻璃片取出，自然晾干，固定后行HE染色，在顯微鏡下觀察形態學改變。
[0042]2.TUNEL法檢測細胞凋亡和凋亡指數(Al)的計算:將對數生長期的成纖維細胞
3— 5代用0.25%的胰酶消化后，種植在6孔板上，每孔5 X IO4個細胞，常規培養I天，待細胞貼壁生長后用珍珠液和水蛭素IC5tl的濃度作用于成纖維細胞。繼續培養Id后將培養基吸出后放入離心管，然后用0.25%胰酶將貼壁的細胞消化后放入同一離心管，1000轉，5分鐘收集細胞，0.1%多聚賴氨酸處理玻片后，細胞涂片，室溫下自然晾干。晾干后用PBS沖洗2次，40g/L多聚甲醛室溫下固定10 min，PBS沖洗。加入用Tris緩沖鹽溶液(TBS)新鮮稀釋的蛋白酶K(比例為1:100)，37°C下作用lOmin。蒸餾水洗滌，加入含末端脫氧核苷酸轉移酶TdT和地高辛標記的脫氧尿苷5 -三磷酸(dUTP)標記緩沖液20μ 1，37°C下放置2 h。TBS洗滌，加入封閉液50 μ I室溫放置30 min,甩干；加Ant1-DIG_Biotin。加SABC后，采用二氨基聯苯胺(DAB)顯色20 min，蒸餾水洗滌，蘇木素復染，TBS洗滌、脫水、封固。將切片置于200倍光學顯微鏡下觀察，細胞核中有棕色顆粒者為凋亡細胞。用病理圖像分析儀在凋亡細胞密集區于400倍鏡下連續計數5個視野的凋亡細胞及細胞總數，計算平均陽性細胞率即凋亡指數Al。
[0043]收集人皮膚增生性瘢痕，進行原代培養，所得細胞行HE染色及免疫細胞化學抗波形蛋白染色鑒定細胞為本實驗所需成纖維細胞。實驗分組為①空白對照組、②1%。碳酸氫鈉溶液組、③青蒿琥酯(240μ g/ml)組、④珍珠水解液(以鈣離子含量為計，IOmg/ml)組、⑤青蒿琥酯(120μ g/ml) +珍珠水解液(5mg/ml)組、⑥青蒿琥酯(240 μ g/ml) +珍珠水解液(5mg/ml)組、⑦青蒿琥酯(240μ g/ml) +珍珠水解液(10mg/ml)組共七組，分別簡稱為 control group, I %。SB group, Art (240 μ g/ml) group, HPL (lOmg/ml) group,Art (120 μ g/ml) +HPL (5mg/ml) group, Art (240 μ g/ml) +HPL (5mg/ml) group, Art (240 μ g/ml)+HPL(lOmg/ml) group。將各組溶液分別作用于第3~5代成纖維細胞24h后，以四唑鹽比色法(MTT)檢測青蒿琥酯聯合珍珠水解液對人皮膚瘢痕成纖維細胞增殖作用的影響；以流式細胞儀檢測細胞凋亡；以實時熒光定量PCR法檢測藥物作用后細胞因子IL-1 β、INF- Y mRNA的表達情況；以Werstern-Blot法檢測藥物作用后細胞因子IFN- y ,IL-1 β蛋白表達；對同法處理的成纖維細胞設立空白對照組及青蒿琥酯(240 μ g/ml) +珍珠水解液(10mg/ml)組，行透射電鏡檢測，觀察藥物作用后的成纖維細胞超微結構變化。[0044]結果:
1、組織塊培養5~7天可見周圍有細小呈長梭狀貼壁細胞爬出，逐漸長大、伸展，胞體為梭形、不規則形，胞質向外突出二至三個偽足，25~30天可長滿25mm3培養瓶，5~7天傳代一次，經傳代2次后即可獲得較純的成纖維細胞。HE染色后可見細胞長梭形生長，排列不規則，胞核大，色藍，位于細胞中央；胞漿豐富、色淡紫。抗波形蛋白抗體染色標本，所有細胞胞漿均呈棕色著色。抗角蛋白抗體染色，所有細胞胞漿、胞核均呈藍染，胞漿未見棕黃色著色(見圖1)。
[0045]2、經MTT法檢測，各濃度青蒿琥酯聯合珍珠水解液作用后，均能抑制成纖維細胞增殖，與空白對照組比較，有統計學差異防);各濃度組間行兩兩比較，/05,差異無統計學意義(見表1、圖2)。
[0046]表1青蒿琥酯聯合珍珠水解液對成纖維細胞存活的影響±.5)
【權利要求】
1.一種防治皮膚瘢痕的藥物組合物，其特征在于以100g該組合物計，包括下列成分: (1)青蒿琥酯0.48g~1.92g ； (2)珍珠水解液0.3g~6g,其中所用珍珠水解液的質控標準丐濃度:30~80mg/ml,蛋白濃度:1.5~3mg/ml,含氮量:0.3~0.5 mg/ml。
2.根據權利要求1所述的防治皮膚瘢痕的藥物組合物，其特征在于:該組合物中還包括常規藥劑輔料。
3.根據權利要求1所述的防治皮膚瘢痕的藥物組合物，其特征在于:以100g該組合物計，由下列成分組成: (1)青蒿琥酯0.48g~1.92g ； (2)珍珠水解液0.3g~6g,其中所用珍珠水解液的質控標準丐濃度30~80mg/ml,蛋白濃度:1.5~3mg/ml,含氮量:0.3~0.5 mg/ml ； (3)其余為常規藥劑輔料。
4.根據權利要求1所述的防治皮膚瘢痕的藥物組合物，其特征在于:以100g該組合物計，由下列成分組成: (1)青蒿琥酯1.28g; (2)珍珠水解液3g，其 中所用珍珠水解液的質控標準:鈣濃度56mg/ml，蛋白濃度:2.45mg/ml,含氮量:0.39 mg/ml ； (3)其余為常規藥劑輔料。
5.根據權利要求1至4任意一項權利要求所述的防治皮膚瘢痕的藥物組合物，其特征在于，所述的制備方法步驟如下: 步驟①基質按常規方法制成藥劑輔料基質； 步驟②制備青蒿琥酯含藥培養液:將青蒿琥酯用重量含量5%的NaHCO3溶液解配成備用溶液； 步驟③在藥劑輔料基質中加入青蒿琥酯預混藥液和珍珠水解液這兩種活性成分，同時均勻混合獲得，按照上述的方法制備基質與活性成分均勻混合后制成液體制劑或固體制劑。
6.根據權利要求5所述的防治皮膚瘢痕的藥物組合物的制備方法，其特征在于:所述液體制劑和固體制劑包括膏劑、膠劑、水劑、油劑或面膜。
【文檔編號】A61P17/02GK103961376SQ201310233045
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年6月13日 優先權日:2013年6月13日
【發明者】農曉琳 申請人:廣西醫科大學