一種a型口蹄疫ctl表位肽及篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種A型口蹄疫CTL表位肽及其篩選方法。所述CTL表位肽是由九個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr-Tyr-Tyr。該表位肽能夠與來源于不同品系豬的SLA---蛋白有較強的結合能力并能夠引起細胞毒性免疫應答，適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應用范圍廣。本發明利用構建的六品系豬SLA-I單鏈分子在體外結合口蹄疫病毒的CTL模擬表位肽，質譜測定篩選能夠與復合體結合的多肽，并經過ELISPOT檢測，確定能夠誘導產生T細胞免疫應答能力的模擬表位肽。本發明為今后大量篩選和鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫多表位疫苗奠定了基礎。
【專利說明】一種A型口蹄疫CTL表位肽及篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子免疫學領域，具體涉及SLA-1結合并能夠引起細胞毒性免疫應答的A型口蹄疫CTL表位肽以及利用SLA-1復合體篩選和鑒定所述CTL表位肽的方法。
【背景技術】
[0002]豬主要組織相容性復合體(majorhistocompatibility complex, MHC),亦即豬的白細胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA),是豬重要的免疫應答分子。SLA共分為三類，分別為SLA-1、SLA-1I, SLA-1II。其中SLA-1類分子包括重鏈和輕鏈，重鏈具有多態性，功能基因主要為SLA-1, -2, -3ο而輕鏈由Beta 2微球蛋白(Beta 2 microglobulin,β2πι)基因編碼。在細胞內質網，SLA-1重鏈、抗原多肽與輕鏈以非共價鍵結合，形成SLA-1-p印tides復合物，經高爾基體加工后，遞呈到細胞表面，與⑶8+ T淋巴細胞受體結合，引起細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)免疫應答，CTL釋放細胞因子并殺死被病毒感染的靶細胞。能夠與SLA-1類分子結合并能引起細胞毒性免疫應答的多肽即為CTL表位。
[0003]口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是危害偶蹄類動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病的病原，血清型分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial型，各型之間無交互免疫力。由于口蹄疫病毒的流行株不斷變異，傳統的疫苗已經不能適應口蹄疫防治的要求。含有多種血清型和不同流行株的表位疫苗可以起到防治不同血清型口蹄疫病毒的要求。研制口蹄疫病毒表位疫苗的關鍵是確定表位，細胞表位包括B細胞表位、輔助性T細胞(T helper, Th)表位和CTL表位。目前，多個B細胞表位和Th表位已經報道。口蹄疫屬于嚴格的細胞內寄生物，體液免疫固然重要，但細胞免疫必不可少。近來的研究表明，在FMDV急性發作期的控制主要是由中和抗體發揮作用，而在FMDV持續性感染期的免疫方面則主要由CTL發揮作用。最近，一些學者開始研究口蹄疫病毒的CTL表位。2006年，Barfoed (Antiviral Res, 2006, 72 (3): 178-89)等證實了一個小鼠 H_2Kd 限制性的來源于口蹄疫病毒非結構蛋白2C的CTL表位KYKEAKEWL，能夠在小鼠體內引起CTL反應。另外，Guzman 等(J Gen Virol, 2008, 89 (Pt 3): 667-75)最近也證實了一個牛 BoLA N*02201 限制性的口蹄疫病毒CTL表位，該表位位于O型口蹄疫UKG/2001株結構蛋白的795- 803氨基酸殘基，該表位能夠引起靶細胞殺傷效應。然而，到目前為止，所有報道的口蹄疫病毒CTL表位都是通過小鼠、牛等動物加以驗證，至今還未報道經豬SLA-1類分子直接遞呈的口蹄疫病毒CTL表位。
[0004]研究表明，利用體外構建MHC I重鏈分子、肽及輕鏈復合體的方法可以在體外篩選病毒表位。White 等(J Immunol, 1999，162 (5): 2671-6)用一個 Linker 將小鼠 MHC-1 的重鏈和輕鏈連接，構建了 MHC-1分子，并證明了它可以和抗原肽分子特異結合。Denberg等(Eur J Immunol, 2000, 30 (12): 3522-32)用一個多肽、Linker、重鏈及輕鏈 β 2m 構建了人的HLA-A2單鏈分子，并證明構建的結合多肽的單鏈分子具有識別細胞受體的功能。在課題組前期研究中，已經構建了六品系豬SLA-1復合體蛋白，并且在pMAL-p2X進行了表達，經檢測表達蛋白為可溶性蛋白，并保持良好的蛋白構象。本發明在前期研究的基礎上，利用構建的六品系豬SLA-1單鏈分子在體外結合口蹄疫病毒的CTL模擬表位肽，質譜測定篩選能夠與復合體結合的多肽。可結合的多肽經過ELISPOT實驗檢測多肽的CTL活性。本發明為今后大量篩選口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫病毒多表位疫苗奠定基礎。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種能夠與SLA---分子結合并能夠引起細胞毒性免疫應答的A型口蹄疫CTL表位肽。
[0006]為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案為一種A型口蹄疫CTL表位肽，所述A型口蹄疫CTL表位肽命名為QA4，其由九個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為:Ala-Met-Leu-Arg-Ala-Ala-Thr- Tyr-Tyr (SEQ ID No:1),即丙氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸_精氨酸_丙氨酸_丙氨酸_蘇氨酸_酪氨酸_酪氨酸。 [0007]所述A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)來源于A型口蹄疫病毒VPl蛋白，其與來源于不同品系豬的SLA---蛋白均有較強的結合能力，且能誘導豬PBMC極顯著釋放IFN- Y。
[0008]本發明所述A型口蹄疫CTL表位肽(QA4 )應用于口蹄疫多肽疫苗的制備。
[0009]如上所述的A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)的篩選方法，其包括如下步驟:
(O 利用生物學信息軟件 netMHCpan2.4(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，輸入口蹄疫病毒VPl蛋白序列，選擇九肽，在SLA基因下預測得到能與SLA---蛋白結合，并提呈到細胞表面引起細胞毒性免疫應答的CTL模擬表位肽，以人工化學法合成上述預測得到的CTL模擬表位肽；
(2)將步驟(1)得到的CTL模擬表位肽和SLA---蛋白的體外結合反應，反應混合物經C-18柱除鹽、精制、冷凍干燥后得到固體粉末狀SLA----多肽復合物；
(3)SLA----多肽復合物經質譜測定篩選能與SLA---結合的CTL模擬表位肽；
(4)以能與SLA---蛋白結合的CTL模擬表位肽為抗原，以分離得到的口蹄疫感染的豬脾臟淋巴細胞為待測細胞，進行ELISPOT檢測，確定能夠誘導產生T細胞免疫應答能力的模擬表位肽。
[0010]上述CTL表位肽的篩選和鑒定方法中，步驟(1)所述CTL模擬表位肽的氨基酸序列優選為SEQ ID No:1~4。
[0011]上述CTL表位肽的篩選方法中，步驟(1)所述口蹄疫病毒VPl蛋白序列可以來源于不同血清型的口蹄疫病毒，其血清型可以為O、A、C、SATU SAT2、SAT3和Asial型等。
[0012]上述CTL表位肽的篩選方法中，所述SLA---蛋白來源于長白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺豬或萊蕪黑豬中的一種或多種。
[0013]利用質譜法測定SLA-1單鏈分子與多肽的結合，可以非常精確的篩選出能夠與SLA-1分子結合的多肽，特異性高。本發明的 申請人:通過前期研究已經構建巴馬小型豬SLA-1單鏈分子，并進行了體外結合篩選口蹄疫病毒多肽，從而證明了該方法的科學性。然而，由于SLA-1類分子存在限制性，來源于不同品系豬的SLA-1可能結合不同的多肽。另外，由于SLA-1類分子限制性的多肽表位可能具有共同錨定殘基，不同品系豬SLA-1也可能會結合共同的多肽表位。如果能分離和篩選共同適應于多種品系豬SLA-1的多肽，則會有助于研制具有防治效果的口蹄疫病毒多表位疫苗。本發明通過上述方法篩選和鑒定出與來源于大約克豬、荷包豬、煙臺豬或萊蕪黑豬的SLA---蛋白均具有良好的結合能力，并能夠誘導豬PBMC顯著釋放IFN- Y的CTL表位肽(QA4)。本發明的CTL表位肽適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應用范圍廣。
[0014]本發明的有益效果:①本發明的A型口蹄疫CTL表位肽(QA4)與來源于不同品系豬的SLA---蛋白均有較強的結合能力并能夠引起細胞毒性免疫應答，適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應用范圍廣。②本發明為今后大量篩選和鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫多表位疫苗奠定了基礎。③本發明的表位多肽也可用于今后與SLA-1蛋白進行體外結晶研究等，有利于研究防治口蹄疫中的分子、細胞作用機制。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為經Amylose親和層析得到的融合蛋白SLA-1-MBP的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標準品，1-6，分別代表長白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺黑和萊蕪黑豬SLA-1-MBP純化蛋白；
圖2為Factor Xa切割后的SLA-1-MBP的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標準品，1-6，分別代表長白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺黑和萊蕪黑豬SLA-1切割后的蛋白，其中SLA-1蛋白大小為41.6kDa，融合蛋白的大小為84.1 kDa ；
圖3為DEAE-葡聚糖凝膠陰離子交換柱純化后的SLA-1的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標準品，1-6，分別代表長白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺黑和萊蕪黑豬SLA-1純化蛋白；
圖4為Q02與六品系豬SLA-1的體外結合質譜測定結果；
圖5為AS3與六品系豬SLA-1的體外結合質譜測定結果；
圖6為QA4與與六品系豬SLA-1的體外結合質譜測定結果；
在所述圖4~圖6中，所述A、B、C、D、E和F分別表示，相應多肽與長白豬SLA-1體外結合質譜測定結果、大約克豬SLA-1體外結合質譜測定結果、托佩克豬SLA-1體外結合質譜測定結果、煙臺黑豬SLA-1體外結合質譜測定結果和萊蕪黑豬SLA-1體外結合質譜測定結果;
圖7為ELISPOT檢測多肽誘導CD8+T淋巴細胞產生IFN- Y能力，其中:**代表待測多肽與對照肽相比較差異極顯著(P < 0.01)。
[0016]【具體實施方式】
下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
[0017]實施例1六個品系豬SAL-1蛋白的準備
(I)六個品系豬SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌的準備
六個品系豬SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌，均為大連大學生命科學與技術學院分子免疫學實驗室構建保存。所述六個品系豬包括長白、大約克、托佩克、荷包、煙臺和萊蕪黑豬。所述SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌由高鳳山等(Gene, 2012, 502 (2): 147-153)中所述的方法獲得。[0018](2)誘導表達SLA-1重組大腸桿菌
分別取六個品系豬的SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌菌液5mL接種至500mL LB培養基，在170rpm的37度溫箱中振蕩培養，隔一段時間檢測其0D_，待生長至OD6tltl介于0.6至
0.8之間時，加入IPTG至0.5mmol/L, 37度誘導5小時。
[0019](3)融合蛋白MBP-SLA-1親和純化
將在上述(2)中用IPTG誘導培養5小時的菌體，3000r/min、離心lOmin，棄上清，加入 50mL 過柱緩沖液 A[20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4),200 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA(pH8.0), I mmol/L疊氮鈉，I mmol/L DTT]重懸菌體。菌體經超聲破碎lOmin,90W,破碎5min停5min。菌體超聲后4000r/min,離心lOmin,棄沉淀,取上清液。上清液中含有可溶性的融合蛋白SLA-1-MBP，利用麥芽糖結合蛋白(MBP)與柱子中特異性配體結合的性質，進行Amylose親和層析,融合蛋白SLA-1-MBP被吸附到Amylose柱子上,用12倍柱體積的上述過柱緩沖液A洗脫除掉未結合雜蛋白后，再利用麥芽糖可以與MBP優勢結合的性質，用3倍柱體積含有10 mmol/L麥芽糖的洗脫緩沖液(過柱緩沖液A + 10mmol/L麥芽糖)洗脫目的蛋白，洗脫后的液體進行濃縮，得到可溶性的SLA-1-MBP蛋白濃縮液。SLA-1-MBP蛋白濃縮液用SDS-PAGE電泳，檢驗目的蛋白的條帶大小和純度。結果見圖1。圖1結果顯示，六品系豬SLA-1-MBP純度約85%，大小為84.lkDa，符合預期SLA-1-MBP蛋白大小。
[0020](4 )融合蛋白切除MBP、分離純化 由于MBP本身分子量較大，可能會干擾到目的蛋白分子與抗原肽的特異性結合，故需要將融合蛋白中的MBP切除。pMAL-p2X載體上在malE基因和多克隆位點之間，有一個被Xa因子識別的氨基酸序列，Ile-Glu-Gly-Arg，可以切除MBP。
[0021]具體切除方法為:
將步驟(3)得到的MBP-SLA-1融合蛋白用Factor Xa切割，切割條件為:lmol/L NaCl100 μ L, 100 mmoL/L CaCl2 20 μ L, lmol/L Tris-HCl 20 μ L，步驟(3)得到的 SLA-1-MBP蛋白濃縮液 400 μ L (約 I mg SLA-1-MBP 蛋白)，Factor Xa (I U 酶切割 50 mg) 20 U，加滅菌去離子水至I mL。21°C切割20 h，切割后進行SDS-PAGE檢測融合蛋白切割情況，結果見圖2。圖2結果顯示，在43kDa處，六個品系豬SLA-1-MBP均切割出一條約41kDa條帶，與目的蛋白SLA-1大小41.6kDa 一致。
[0022]切割后的蛋白混合物首先經過Amylose柱純化，收集過柱緩沖液A洗脫的蛋白樣品。收集得到的蛋白樣品再經過DEAE Ceramic HyperD F陰離子交換柱分離純化蛋白，用10個柱體積含0.15 mo I/L NaCl的過柱緩沖液(0.15 moL/L NaCl的20mmoL/LTris-HCKpH 8.0))洗脫，根據分光光度計檢測，收集洗脫峰，濃縮后，SDS-PAGE檢測目的蛋白SLA-1，結果見圖3。圖3結果顯示，最終收集得到的蛋白呈現單一的條帶，大小為41.6kDa，純度達到了 95%以上，符合進行蛋白功能研究的要求。
[0023]實施例2 口蹄疫病毒模擬表位肽的設計
利用生物學信息軟件 netMHCpan2.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，輸入O型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(AJ539138)、A型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(GQ406249)及Asial型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(EF149009)，選擇九肽，在SLA基因下預測得到能與SLA---蛋白結合，并提呈到細胞表面引起細胞毒性免疫應答的CTL模擬表位肽，共設計了 3條來源于口蹄疫病毒VPl蛋白的9肽，分別命名為Q02、AS3和QA4，其氨基酸序列以及其他基本信息見表1。其中Q02來源于O型口蹄疫的當前國內外流行毒株Tibet/CHA/99 ；AS3 來源于 Asial 型口蹄疫毒株流行株 Asia l/Jiangsu/China/2005 ；QA4來源于A型口蹄疫國際流行株A/VN/03/2009。另外，設計和合成了非相關對照肽Co。各表位肽以凍干狀態儲存于_80°C，備用。
__表1.-CTL表位肱及其相關信息_
【權利要求】
1.一種A型口蹄疫CTL表位肽，其特征在于:所述表位肽的氨基酸序列為:Ala-Met-Leu-Arg-AIa-AIa-Thr-Tyr-Tyr0
2.如權利要求1所述的C`TL表位肽在制備防治口蹄疫多肽疫苗中應用。
【文檔編號】A61P31/14GK103724405SQ201310746389
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月30日 優先權日:2013年12月30日
【發明者】高鳳山 申請人:大連大學