pH敏感性載體及其制造方法、以及含有該載體的pH敏感性藥物、pH敏感性藥物組合物及使 ...的制作方法
【專利摘要】本發明提供可成為生理活性物質的介載體的、應答于弱酸性環境而表現膜破壞功能促進效果的pH敏感性載體及其制造方法、以及含有該載體的pH敏感性藥物、pH敏感性藥物組合物、及使用其的培養方法。所述pH敏感性載體表現膜破壞功能促進效果，包含：選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種pH敏感性化合物；和選自碳原子數10～12的磷脂酰膽堿、碳原子數12～18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數16～18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α－生育酚中的至少一種兩親性物質。
【專利說明】pH敏感性載體及其制造方法、以及含有該載體的pH敏感性 藥物、pH敏感性藥物組合物及使用其的培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及PH敏感性載體及其制造方法、以及含有該載體的pH敏感性藥物、pH敏 感性藥物組合物及使用其的培養方法。更詳細而言，本發明涉及作為DDS(藥物遞送系統， Drug Delivery System)有用的、應答于弱酸性環境而表現膜破壞功能促進效果的pH敏感 性載體及其制造方法、以及含有該載體的pH敏感性藥物、pH敏感性藥物組合物及使用其的 培養方法。
【背景技術】
[0002] 近年來，用于將生理活性物質以必需量送達到必需部位的DDS介載體（載體）的 研究盛行。從積聚性的提高、對送達部位的選擇的觀點出發，刺激應答性介載體備受矚目， 報道了大量利用熱或磁力等外部刺激、分子識別、PH變化、酶反應等生物體內的刺激的研究 等。其中，對弱酸性的PH具有敏感性的介載體長期以來備受矚目。
[0003] 例如，作為應答于弱酸性環境的pH敏感性載體，在含有PE(磷脂酰乙醇胺， Phosphatidylethanolamine)的脂質體中加入PHC (棕櫚酰同型半胱氨酸，Palmitoyl Homocyseine)、油酸、CHEMS (膽固醇玻拍酸單酯，Cholesteryl Hemisuccinate)等各種 pH 敏感性材料而得到的pH敏感性脂質體（S.Simoes et al.Adv.Drug Deli.Rev.2004 56 947-965等）是廣為人知的。最近，為了提高功能，報道了 PEAA(聚（2-乙基丙烯酸）， Poly(2_ethylacrylic Acid))、SucPG(Succinylated Poly(glycidol))等新型合成材料， GALA、pHLIP(pH Low Insertion Peptide)等合成膚，PLGA(Poly(Lactic-co_glycolic Acid))等生物降解性的材料，使用了 pH敏感性的病毒成分的VLP (病毒樣顆粒，Virus Like Particle)、病毒顆粒（Virosome)等的研究。
[0004] 另外，對于pH敏感性的介載體，也期待生理活性物質被高效地送達至腫瘤、炎癥 等生物體內 pH 下降的部位（Reshetnyak et al.PNAC2007vol，104,19, 7893-7898)，或者利 用被細胞攝取后的小泡的酸性化而向細胞質基質送達等。
[0005] 作為利用小泡的酸性化而向細胞質基質的送達，發現通過在被送達至核內體時介 載體的膜融合被促進，這可促進藥物向細胞質基質的遷移，已報道了具有應答于PH而改變 結構的PH敏感性部位、膜融合的部位和膜貫通部位的肽衍生物的DDS介載體（日本特開 2006-34211 號公報）。
[0006] 如上所述的生理活性物質向細胞質基質的送達可應用于各種領域，因此是極其希 望實現的技術。例如，向RNA或DNA的細胞質基質的送達能夠進行基因治療，期待通過將抗 原送達細胞質基質從而誘導CTL (細胞毒性T淋巴細胞，Cytotoxic T Lymphocyte)。另外， 有報道稱低分子抗癌劑的細胞質基質送達具有提高活性的效果，也研究了對于將細胞內作 為藥物靶標的新型藥劑的應用。生理活性物質向細胞質基質的送達是這些領域的主要課 題，是實現上述目標的關鍵性技術。
[0007] 而且，因為利用在PH6以下具有敏感性的pHLIP的向酸中毒（acidosis)部位送達 已有成功事例（Reshetnyak et al. PNAC 2007vol，104,19, 7893-7898)，以及因為核內體內 的到達 pH 為 4 左右（S. Simoes et al. Adv. Drug Deli. Rev. 2004 56 947-965)，因此要求 pH敏感性的載體在從中性至pH4之間具有高敏感性。關于這一點正如在很多文獻中已被指 出。此外，考慮到實用的情況，由安全的材料形成也很重要。
【發明內容】
[0008] 許多pH敏感性脂質體和一部分生物降解性材料等存在下述問題：在比較低的pH 條件下具有敏感性、僅具有不充分的功能。另外，直接修飾PH敏感性物質的方法有可能降 低生理活性物質的活性。此外，從安全性的觀點考慮，使用新型的合成材料、使用病毒成分 尚存懸念。
[0009] 因此，本發明鑒于上述情況而完成，目的在于提供能夠成為生理活性物質的介載 體的、應答于弱酸性環境而表現膜破壞功能促進效果的pH敏感性載體及其制造方法、以及 含有該載體的PH敏感性藥物、pH敏感性藥物組合物及使用其的培養方法。
[0010] 為了達成上述目的的本發明為（1) 一種pH敏感性載體，其表現膜破壞功能促進 效果，包含：選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨 脫氧膽酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種PH敏感性化合物；和選自碳原子數 10?12的磷脂酰膽堿、碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數 16?18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油 酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α-生育酚中的至少一種兩親性物質。
[0011] 此外，為了達成上述目的的本發明為（2)如上述（1)所述的pH敏感性載體，其中， 上述pH敏感性化合物和上述兩親性物質形成膠束狀的粒子。
[0012] 進而，為了達成上述目的的本發明為（3)如上述⑵所述的pH敏感性載體，其中， 粒徑為10?200nm。
[0013] 此外，為了達成上述目的的本發明為（4)如上述（1)?⑶中任一項所述的pH敏 感性載體，其中，上述pH敏感性化合物相對于上述兩親性化合物100摩爾以10摩爾以上的 比例被含有。
[0014] 進而，為了達成上述目的的本發明為（5)如上述（1)?⑷中任一項所述的pH敏 感性載體，其中，將溶出性試驗中的PH敏感性化合物單獨的溶出率作為La,將兩親性物質 單獨的溶出率作為Lb，將pH敏感性載體的溶出率作為Lc，將pH7. 4的溶出率分別表示為 Lc7.4、La7.4、Lb7. 4，將pH5. 0或4. 5的溶出率分別表示為Lcx、Lax、Lbx時，下述式（1)表示的 Λ為5以上，下述式⑵表示的Λ '為5以上。
[0015] 式（1) Δ = (Lcx-Lc7.4)-(Lax-La 7.4)
[0016] 式（2) Δ，= Lcx-(Lax+Lbx)
[0017] 另外，為了達成上述目的的本發明為（6) -種pH敏感性藥物，其中，是上述⑴? (5)中任一項所述的pH敏感性載體載帶生理活性物質而形成的。
[0018] 進而，為了達成上述目的的本發明為（7)如上述（6)所述的pH敏感性藥物，其中， 上述生理活性物質為蛋白質或肽。
[0019] 另外，為了達成上述目的的本發明為（8) -種pH敏感性藥物組合物，包含上述 (1)?（5)中任一項所述的pH敏感性載體及生理活性物質。
[0020] 進而，為了達成上述目的的本發明為（9)如上述（8)所述的pH敏感性藥物組合 物，其中，上述生理活性物質為蛋白質或肽。
[0021] 另外，為了達成上述目的的本發明為（10) -種pH敏感性載體的制造方法，所述pH 敏感性載體表現膜破壞功能促進效果，所述方法包括使pH敏感性化合物與兩親性物質締 合的步驟，所述PH敏感性化合物為選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧 膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種，所述兩親性 物質為選自碳原子數10?12的磷脂酰膽堿、碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單 脂肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二 硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及α -生育酚中的至少一種。
[0022] 進而，為了達成上述目的的本發明為（11) 一種培養方法，包括在下述培養基中培 養細胞的步驟，所述培養基含有上述（6)或（7)所述的pH敏感性藥物及/或上述（8)或 (9)所述的pH敏感性藥物組合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023] [圖1A]圖IA為本發明的pH敏感性載體及該載體載帶生理活性物質而成的藥物 的示意圖。
[0024] [圖1B]圖IB為在使用pH敏感性藥物的情況，pH敏感性載體表現膜破壞功能促 進作用，由此將PH敏感性載體所載帶的生理活性物質遞送到細胞質基質中的示意圖。
[0025] [圖1C]圖IC為使用pH敏感性藥物組合物的情況，pH敏感性載體表現膜破壞功 能促進作用，由此將與PH敏感性載體混合的生理活性物質遞送到細胞質基質中的示意圖。
[0026] [圖2A]圖2A為以各種濃度含有脫氧膽酸的、含有EYPC(蛋黃磷脂酰膽堿，Egg Yolk Phosphatidylcholine)和脫氧膽酸的分散液的照片。
[0027][圖2B]圖2B為以各種濃度含有脫氧膽酸的、含有DLPC(二月桂酰基卵磷脂， Dilauroyl Phosphatidylcholine)和脫氧膽酸的分散液的照片。
[0028] [圖2C]圖2C為表示含有EYPC和脫氧膽酸的分散液的透過度的圖表。
[0029] [圖2D]圖2D為表示含有DLPC和脫氧膽酸的分散液的透過度的圖表。
[0030] [圖3]圖3為表不含有EYPC和脫氧膽酸的分散液的ζ電勢相對于脫氧膽酸量的 圖表。
[0031] [圖4]圖4為表示各種pH條件下的EYPC單獨、DLPC單獨、脫氧膽酸單獨、EYPC-脫 氧膽酸復合體及DLPC-脫氧膽酸復合體的溶出率的圖表。
[0032] [圖5]圖5㈧為表示與經雙重熒光標記的脂質體進行孵育時，各種pH條件下的 EYPC單獨、DLPC單獨、脫氧膽酸單獨、EYPC-脫氧膽酸復合體及DLPC-脫氧膽酸復合體的熒 光強度比的圖表，圖5(B)為表示脫氧膽酸單獨、EYPC-脫氧膽酸復合體及DLPC-脫氧膽酸 復合體的融合率的圖表。
[0033] [圖6]圖6為表示DOPE(二油酰磷月旨酰乙醇胺，Dioleoyl Phosphatidyletanolamine) -Chems脂質體、DOPE-油酸脂質體、及DLPC-脫氧膽酸復合體的 溶出率相對于各種pH的圖表。
[0034] [圖7]圖7 (A)及（B)為表示脫氧膽酸單獨、EYPC-脫氧膽酸復合體及DLPC-脫氧 膽酸復合體的融合率相對于脫氧膽酸量的圖表。
[0035] [圖8]圖8㈧為表示脫氧膽酸單獨、DSPC(二硬脂酰磷脂酰膽堿， Distearoyl Phosphatidylcholine) -脫氧膽酸復合體、DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿， Dipalmitoyl Phosphatidylcholine) -脫氧膽酸復合體、DMPC(二肉豆蘧酰磷脂酰膽 堿，Dimyristoyl Phosphatidylcholine) -脫氧膽酸復合體、DLPC-脫氧膽酸復合體、 及DDPC(二癸酰磷脂酰膽堿，Didecanoyl Phosphatidylcholine)-脫氧膽酸復合體的 融合率的圖。圖8(B)為表示脫氧膽酸單獨、HSPC(氫化大豆磷脂酰膽堿，Hydrogeneted Soybean Phosphatidylcholine)-脫氧膽酸復合體、DOPC(二油酰磷脂酰膽堿，Dioleoyl Phosphatidylcholine)-脫氧膽酸復合體及POPCd-棕櫚酰基2-油酰基磷脂酰膽堿， I-Palmitoyl 2-Oleoyl Phosphatidylcholine)-脫氧膽酸復合體的融合率的圖表。
[0036] [圖9]圖9(A)為表示脫氧膽酸單獨、DLPE(二月桂酰磷脂酰乙醇胺，Dilauroyl Phosphatidyletanolamine)單獨、DMPE(二肉豆蘧醜憐脂醜乙醇胺，Dimyristoyl Phosphatidyletanolamine)單獨、DSPE(二硬脂醜憐脂醜乙醇胺，Distearoyl Phosphatidyletanolamine)單獨、及DOPE單獨的溶出率的圖表。圖9(B)為表示脫氧膽酸 單獨、DLPE-脫氧膽酸復合體、DMPE-脫氧膽酸復合體、DSPE-脫氧膽酸復合體、及DOPE-脫 氧膽酸復合體的溶出率的圖表。
[0037] [圖10]圖10為表示pH5. 0條件下的脫氧膽酸與高分子材料的復合體的溶出率的 圖表。
[0038] [圖11]圖11為表示EYPC與脫氧膽酸與DLPC或SPAN85的復合體在（A) pH7. 4、 (B) pH5. 0條件下的溶出率的圖表。
[0039] [圖12]圖12為表示DLPC與各種備選化合物的復合體在（A)pH7. 4、⑶pH5. 0條 件下的溶出率的圖表。
[0040] [圖13]圖13為表示各種pH條件下的DLPC與各種備選化合物的復合體的溶出率 的圖表。
[0041] [圖14]圖14為表示（A)各種pH敏感性化合物單獨、（B)DLPC與各種pH敏感性 化合物的復合體的融合率的圖表。
[0042] [圖15]圖15為在（A) ρΗ7· 4、（B) ρΗ5· 3的介質中孵育經熒光標記的DLPC-脫氧 膽酸復合體與HeLa細胞時的顯微鏡照片。另外，（C)為使用流式細胞儀進行了評價的細胞 的熒光強度。
[0043] [圖16]圖16為表示ρΗ7. 4及pH5. 0條件下摻入了㈧肽、⑶蛋白質的載體的 溶出率的圖表。
[0044] [圖17]圖17為表示ρΗ7. 4及pH5. 0條件下摻入了肽及蛋白質的（A)DLPC-脫氧 膽酸復合體、（B)DLPC-熊脫氧膽酸復合體的融合率的圖表。
[0045] [圖18]圖18為㈧熒光標記肽單獨的溶液、⑶含熒光標記肽的DLPC單獨的溶 液、（C)含熒光標記肽的DLPC-脫氧膽酸復合體的溶液、及（D)含熒光標記肽的DLPC-熊脫 氧膽酸復合體的溶液的照片。
[0046] [圖19]圖19為攝取了（A)熒光標記肽單獨、⑶含熒光標記肽的DLPC單獨、（C) 含熒光標記肽的DLPC-脫氧膽酸復合體的細胞的熒光顯微鏡照片。
[0047] [圖20]圖20為攝取了含熒光標記肽的DLPC-脫氧膽酸復合體的細胞的（A)顯微 鏡照片及（B)熒光顯微鏡照片、以及攝取了含熒光標記肽的DLPC-熊脫氧膽酸復合體的細 胞的（C)顯微鏡照片及（D)熒光顯微鏡照片。
[0048][圖21]圖21為對β -gal向細胞質基質的遞送的評價結果，其為（A) β -gal單 獨、（B)含β -gal的DLPC-脫氧膽酸復合體、及（C)含β -gal的DLPC-熊脫氧膽酸復合體 的評價結果。
[0049] [圖22A]圖22A為對分別獨立地使用pH敏感性載體及生理活性物質時向細胞質 基質遞送的研究結果，其為（A)熒光標記肽-FITC單獨、（B)熒光標記OVA-FITC單獨、（C) 熒光標記肽-FITC及EYPC-脫氧膽酸復合體的并用、（D)熒光標記OVA-FITC及EYPC-脫 氧膽酸復合體的并用、（E)熒光標記肽-FITC及DLPC-脫氧膽酸復合體的并用、（F)熒光標 記OVA-FITC及DLPC-脫氧膽酸復合體的并用、（G)熒光標記肽-FITC及SPAN80-脫氧膽酸 復合體的并用、（H)熒光標記OVA-FITC及SPAN80-脫氧膽酸復合體的并用、（I)熒光標記 肽-FITC及DDPC-脫氧膽酸復合體的并用、（J)熒光標記OVA-FITC及DDPC-脫氧膽酸復合 體的并用的細胞培養環境下得到的、將顯微鏡照片與熒光顯微鏡照片重合的圖像。
[0050] [圖22B]圖22B為對分別獨立地使用pH敏感性載體及生理活性物質時向細胞質 基質遞送的研究結果，其為（K)熒光標記肽-FITC及I 3EGlO蓖麻油-脫氧膽酸復合體的并 用、（L)熒光標記OVA-FITC及PEGlO蓖麻油-脫氧膽酸復合體的并用、(M)熒光標記肽-FITC 及TWeen20-脫氧膽酸復合體的并用、（N)熒光標記OVA-FITC及TWeen20-脫氧膽酸復合體 的并用、（〇)熒光標記肽-FITC及T Ween80-脫氧膽酸復合體的并用、（P)熒光標記OVA-FITC 及TweenSO-脫氧膽酸復合體的并用、（Q)熒光標記肽-FITC及α -生育酚-脫氧膽酸復合 體的并用、（R)熒光標記OVA-FITC及α-生育酚-脫氧膽酸復合體的并用、（S)熒光標記 肽-FITC及DLPC-熊脫氧膽酸復合體的并用、（T)熒光標記OVA-FITC及DLPC-熊脫氧膽酸 復合體的并用的細胞培養環境下得到的、將顯微鏡照片與熒光顯微鏡照片重合的圖像。
[0051] [圖22C]圖22C為對分別獨立地使用pH敏感性載體及生理活性物質時向細胞質 基質遞送的研究結果，其為（U)熒光標記肽-FITC及DLPC-甘草酸復合體的并用、（V)熒光 標記OVA-FITC及DLPC-甘草酸復合體的并用、(W)熒光標記肽-FITC及DLPC-鵝脫氧膽酸 復合體的并用、（X)熒光標記OVA-FITC及DLPC-鵝脫氧膽酸復合體的并用、（Y)熒光標記 肽-FITC及DLPC-豬脫氧膽酸復合體的并用、（Z)熒光標記OVA-FITC及DLPC-豬脫氧膽酸 復合體的并用、(AA)熒光標記肽-FITC及DLPC-甘氨脫氧膽酸復合體的并用、以及（AB)熒 光標記OVA-FITC及DLPC-甘氨脫氧膽酸復合體的并用的細胞培養環境下得到的、將顯微鏡 照片與熒光顯微鏡照片重合的圖像。
【具體實施方式】
[0052] 本發明涉及一種表現膜破壞功能促進效果的pH敏感性載體，其包含：選自脫氧膽 酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、甘草 亭酸及它們的鹽中的至少一種PH敏感性化合物；和選自碳原子數10?12的磷脂酰膽堿、 碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖醇 脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻 油及α-生育酚中的至少一種兩親性物質。以下，將pH敏感性載體也簡稱為"載體"、"締合 體"或"復合體"。需要說明的是，本說明書中，兩親性物質中的"碳原子數"，是指構成兩親 性物質的疏水部的脂肪酸成分（酰基）的碳原子數。
[0053] 根據本發明，可以提供安全性高、具有對pH的高敏感性的pH敏感性載體。
[0054] 需要說明的是，本發明中，所謂"膜破壞功能"，是指在溶出性試驗中引起溶出的功 能。此處，本說明書中的溶出性試驗是如下進行的試驗：將包封有含消光物質和熒光物質的 水溶液的脂質體（分散液）、和pH敏感性載體或者pH敏感性化合物單獨或兩親性化合物單 獨等的評價樣品分散液添加到調制為具有規定的PH的水溶液中，將該水溶液在37°C下孵 育90分鐘或30分鐘，然后測定該水溶液的熒光。利用該方法，能夠測定從脂質體溶出的熒 光物質的量，能夠確認PH敏感性載體的脂質體的膜破壞功能。需要說明的是，關于溶出性 試驗，在后述的實施例中詳細說明。
[0055] 此外，所謂"表現膜破壞功能促進效果"，是指滿足以下兩者：（1)在溶出性試驗 中，與生理pH條件下的溶出率相比，在低于生理pH的規定pH條件下的溶出率上升，并且其 上升幅度大于使用PH敏感性化合物單獨進行實驗時的上升幅度，及（2)在低于該生理pH 的規定pH的溶出性試驗中，pH敏感性化合物與兩親性物質形成復合體（pH敏感性載體） 時的溶出率大于pH敏感性化合物單獨的溶出率與兩親性物質單獨的溶出率之和。更具體 而言，所謂表現膜破壞功能促進效果，是指在PH7. 4、以及pH5. 0或pH4. 5的溶出性試驗中， pH敏感性載體（pH敏感性化合物和兩親性物質的復合體）的溶出率Lc、與pH敏感性化合 物單獨的溶出率La和兩親性物質單獨的溶出率L，滿足下述兩種關系。即，上述（1)用下述 式（1)表示，上述（2)用下述式（2)表示。需要說明的是，下述式中，將pH7.4的溶出率分 別表示為Lc 7.4、La7.4、Lb7. 4，將pH5. 0或4. 5的溶出率分別表示為Lcx、Lax、Lbx。
[0056] 式（1) Δ = (Lcx-Lc7.4) - (Lax-La7.4) >0
[0057] 式⑵ Λ，= Lcx- (Lax+Lbx) >0
[0058] 上述式（I)中，Λ只要大于0即可，但優選為5以上，更優選為10以上，進一步優 選為30以上。另外，上述式⑵中，Λ '只要大于0即可，但優選為5以上，更優選為10以 上，進一步優選為15以上。
[0059] 優選地，上述式（1)及上述式（2)中Λ及Λ '分別為5以上的pH敏感性載體，且 該載體含有膽汁酸和脂質。還優選地，上述式（1)及上述式（2)中Λ及Λ '分別為5以上、 且含有甘草酸或甘草亭酸和脂質的PH敏感性載體。
[0060] 本說明書中，所謂"生理pH"，是指正常組織、正常體液中的pH。生理pH通常為7. 4， 根據正常組織、正常體液的不同稍微（±0.1)不同。另外，所謂"低于生理PH的規定pH"， 只要低于pH7. 4即可，優選pH3. 0以上、低于pH7. 4,更優選pH4. 0以上、低于pH7. 3,進一步 優選PH4. 5以上、低于pH7. 0。
[0061] 本發明的pH敏感性載體表現膜破壞功能促進效果的機制尚不明確，但推測如下。 需要說明的是，本發明并不受下述推測的限定。
[0062] 認為本發明的pH敏感性載體是在水性溶液中、在生理pH以上，由pH敏感性化合 物和兩親性物質締合而形成的。
[0063] 圖IA表示本發明的pH敏感性載體及該pH敏感性載體載帶生理活性物質而成的 PH敏感性藥物的示意圖。如圖IA所示，認為本發明的pH敏感性載體是pH敏感性化合物締 合至構成兩親性物質的疏水性部分而形成的。另外，本發明的pH敏感性載體可以在載體的 內部包封生理活性物質。需要說明的是，PH敏感性載體的該締合形式是推測的，本發明的 pH敏感性載體并不限定于該締合形式。另外，pH敏感性載體的該載帶形式也是推測的，本 發明的pH敏感性載體并不限定于該載帶形式。
[0064] 認為：周邊環境變為低于生理pH的情況下，pH敏感性化合物與兩親性物質的締合 形態發生變化，其結果，PH敏感性載體具有膜破壞功能促進效果。推測如下：例如，在存在 pH敏感性載體和生物膜（例如細胞膜、小泡膜等）的體系中，pH低于生理pH時，pH敏感 性載體的締合形態發生變化，與生物膜接觸后，由該變化誘發生物膜的膜結構也發生變化。 艮P，pH敏感性載體誘發生物膜的膜結構變化。認為這是因為：由于pH變為弱酸性，pH敏感 性載體中的PH敏感性化合物在該載體的結構中變得不穩定，其結果，pH敏感性載體與體系 內存在的生物膜進行重排，表現出膜破壞功能促進效果。另外，換言之，認為PH敏感性化合 物為下述分子：pH變為弱酸性時，由于質子化而使得其向疏水締合中的溶解性改變。即，可 以認為，含有PH敏感性化合物的疏水締合能夠應答于弱酸性環境而表現功能。需要說明的 是，所謂"膜破壞"，是稱呼如上所述膜結構的變化的用語，膜構成成分可以不全部進行分離 或分解。通過產生這樣的"膜破壞"，可被含有于生物膜（例如核內體）膜內部的成分溶出 到生物膜的外部（例如細胞質基質）等。
[0065] 對于本發明的pH敏感性載體，優選地，溶出性試驗中的溶出率在pH7. 4時小于 20 %，并且在pH4. 0時大于20 %。另外，更優選地，溶出性試驗中的溶出率在pH6. 5時小于 20%，并且在pH4. 0時大于20%。另外，上述中，pH7. 4或pH6. 5時的溶出率更優選為15% 以下，進一步優選為10%以下。另外，PH4.0時的溶出率更優選為40%以上，進一步優選為 50%以上。通過使pH敏感性載體的溶出率為上述范圍，可進一步發揮表現在弱酸性pH條 件下的膜破壞功能促進效果的作用。
[0066] 另外，除表現膜破壞功能促進效果外，本發明的pH敏感性載體還能夠表現膜融合 功能促進效果。
[0067] 本發明中，所謂"膜融合功能"，是指膜融合試驗中引起膜融合的功能。此處，本說 明書中的膜融合試驗如下所述：在調制成規定PH的水溶液中添加將2種熒光物質摻入到雙 分子膜而得到的脂質體（分散液）、以及PH敏感性載體或者pH敏感性化合物單獨或兩親性 化合物單獨等的評價樣品分散液，將該水溶液在37°C下孵育60分鐘，然后測定該水溶液的 熒光。通過該方法，能夠測定摻入到脂質體中的2種熒光物質的能量共振轉移的變化，能夠 確認PH敏感性載體的膜融合功能。需要說明的是，對于膜融合試驗，在后述的實施例中詳 細說明。
[0068] 另外，所謂"表現膜融合功能促進效果"，是指在膜融合試驗中，與生理pH條件下 的融合率相比，在低于生理PH的規定的pH條件下的融合率上升，并且其上升幅度大于pH 敏感性化合物單獨實驗時的上升幅度。更具體而言，表現膜融合功能促進效果是指：在 pH7. 4和pH5. 0的膜融合試驗中，pH敏感性載體（pH敏感性化合物和兩親性物質的復合體） 的融合率Rc(% )與pH敏感性化合物單獨的融合率Ra(% )滿足下述式（3)的關系。需要 說明的是，下述式中，將PH7. 4的融合率分別表示為Rc7.4、Ra7.4，將pH5. 0的融合率分別表示 為 Rcx、Rax。
[0069] 式（3) Δ R = (Rcx- Rc7.4) - (Rax- Ra7.4) >0
[0070] 上述式（3)中，AR大于0即可，但優選為2以上，更優選為5以上，進一步優選為 10以上。
[0071] 上述式（3)中AR為2以上、且含有膽汁酸和脂質的pH敏感性載體是優選的。
[0072] 本發明的pH敏感性載體在弱酸性pH (低于生理pH的規定pH)條件下表現膜融合 功能促進效果，但其機制尚不明確，可以認為是與上述膜破壞功能促進效果為同樣的機制。 需要說明的是，本發明并不受該推測的限定。
[0073] 即推測：在周邊環境低于生理pH時，本發明的pH敏感性載體中，pH敏感性化合物 和兩親性物質的締合形態發生變化，與體系內存在的生物膜進行重排，由此膜融合。此時， 膜融合是在相互間具有親和性的成分之間進行重排，因此，與生物膜沒有親和性、或親和性 低的成分（例如生理活性物質）從被重排的膜中被排除、釋放。
[0074] 通常，細胞外分子被作為生物膜之一的核內體（endosome)包圍而被攝取進細胞。 之后，由于質子泵的作用，核內體內部的pH下降。進而，核內體與含有水解酶的溶酶體融 合，細胞外分子被分解。因此，細胞外分子基本不被遞送到細胞質基質內。
[0075] 相對于此，本發明中，如圖1B、圖IC所示，pH敏感性載體（pH敏感性藥物或pH敏 感性藥物組合物）被核內體包圍而被攝取進細胞時，同樣地被導入pH降低后的環境。從而， 伴隨pH的降低（酸性化），pH敏感性化合物使pH敏感性載體不穩定，在核內體與pH敏感 性載體之間發生膜的重排。其結果，產生由PH敏感性載體引起的膜破壞功能（根據情況， 與膜融合功能一并表現的膜破壞功能）。
[0076] 如圖1B、圖IC中所示例那樣，通過利用本發明所述的pH敏感性載體，可以將生理 活性物質等遞送到細胞質基質內。具體而言，在使用PH敏感性藥物的情況下，使用在pH敏 感性載體內部包封的生理活性物質（圖1B)或pH敏感性藥物組合物的情況下，與pH敏感 性載體一并使用的生理活性物質（圖1C)與pH敏感性載體一同被核內體包圍，被攝取進細 胞。若核內體內部的PH降低，則pH敏感性化合物使pH敏感性載體不穩定，在核內體和pH 敏感性載體之間發生膜的重排。其結果，產生由pH敏感性載體引起的核內體的膜破壞。由 此，生理活性物質被釋放進胞質基質。即，能夠在不使生理活性物質分解的情況下遞送到細 胞質基質內。
[0077] 另外，本發明的pH敏感性載體優選在水性介質中形成含有pH敏感性化合物和兩 親性物質的復合體。這些復合體的形態沒有特別限制，既可以是PH敏感性化合物和兩親 性物質形成膜，也可以是PH敏感性化合物的一部分或全部通過締合等被埋入兩親性物質 形成的結構中。另外，本發明的pH敏感性載體中，pH敏感性化合物和兩親性物質優選形 成膠束狀的粒子，但也可以形成脂質體等粒子狀的載體。另外，考慮到EPR效果（Enhanced Permeation and Retention Effect)、基于內吞作用的細胞攝取時，膠束狀的粒子優選粒徑 為10?200nm，更優選為10?100nm。需要說明的是，本說明書中，所謂膠束狀的粒子，是指 PH敏感性化合物和兩親性物質通過疏水性相互作用締合成粒狀的粒子，典型地為單分子膜 結構的粒子，不包括形成脂質雙分子膜結構（例如脂質體）的粒子。另外，本說明書中，PH 敏感性載體的粒徑可以利用動態光散射法（MALVERN Instruments公司制，NanoZS90)進行 測定。
[0078] 需要說明的是，在含有本發明的pH敏感性載體的水性溶液中，只要存在有pH敏感 性載體，pH敏感性化合物或兩親性物質不形成締合體而以游離的狀態存在也是可以的。
[0079] 以下，說明構成本發明的pH敏感性載體的各成分。
[0080] < pH敏感性載體的構成成分>
[0081] (pH敏感性化合物）
[0082] 作為本發明中使用的pH敏感性化合物，為選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫 氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一 種。作為PH敏感性化合物的鹽，沒有特別限定，可以舉出鋰、鈉、鉀等堿金屬鹽，鎂、鈣、鋇等 堿土金屬鹽，銨鹽等。這些PH敏感性化合物可以單獨使用，也可以并用2種以上使用。
[0083] 作為pH敏感性化合物，優選脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、甘 氨脫氧膽酸、甘草亭酸或它們的鹽，較優選脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、甘草亭酸或它們的鹽。
[0084] 本發明中優選使用的脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級 膽汁酸及甘氨脫氧膽酸統稱為膽汁酸。膽汁酸作為代表性的留族化合物衍生物，從1920年 代以前就為人們已知，其被利用于細菌學的領域中。膽汁酸在人的機體內與膽固醇、脂質、 脂溶性維生素形成復合體，具有輔助它們的吸收的作用。另外，膽汁酸因其具有的物理化 學性質而可以與脂質、蛋白質、疏水的材料形成復合體，因此長期以來用于蛋白質的分離純 化，以及用作增溶劑、乳化劑。最近，其在疫苗的制造工序的用途、作為借助膽汁酸轉運蛋白 的藥劑的吸收促進劑也受到矚目。特別地，脫氧膽酸鈉（別名去氧膽酸鈉）和熊脫氧膽酸 (別名熊去氧膽酸）作為能夠注射給人的藥品添加物具有實際成果，確認到優異的安全性。 因此，作為本發明的PH敏感性化合物，更優選使用脫氧膽酸、熊脫氧膽酸或其鹽（例如鈉 鹽）。
[0085] 優選地，pH敏感性化合物相對于100摩爾兩親性物質而言以10摩爾以上的比例被 含有。更優選地，相對于100摩爾兩親性物質而言，為10?640摩爾，進一步優選為20? 320摩爾，特別優選為20?160摩爾。
[0086] (兩親性物質）
[0087] 作為本發明中使用的兩親性物質，為選自碳原子數10?12的磷脂酰膽堿、碳原 子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖醇脂肪 酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及 α-生育酚中的至少一種。這些兩親性物質可以單獨使用，也可以并用2種以上。需要說明 的是，本說明書中，兩親性物質中的"碳原子數"，是指構成兩親性物質的疏水部的脂肪酸成 分（酰基）的碳原子數。
[0088] 作為碳原子數10?12的磷脂酰膽堿，優選具有飽和酰基的二酰基磷脂酰膽堿，例 如可以舉出二癸酰基磷脂酰膽堿（DDPC ;1，2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿）、二 月桂酰基磷脂酰膽堿（DLPC ; 1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿）。作為磷脂酰 膽堿，可以為天然來源或利用已知的方法合成的物質，還可以使用市售的物質。
[0089] 作為碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯，可以舉出聚氧乙烯山 梨糖醇酐單月桂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、聚氧乙烯山梨糖醇酐肉 豆蘧酸酯（聚氧乙烯山梨糖醇酐單肉豆蘧酸酯）、聚氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯（聚氧 乙烯山梨糖醇酐棕櫚酸酯）、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯（polyoxyethylene sorbitan monostearate)、聚氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯（polyoxyethylene sorbitan monooleate) 等。作為聚氧乙烯的聚合度，沒有特別限制，與失水山梨糖醇加成了的聚氧乙烯鏈的總計的 聚合度優選為10?200,更優選為15?100,進一步優選為20?50。聚氧乙烯山梨糖醇酐 單脂肪酸酯可以使用合成品，也可以使用市售品。作為聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯的 市售品，可以優選使用例如作為Tween20(聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯）、Tween40(聚 氧乙烯山梨糖醇酐單棕櫚酸酯）、Tween60 (聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯）、Tween80 (聚 氧乙烯山梨糖醇酐單油酸酯）出售的物質。其中，優選碳原子數16?18的聚氧乙烯山梨 糖醇酐單脂肪酸酯（Tween40、Tween60、Tween80)。
[0090] 作為碳原子數16?18的失水山梨糖醇脂肪酸酯，可以舉出失水山梨糖醇單棕櫚 酸酯（sorbitan monopalmitate)、失水山梨糖醇單硬脂酸酯（sorbitan monostearate)、 失水山梨糖醇單油酸酯（sorbitan monooleate)等失水山梨糖醇單脂肪酸酯，失水山 梨糖醇三棕櫚酸酯（sorbitan tripalmitate)、失水山梨糖醇三硬脂酸酯（sorbitan tristearate)、失水山梨糖醇三油酸酯（sorbitan trioleate)等失水山梨糖醇三脂肪酸酯 等。失水山梨糖醇脂肪酸酯既可以使用合成品，也可以使用市售品。作為失水山梨糖醇脂肪 酸酯的市售品，可以優選使用例如作為SPAMO (失水山梨糖醇棕櫚酸酯）、SPAN60(失水山 梨糖醇硬脂酸酯）、SPAN80 (失水山梨糖醇油酸酯）、SPAN65 (失水山梨糖醇三硬脂酸酯）、 SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯）出售的物質。其中，優選SPAN80, SPAN65、SPAN85。
[0091] 作為本發明中使用的單油酸甘油酯（glyceryl monooleate)、二月桂酸甘油 酯（glyceryl dilaurate)、二硬脂酸甘油酯（glyceryl distearate)、二油酸甘油酯 (glyceryl dioleate),為在甘油上通過酯鍵連接有1或2分子的脂肪酸的酰基甘油,脂肪 酸鍵合的部位沒有特別限定。例如，如果為作為單酰基甘油的單油酸甘油酯，則可以在甘油 的Cl位或C2位通過酯鍵連接脂肪酸。另外，如果為作為二酰基甘油的二月桂酸甘油酯、二 硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯，則只要在甘油的Cl位及C2位、或Cl位及C3位通過酯鍵連 接脂肪酸即可。例如，作為二月桂酸甘油酯，優選Cl位及C3位被取代的α，α'_二月桂酸 酯。作為二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯，優選Cl位及C2位被取代的二酰基甘油。作為上 述甘油衍生物，既可以使用合成品，也可以使用市售品。
[0092] 作為聚氧乙烯蓖麻油，為在蓖麻油中加成了聚氧乙烯而得到的物質。作為聚氧乙 烯的聚合度，沒有特別限制，優選為3?200,更優選為5?100,進一步優選為10?50。聚 氧乙烯蓖麻油既可以使用合成品，也可以使用市售品。
[0093] 作為α-生育酚，可以為天然來源或利用已知的方法合成的物質，還可以使用市 售的物質。
[0094] 作為所述兩親性物質，優選碳原子數10?12的磷脂酰膽堿。其中，特別優選碳原 子數12的二月桂酰基磷脂酰膽堿（DLPC)。
[0095] (pH敏感性化合物及兩親性物質的組合）
[0096] 本發明的pH敏感性載體通過pH敏感性化合物和兩親性物質的組合，可以在期望 的PH條件下表現膜破壞功能促進效果。此時，根據pH敏感性化合物和兩親性物質的組合 的不同，使得能夠開始表現出PH敏感性載體的膜破壞功能促進效果的pH不同。認為其原 因在于：根據pH敏感性化合物的不同pKa不同，并且與兩親性物質形成締合的形式根據pH 敏感性化合物和兩親性物質的組合的不同而不同。因此可以說，通過適當改變pH敏感性 化合物和兩親性物質的組合，能夠對表現功能的PH進行選擇，能夠詳細設定生物體內的遞 送、及細胞內的遞送。
[0097] 本發明的pH敏感性載體中，作為pH敏感性化合物和兩親性物質的組合，優選 為：脫氧膽酸及DDPC、脫氧膽酸及DLPC、脫氧膽酸及Tween20、脫氧膽酸及Tween40、脫氧膽 酸及Tween60、脫氧膽酸及Tween80、脫氧膽酸及SPAN40、脫氧膽酸及SPAN60、脫氧膽酸及 SPAN80、脫氧膽酸及SPAN65、脫氧膽酸及SPAN85、脫氧膽酸及α -生育酚、脫氧膽酸及單油 酸甘油酯、脫氧膽酸及二硬脂酸甘油酯、脫氧膽酸及二油酸甘油酯、脫氧膽酸及二月桂酸甘 油酯（α、α ' -二月桂酸酯）、脫氧膽酸及聚氧乙烯蓖麻油、熊脫氧膽酸及DDPC、熊脫氧膽 酸及DLPC、熊脫氧膽酸及Tween20、熊脫氧膽酸及Tween40、熊脫氧膽酸及Tween60、熊脫氧 膽酸及Tween80、熊脫氧膽酸及SPAN40、熊脫氧膽酸及SPAN60、熊脫氧膽酸及SPAN80、熊脫 氧膽酸及SPAN65、熊脫氧膽酸及SPAN85、熊脫氧膽酸及α -生育酚、熊脫氧膽酸及單油酸 甘油酯、熊脫氧膽酸及二硬脂酸甘油酯、熊脫氧膽酸及二油酸甘油酯、熊脫氧膽酸及二月桂 酸甘油酯（α、α ' -二月桂酸酯）、熊脫氧膽酸及聚氧乙烯蓖麻油、甘草酸及DDPC、甘草酸 及DLPC、甘草酸及Tween20、甘草酸及Tween40、甘草酸及Tween60、甘草酸及Tween80、甘草 酸及SPAN40、甘草酸及SPAN60、甘草酸及SPAN80、甘草酸及SPAN65、甘草酸及SPAN85、甘草 酸及α -生育酚、甘草酸及單油酸甘油酯、甘草酸及二硬脂酸甘油酯、甘草酸及二油酸甘油 酯、甘草酸及二月桂酸甘油酯（α、α 二月桂酸酯）、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。
[0098] 更優選為：脫氧膽酸及DDPC、脫氧膽酸及DLPC、脫氧膽酸及TWeen40、脫氧膽酸 及Tween60、脫氧膽酸及Tween80、脫氧膽酸及SPAN40、脫氧膽酸及SPAN65、脫氧膽酸及 SPAN85、脫氧膽酸及α -生育酚、脫氧膽酸及單油酸甘油酯、脫氧膽酸及聚氧乙烯蓖麻油、 熊脫氧膽酸及DDPC、熊脫氧膽酸及DLPC、熊脫氧膽酸及T Ween40、熊脫氧膽酸及TWeen60、熊 脫氧膽酸及TWeen80、熊脫氧膽酸及SPAN40、熊脫氧膽酸及SPAN65、熊脫氧膽酸及SPAN85、 熊脫氧膽酸及α -生育酚、熊脫氧膽酸及單油酸甘油酯、熊脫氧膽酸及聚氧乙烯蓖麻油、甘 草酸及DDPC、甘草酸及DLPC、甘草酸及Tween40、甘草酸及Tween60、甘草酸及Tween80、甘草 酸及SPAN40、甘草酸及SPAN65、甘草酸及SPAN85、甘草酸及α -生育酚、甘草酸及單油酸甘 油酯、甘草酸及聚氧乙烯蓖麻油。
[0099](水性溶劑）
[0100] 本發明的pH敏感性載體可以含在水性溶液中。需要說明的是，以下，將含有pH敏 感性載體的水溶液也稱作"載體分散液"。
[0101] 作為含有本發明的PH敏感性載體的水性溶液的溶劑，優選為含有緩沖劑、NaCl、 葡萄糖、蔗糖等糖類的水溶液。
[0102] 作為緩沖劑，只要將含有pH敏感性載體的水性溶液的pH維持在生理pH以上即 可，可以合適地使用已知的緩沖劑，沒有特別限定。作為緩沖劑，可以使用例如磷酸緩沖 齊U、檸檬酸緩沖劑、檸檬酸-磷酸緩沖劑、三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖劑（Tris鹽酸緩沖 劑）、MES緩沖劑（2-嗎啉基乙磺酸緩沖劑）、TES緩沖劑（N-三（羥甲基）甲基-2-氨基 乙磺酸緩沖劑）、乙酸緩沖劑、MOPS緩沖劑（3-嗎啉基丙磺酸緩沖劑）、MOPS-NaOH緩沖劑、 HEPES緩沖劑（4- (2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸緩沖劑）、HEPES-NaOH緩沖劑等GOOD緩沖劑、 甘氨酸_鹽酸緩沖劑、甘氨酸 -NaOH緩沖劑、甘氨酰基甘氨酸-NaOH緩沖劑、甘氨酰基甘氨 酸-KOH緩沖劑等氨基酸系緩沖劑、Tris-硼酸緩沖劑（Tris-borate buffer)、硼酸-NaOH 緩沖劑、硼酸緩沖劑等硼酸系緩沖劑、或咪唑緩沖劑等。其中，優選磷酸緩沖劑、檸檬酸緩沖 齊U、檸檬酸-磷酸緩沖劑、Tris鹽酸緩沖劑、MES緩沖劑、乙酸緩沖劑、HEPES-NaOH緩沖劑。 作為緩沖劑的濃度，沒有特別限制，優選〇. 1?200mM，更優選1?100mM。需要說明的是， 本發明中，所謂緩沖劑的濃度，是指水性溶液中含有的緩沖劑的濃度（mM)。
[0103] 作為NaCl、葡萄糖、蔗糖等糖類的濃度，沒有特別限制，優選0. 1?200mM，更優選 1 ?150mM〇
[0104] 作為水性溶液中的pH敏感性載體的濃度，沒有特別限制，pH敏感性化合物和兩親 性物質的總摩爾濃度優選為〇· 73 μ mol/L?7. 4mmol/L，更優選為7. 3 μ mol/L?6. 5mmol/ L，進一步優選為 8. 0 μ mol/L ?4. 2mmol/L。
[0105] (其他成分）
[0106] 對于本發明的pH敏感性載體而言，可以在pH敏感性載體中或含有pH敏感性載體 的水性溶液中包含穩定劑等其他成分。作為這些成分的含量，只要不破壞PH敏感性載體即 可，沒有特別限制，相對于兩親性物質100摩爾，優選為150摩爾以下，更優選為66. 4摩爾 以下。
[0107] 作為穩定劑，只要不破壞pH敏感性載體即可，沒有特別限定，可以使用例如1-辛 醇、I-十二燒醇、I-十六燒醇（Hiexadodecanol)、1_二十燒醇等飽和及不飽和的碳原子 數4?20的醇；月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸等飽和及不飽和的碳原子數12? 18的脂肪酸；辛酸甲酯（methyl octanoate)、辛酸乙酯（ethyl octanoate)、月桂酸甲酯、 月桂酸乙酯、肉豆蘧酸乙酯、棕櫚酸乙酯、硬脂酸乙酯、油酸甲酯、油酸乙酯等飽和及不飽 和的碳原子數8?18的脂肪酸烷基酯（碳原子數1?3的烷基）；D(L)_丙氨酸、精氨 酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、 蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸等D(L)-氨基酸；甘油 三己酸酯（tricaproin)、甘油三辛酸酯（tricaprylin)等甘油三氨基酸酯（amino acid triglycerides);聚氧乙烯山梨糖醇酐三棕櫚酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐三油酸酯等碳原 子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐三脂肪酸酯（例如，Tween65、Tween85);聚氧乙烯月 桂酸酯、聚氧乙烯肉豆蘧酸酯、聚氧乙烯棕櫚酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯等碳原子數12?18 的聚氧乙烯烷基酯（例如PEG20硬脂基醚、PEG23月桂基醚）；聚氧化烯氫化蓖麻油（例 如PEG10氫化蓖麻油、PEG40氫化蓖麻油、PEG60氫化蓖麻油）；辛酸甘油酯（glycerol octenoate)、單癸酸甘油酯、單月桂酸甘油酯、單肉豆蘧酸甘油酯、單棕櫚酸甘油酯、單硬脂 酸甘油酯、單油酸甘油酯等飽和及不飽和的碳原子數8?18的單脂肪酸甘油酯；二辛酸 甘油酯、二癸酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二肉豆蘧酸甘油酯、二棕櫚酸甘油酯等碳原子數 8?16的二脂肪酸甘油酯；α -生育酚乙酸酯、蓖麻油、大豆油、膽固醇、角鯊烯、角鯊烷、乳 糖、抗壞血酸棕櫚酸酯、苯甲酸芐酯、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸 丙酯、對羥基苯甲酸丁酯等已知的穩定劑。需要說明的是，所謂"碳原子數"，是指構成疏水 部的脂肪酸成分（酰基）的碳原子數。
[0108] < pH敏感性載體的制造方法>
[0109] 根據本發明，還可提供表現膜破壞功能促進效果的pH敏感性載體的制造方法，所 述方法包括使pH敏感性化合物與兩親性物質締合的步驟，所述pH敏感性化合物為選自脫 氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、 甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種，所述兩親性物質為選自碳原子數10?12的磷脂酰膽 堿、碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖 醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖 麻油及α-生育酚中的至少一種。
[0110] 作為使pH敏感性化合物與兩親性物質締合的方法，只要pH敏感性化合物和兩親 性物質在水性溶液中接觸即可。因此,本發明的pH敏感性載體可以通過使pH敏感性化合 物與兩親性物質在水性溶液中接觸而制造。具體而言，制作含有PH敏感性化合物和兩親性 物質的水性溶液，使用乳化器、漩渦混合器、超聲波等劇烈攪拌該溶液并分散，由此可以得 到pH敏感性化合物和兩親性物質締合而成的pH敏感性載體。
[0111] 作為制備含有pH敏感性化合物和兩親性物質的水性溶液的方法，只要pH敏感性 化合物與兩親性物質形成締合體即可，沒有特別限制。例如，可以舉出以下方法：（1)分別 制備含有PH敏感性化合物的水性溶液、及含有兩親性物質的水性溶液，將這些水性溶液混 合，使用乳化器、漩渦混合器、超聲波等劇烈攪拌該溶液并使其分散，得到PH敏感性載體的 方法；（2)利用作為脂質體的制造法已知的薄膜分散法（Bangham法）進行制備的方法。作 為薄膜分散法，具體而言，在玻璃容器中，將pH敏感性化合物及兩親性物質等pH敏感性載 體的構成成分溶解在有機溶劑（例如甲醇、氯仿）中，利用旋轉蒸發儀等除去有機溶劑， 在玻璃容器的壁上形成薄膜。接著，將水性溶液加入到形成了薄膜的玻璃容器中，在常溫 (5?35°C )下使薄膜膨潤后，在常溫（5?35°C )下振蕩玻璃容器。此時，使用乳化器、漩 渦混合器、超聲波劇烈攪拌，可以使薄膜充分地分散在水性溶液中。另外，上述的（1)制造 方法中，可以在含有兩親性物質的水性溶液中混合pH敏感性化合物。需要說明的是，作為 水性溶液的溶劑，可以使用上述水性溶液的溶劑。
[0112] 需要說明的是，關于薄膜分散法的方法的詳細說明，可以參考已知的脂質體制造 方法，《脂質體）（野島莊七、砂本順三、井上圭三編，南江堂）及《生命科學中的脂質體）（7 4 7寸4工> 7 (二杉汁3 U *。y 一 Λ )(寺田弘、吉村哲郎編、施普林格出版社東京）中對 其已有記載。
[0113] 另外，作為pH敏感性載體中或含有pH敏感性載體的水性溶液中可以含有的穩定 劑等其他成分的添加方法，沒有特別限制。例如，既可以添加在含有pH敏感性化合物的水 性溶液、或含有兩親性物質的水性溶液中，也可以在制備薄膜時使其與pH敏感性載體的構 成成分一起溶解、使用含有這些成分的薄膜得到含有PH敏感性載體的水性溶液。
[0114] 如上所述得到的pH敏感性載體可以表現如上所述的膜破壞功能促進效果，可適 合用于DDS。
[0115] < pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物>
[0116] 根據本發明的一個實施方式,還提供一種pH敏感性藥物，是pH敏感性載體載帶至 少一種生理活性物質而成的。
[0117] 需要說明的是，本發明中，所謂載帶，是指生理活性物質被載體包封的形態、被插 入載體的膜內的形態、或者直接結合或經由介質結合在載體的表面的形態。此處，所謂結 合，可以為共價鍵或離子鍵等化學鍵，范德華結合或疏水結合等物理結合中的任一種。生理 活性物質可以為親水性物質及疏水性物質中的任一種。生理活性物質為疏水性物質時，優 選以被pH敏感性載體包封或被插入pH敏感性載體的膜內的形態載帶，生理活性物質為親 水性物質時，優選以直接結合或經由介質結合在載體的表面的形態載帶。
[0118] 本發明的pH敏感性載體可以載帶生理活性物質，在低于生理pH的環境下，通過表 現PH敏感性載體的膜破壞功能促進效果，可以將載帶的生理活性物質遞送到期望的部位。 其機制尚不明確，但推測如下（參見圖1B)。需要說明的是，本發明不限定于下述推測。
[0119] 本發明的pH敏感性載體載帶生理活性物質而得到的pH敏感性藥物，由于細胞的 內吞作用，被攝取到細胞內，形成含有pH敏感性藥物的核內體。然后，將核內體內引導為酸 性環境。此時，在周圍環境達到低于生理pH(例如pH6. 5)時，本發明的pH敏感性藥物表現 出pH敏感性載體的膜破壞功能促進效果。即，pH敏感性載體的構成成分和構成核內體的 膜構成成分發生重排，存在于核內體內部的pH敏感性載體載帶的生理活性物質向細胞質 基質內遷移。可以認為，由此可以將生理活性物質直接遞送至期望的細胞質基質，因此能夠 發揮藥理作用高的效果。
[0120] 根據本發明的另一實施方式,提供一種含有pH敏感性載體及至少一種生理活性 物質的pH敏感性藥物組合物。這種情況下，上述生理活性物質與前文所述的實施方式中的 pH敏感性藥物不同，其（分開）存在于pH敏感性載體的外部，而且生理活性物質與pH敏感 性載體不直接結合，也不經由介質結合。即，本實施方式的pH敏感性藥物組合物是pH敏感 性載體及生理活性物質分別獨立混合而成的。
[0121] 本發明的pH敏感性載體及生理活性物質分別獨立地混合的pH敏感性藥物組合物 也能夠通過在低于生理PH的環境下表現pH敏感性載體的膜破壞功能促進效果，將生理活 性物質遞送期望的部位。其機制尚不明確，但推測是基于與上述的PH敏感性載體載帶生理 活性物質而成的PH敏感性藥物同樣的機制（參見圖1C)。需要說明的是，本發明并不限定 于下述推測。
[0122] 即，本實施方式的pH敏感性藥物組合物，通過細胞內吞pH敏感性載體而被攝取到 細胞內。此時，關于生理活性物質，其也與pH敏感性載體一同通過內吞作用被攝取到細胞 內。其結果，在同一核內體內形成分別獨立地含有pH敏感性載體及生理活性物質的核內 體。之后，將核內體內引導為酸性環境，當周圍環境達到低于生理pH(例如pH6. 5)時，表現 出pH敏感性載體的膜破壞功能促進效果。然后，核內體內部存在的生理活性物質向細胞質 基質內遷移。由此，可以將生理活性物質直接遞送到期望的細胞質基質。
[0123] 另外，本發明的pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物也可以將生理活性物質效 率良好地遞送到腫瘤、炎癥等生物體內pH降低的部位。即，本發明的pH敏感性藥物及pH 敏感性藥物組合物在pH降低的部位表現膜破壞功能促進效果，因而可以將生理活性物質 選擇性地遞送到炎癥等的治療部位。
[0124] pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物中使用的生理活性物質的種類沒有特別限 定。例如，作為生理活性物質，可以舉出核酸、低分子化合物、蛋白質、肽。
[0125] 作為上述核酸，可以舉出siRNA、0DN(寡脫氧核苷酸）、DNA等具有治療效果的核 酸。
[0126] 作為上述低分子化合物，可以舉出絲裂霉素、多西他賽、甲氨蝶呤等細胞毒性劑； 5-氨基乙酰丙酸、原卟啉IX等前體藥物；更昔洛韋、地塞米松、病毒唑、阿糖腺苷等抗炎劑； D0TA(1, 4, 7, 10-四氮雜環十四燒-N, N，，N", N"，-四乙酸，1，4, 7, 10-tetraazacyclotetrad ecane-N, N，，N", N，"-tetraaceticacid)、DTPA(1, 4, 7, 10-四氮雜環癸烷-N, N，，N", N"，-四 乙酸，1，4, 7, l〇-tetraazacyclodecane-N，N，，N"，N"，-tetraaceticacid)等造影劑；依達 拉奉（edaravone)等神經保護劑。
[0127] 作為上述蛋白質，可以舉出SOD(超氧化物歧化酶，Superoxide dismutase)、靛酚 氧化酶（indophenoloxidase)等氧化還原酶；IL-10等細胞因子、b-FGF等生長因子、t_PA 等的血栓溶解藥、紅細胞生成素等激素、PSD(突觸后密度蛋白，Postsynaptic density protein)、FNK(抗細胞死亡因子，Anti cell death Factor)等細胞死亡抑制蛋白質； Fab (Fragment)、IgG、IgE 等抗體。
[0128] 作為上述肽，可以舉出環孢菌素 A、JIP-I (JNK-互作蛋白1，JNK-interracting proteinl)等肽藥物。
[0129] 關于上述知識，可適宜地參照在提出本申請時的技術常識。
[0130] 另外，生理活性物質的量沒有特別限定，可根據生理活性物質的種類等適當選擇。
[0131] 作為使pH敏感性載體載帶生理活性物質的方法，可以根據生理活性物質的種類 使用已知的方法。作為該方法，沒有限定，例如作為得到被載體包封的形態及被插入載體內 的形態的方法，可以舉出以下方法：按照上述pH敏感性載體的制造方法形成pH敏感性載體 后，在含有生理活性物質的溶液中浸漬該pH敏感性載體，將生理活性物質攝取到pH敏感性 載體的內部的方法；在上述pH敏感性載體的制造方法中形成有薄膜的容器內，投入含有生 理活性物質的溶液，然后形成締合體，將生理活性物質封入內部的方法等。另外，作為獲得 直接或介由介質結合在載體的表面的形態的方法，可以舉出以下方法：在作為載體的構成 成分的PH敏感性化合物或兩親性物質中導入能與期望的生理活性物質反應的官能團，然 后，使其與生理活性物質反應，由此得到結合有生理活性物質的PH敏感性載體的方法等。 需要說明的是，與所述生理活性物質的結合，可以在制備PH敏感性載體之前，也可以在制 備之后。
[0132] 另外，作為混合pH敏感性載體及生理活性物質的方法，根據生理活性物質的種類 可以使用已知的方法。作為該方法，沒有特別限制，例如可以舉出將載體及生理活性物質混 合在水性溶劑、賦形劑等介質中的方法等。
[0133] 本發明的pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物可以含有其他藥物添加劑。pH敏 感性藥物及PH敏感性藥物組合物可以為片劑、粉末、膠囊等固體制劑的形態，但優選注射 制劑那樣的液體制劑的形態。該液體制劑可以以干燥制品（其在使用時用水或其他適當的 賦形劑進行再生）的形式提供。
[0134] 關于上述片劑及膠囊，利用通常的方法實施腸溶包衣是令人期望的。作為腸溶包 衣，可以利用該領域中通常使用的物質。另外，膠囊也可以含有粉末或液體中的任一者。
[0135] 上述的pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物為液體制劑時，藥物添加劑可以含 有溶劑（例如生理鹽水、滅菌水、緩沖液等）、膜穩定劑（例如膽固醇等）、等滲劑（例如氯 化鈉、葡萄糖、甘油等）、抗氧化劑（例如生育酚、抗壞血酸、谷胱甘肽等）、防腐劑（例如氯 丁醇、對羥基苯甲酸酯（paraben)等）等。上述溶劑可以為在制造 pH敏感性藥物及pH敏 感性藥物組合物時使用的溶劑。
[0136] pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物為固體制劑時，藥物添加劑可以含有賦形 劑（例如乳糖、蔗糖之類的糖類、玉米淀粉之類的淀粉類、結晶纖維素之類的纖維素類、阿 拉伯膠、硅鋁酸鎂、磷酸鈣等）、潤滑劑（例如硬脂酸鎂、滑石、聚乙二醇等）、粘合劑（例如 甘露糖醇、蔗糖之類的糖類、結晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基甲基纖維素等）、崩解劑 (例如馬鈴薯淀粉之類的淀粉類、羧基甲基纖維素之類的纖維素類、交聯聚乙烯吡咯烷酮 等）、著色劑、矯味矯臭劑等。
[0137] pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物可通過直接或凍干后與上述藥物添加劑混 合來制造。將PH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物凍干時，可以在凍干前事先添加適當 的賦形劑。
[0138] 將本發明的pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物用于受試者的治療時的給予 形態沒有特別限定，例如可以舉出口服給予、及靜脈內注射、動脈內注射、皮下注射、皮內注 射、肌肉內注射、椎管內注射、透皮給予或透皮吸收等非口服給予等。例如，使用肽及蛋白質 作為生理活性物質時，優選非口服途徑，特別優選采用皮下注射、皮內注射、肌肉內注射、靜 脈注射的給予。需要說明的是，對于PH敏感性載體及生理活性物質分別獨立地混合而成的 PH敏感性藥物組合物，優選局部給予，具體而言，優選以皮下給予、皮內給予、肌肉內給予的 形態給予。
[0139] 將本發明的pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物給予至受試者，當pH敏感性藥 物及pH敏感性藥物組合物的外部環境變得低于生理pH(例如pH6. 5)時，本發明的pH敏感 性藥物及pH敏感性藥物組合物能夠表現出膜破壞功能促進效果、或膜破壞功能促進效果 及膜融合功能促進效果，特異性且高效地釋放生理活性物質。
[0140] 因此，根據本發明，可以提供疾病的治療或預防方法，包括對需要治療或預防的受 試者口服或非口服給予有效量的上述pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物。
[0141] 上述受試者優選為哺乳動物，特別優選為人。
[0142] 作為上述疾病，例如可以舉出前列腺癌、肺癌、大腸癌、腎癌、胃癌、腦腫瘤、乳腺癌 等癌；HIV(Human Immunodeficiency Virus)、丙型肝炎、乙型肝炎等感染癥疾病；阿爾茨海 默氏病、帕金森病等中樞神經疾病。
[0143] S卩，根據本發明的優選的一個實施方式，提供疾病的治療或預防方法。關于上述知 識，可適宜地參照在提出本申請時的技術常識。
[0144] 另外，本發明的一個實施方式中，pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物也可以通 過培養、向細胞直接輸送生理活性物質。即，根據本發明的一個方式，提供一種用于向細胞 輸送生理活性物質的培養方法。
[0145] 上述培養方法包括在含有pH敏感性藥物及/或pH敏感性藥物組合物的培養基中 培養細胞的步驟。
[0146] 作為上述pH敏感性藥物及pH敏感性藥物組合物，可以舉出如上所述的物質，即， pH敏感性載體載帶至少一種生理活性物質而成的pH敏感性藥物，分別獨立地含有pH敏感 性載體及至少一種生理活性物質的pH敏感性藥物組合物。它們可以單獨使用，也可以組合 2種以上使用。
[0147] 作為上述培養基，沒有特別限制，可以使用已知的培養基。具體可以舉出MEM、 DMEM、RPMI 等。
[0148] 作為pH敏感性藥物、pH敏感性藥物組合物向上述培養基中的添加量，沒有特別限 制，pH敏感性化合物和兩親性物質的總摩爾濃度優選為0. 73 μ mol/L?7. 4mmol/L，更優選 為 7. 3 μ mol/L ?6. Smmol /T,,進一步優選為 8. 0 μ mol/L ?4. 2mmol/L。
[0149] 另外，上述培養基的pH優選為7.0以上，更優選為7. 2?7. 8。培養基的pH為7.0 以上時，能夠防止培養基中的構成pH敏感性載體的pH敏感性化合物的不穩定，故優選。
[0150] 作為上述細胞，沒有特別限制，可以舉出從受試者采集的細胞、經細胞株化的培養 細胞等。
[0151] 此時，作為從上述受試者采集的細胞或經細胞株化的培養細胞的具體例，可以舉 出樹枝狀細胞、NK(自然殺傷細胞，Natural Killer)細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、淋巴細 胞等。
[0152] 上述細胞中，優選使用從受試者采集的細胞，更優選使用從受試者采集的樹枝狀 細胞、NK細胞、T細胞、淋巴細胞等。
[0153] 使用從受試者采集的細胞時，可以通過采血、活組織檢查等從受試者采集該細胞。 艮P，在一個實施方式中，上述培養方法可以包括從受試者采集細胞的步驟。
[0154] 需要說明的是，也可將培養的細胞給予受試者。由此，可以治療或預防受試者的疾 病。即，本發明的一個實施方式中，提供疾病的治療或預防方法。
[0155] 在優選的一個實施方式中，上述治療或預防方法包括：從受試者采集細胞的步驟； 在含有PH敏感性藥物及/或pH敏感性藥物組合物的培養基中對上述采集的細胞進行培養 的步驟；和將上述經培養的細胞給予上述受試者的步驟。
[0156] 由此，可以治療或預防疾病。需要說明的是，上述疾病如上所述。
[0157] 實施例
[0158] 以下，舉出實施例更詳細地說明本發明，但本發明并不受這些實施例的任何限定。
[0159] <原料>
[0160] 實施例中，使用下述化合物。試劑名和產品名相同的情況下產品名省略。
[0161] · EYPC (非氫化蛋黃磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME NC-50)
[0162] · HSPC (大豆磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME NC-21)
[0163] · DDPC (1，2-二癸酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC-1010)
[0164] · DLPC(1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC-1212)
[0165] · DMPC(1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC-4040)
[0166] · DPPC (1，2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC-6060)
[0167] · DSPC (1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC-8080)
[0168] ?0(^(1，2-二油酰_811-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、0^501^10181)
[0169] · POPCd-棕櫚酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰膽堿：日油公司制、C0ATS0ME MC6081)
[0170] · DLPE(1，2-二月桂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司制、C0ATS0ME ME-2020)
[0171] · DMPE(1，2-二肉豆蘧酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司制、C0ATS0ME ME4040)
[0172] · DSPE (1，2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司制、C0ATS0ME ME8080)
[0173] ·D0PE(l，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺：日油公司制、C0ATS0MEME-8181)
[0174] · Chems (膽固醇玻拍酸單酯：Nacalai Tesque公司制）
[0175] .NBD-PE (1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N (7-硝基-2-1，3-苯并噁二 唑-4-基）銨：Avanti polar lipids 公司制）
[0176] .Rh-PE (1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-(麗絲胺堿性蕊香紅B磺酰 氯）銨：Avanti polar lipids 公司制）
[0177] ?脫氧膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0178] ?膽酸鈉 （Nacalai Tesque 公司制）
[0179] ?熊脫氧膽酸鈉（東京化成工業公司制）
[0180] ?鵝脫氧膽酸（東京化成工業公司制）
[0181] ?豬脫氧膽酸（東京化成工業公司制）
[0182] ?膽酸甲酯（東京化成工業公司制）
[0183] ?脫氫膽酸鈉（東京化成工業公司制）
[0184] ?石膽酸（Nacalai Tesque 公司制）
[0185] ?甘氨膽酸鈉（東京化成工業公司制）
[0186] ?牛磺膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0187] ?甘氨脫氧膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0188] ?牛磺脫氧膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0189] ?甘氨熊脫氧膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0190] ?牛磺熊脫氧膽酸鈉 （Nacalai Tesque公司制）
[0191] ?高級膽汁酸（3 α，7 α，12 α -三輕基膽甾燒酸（3 α，7 α，12 a -Trihydroxychole stanoic acid) ：Avanti polar lipids 公司制）
[0192] · 5 β -膽燒酸（Sigma-Aldrich 公司制）
[0193] ?甘草酸單銨（東京化成工業公司制）
[0194] ?甘草亭酸（Nagara Science 公司制）
[0195] ?糖精鈉（和光純藥工業公司制）
[0196] ?甲醇（Nacalai Tesque 公司制）
[0197] ?氯仿（和光純藥工業公司制）
[0198] ?乙酸（和光純藥工業公司制）
[0199] ?乙酸鈉（關東化學公司制）
[0200] · MES-Na (Merck 公司制）
[0201] · Hepes-Na (Nacalai Tesque 公司制）
[0202] ?氯化鈉（關東化學公司制）
[0203] · Pyranine (東京化成工業公司制）
[0204] .DPX(對二甲苯雙批陡氫溴酸鹽，p-xylene-bis-pyridinium bromide :Molecular probes公司制）
[0205] · PBS (憐酸緩沖鹽：Takara Bio 公司制、PBS Tablets)
[0206] ?聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯（Tween20、40、60、80、65、85 :東京化成工業公 司制）
[0207] · PEG20-硬脂基醚（聚氧乙烯20-硬脂基醚：和光純藥工業公司制）
[0208] · PEG23-月桂基醚（聚氧乙烯23-月桂基醚：和光純藥工業公司制）
[0209] ?失水山梨糖醇脂肪酸酯（SPAN20 :Nacalai Tesque公司制-失水山梨糖醇單月 桂酸酯、SPAN40、60 :東京化成工業公司制、SPAN80 :Nacalai Tesque公司制-失水山梨糖醇 單油酸酯、65 :和光純藥工業公司制、失水山梨糖醇三硬脂酸酯、SPAN85 :東京化成工業公 司制）
[0210] ?單癸酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monocaprin)
[0211] ?單辛酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monocaprylin)
[0212] ?單月桂酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monolaurin)
[0213] ?單肉豆蘧酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monomyristin)
[0214] ?單棕櫚酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monopalmitin)
[0215] ?單硬脂酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monostearin)
[0216] ?單油酸甘油酯（東京化成工業公司制、Monoolein)
[0217] ?二月桂酸甘油酯（東京化成工業公司制、α α二月桂酸酯）
[0218] ?二硬脂酸甘油酯（和光純藥工業公司制）
[0219] ?二油酸甘油酯（和光純藥工業公司制）
[0220] ?聚氧乙烯蓖麻油（和光純藥工業公司制、聚氧乙烯10蓖麻油）
[0221] ?聚氧乙烯氫化蓖麻油（10 :和光純藥工業公司制、聚氧乙烯10氫化蓖麻油、40 :日 油公司制、Uniox HC-40、60:日油公司制、Uniox HC-60)
[0222] · 1-丁醇（Nacalai Tesque 公司制）
[0223] · 1-辛醇（Nacalai Tesque 公司制）
[0224] · 1-十二烷醇（東京化成工業公司制）
[0225] · 1-十六燒醇（Nacalai Tesque 公司制）
[0226] · 1-二十烷醇（東京化成工業公司制）
[0227] ?月桂酸（Nacalai Tesque 公司制）
[0228] ?油酸鈉 （Nacalai Tesque 公司制）
[0229] ?辛酸乙酯（Nacalai Tesque 公司制）
[0230] ?月桂酸乙酯（東京化成工業公司制）
[0231] ?油酸乙酯（Nacalai Tesque 公司制）
[0232] ?乳糖（Nacalai Tesque 公司制）
[0233] · L-亮氨酸（Nacalai Tesque 公司制）
[0234] · L-組氨酸（Nacalai Tesque 公司制）
[0235] ?大豆油（Nacalai Tesque公司制、大豆油）
[0236] ?角藍燒（Nacalai Tesque 公司制）
[0237] ?角藍烯（Nacalai Tesque 公司制）
[0238] · α -生育酚（Nacalai Tesque 公司制、DL-α -生育酚）
[0239] ?生育酚乙酸酯（Nacalai Tesque公司制、乙酸DL- α -生育酚）
[0240] ?苯甲酸節酯（Nacalai Tesque公司制）
[0241] ?對羥基苯甲酸芐酯（東京化成工業公司制）
[0242] ?棕櫚酸抗壞血酸酯（LKT Laboratories公司制）
[0243] ?阿拉伯膠（Nacalai Tesque公司制、阿拉伯膠粉末）
[0244] ?明膠（Nacalai Tesque公司制、明膠精制粉末）
[0245] ?環糊精（Nacalai Tesque 公司制）
[0246] ?甲基纖維素 （Nacalai Tesque公司制）
[0247] ?礦物油（Nacalai Tesque 公司制）
[0248] ?石錯（Nacalai Tesque 公司制）
[0249] ?氫氧化鈉水溶液（0· lmol/L :Nacalai Tesque 公司制）
[0250] ·鹽酸（0· lmol/L、lmol/L :Nacalai Tesque 公司制）
[0251] · Triton-XlOO (和光純藥工業公司制、Triton X100)
[0252] ?模型肽：0VA257_264(SIINFEKL，PH Japan 委托合成）
[0253] ?熒光標記肽：0VA257-264_Rh (PH Japan 委托合成）
[0254] ?模型蛋白：0VA (Sigma-Aldrich 公司制）
[0255] ?胰蛋白酶（Life technologies 公司制）
[0256] · EDTA(乙二胺四乙酸：Nacalai Tesque 公司制）
[0257] · β-gal (和光純藥工業公司制、β-D-半乳糖苷酶）
[0258] · FBS(胎牛血清：國產化學公司制）
[0259] · MEM(極限必需培養基：Nacalai Tesque公司制，Eagle' s MEM、含L -谷氨酰胺 的液體）
[0260] ?沒有酌·紅的 DMEM(Nacalai Tesque 公司制、Dulbecco 改良 Eagle 培養基 4. 5g/ 1，不含葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸及酚紅的液體）
[0261] · DMEM(Nacalai Tesque 公司制、Dulbecco 改良 Eagle 培養基）
[0262] ?磷酸氯喹（Nacalai Tesque 公司制）
[0263] · IsoFlow(Beckman Coulter 公司制）
[0264] 〈試樣的制作〉
[0265] (pH敏感性載體的制備）
[0266] 將溶解在甲醇（或氯仿）中的IOOOnmol兩親性物質、和溶解在甲醇（或氯仿）中 的pH敏感性化合物或備選化合物在IOmL茄形瓶中混合，利用旋轉蒸發儀（BuCHI)制成薄 膜。需要說明的是，對兩親性物質與PH敏感性化合物或備選化合物的比率進行了調整，使 其成為所期望的比率（摩爾比100 :1〇、1〇〇 :20、100 :640等）。另外，使用多種兩親性物質 時，對兩親性物質的總量進行了調整，使得成為期望的摩爾數（IOOOnmol)。
[0267] 向制作的薄膜中添加 MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mMpH7. 4) lmL，使用超聲波 照射裝置（USC-J)在常溫下照射超聲波1分鐘使其分散，得到含有作為目標的pH敏感性載 體的水性溶液（載體的分散液）。
[0268] (比較例的載體的制備）
[0269] (EYPC 單獨及 DLPC 單獨）
[0270] 將溶解在氯仿中的IOOOnmol的EYPC或DLPC裝入IOmL茄形瓶中，利用旋轉蒸發 儀（BuCHI)制成薄膜。
[0271] 向制作的薄膜中添加 MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM pH7. 4) lmL，使用超聲波 照射裝置（USC-J)在常溫下照射超聲波1分鐘，使其分散，得到EYPC單獨或DLPC單獨的分 散液。
[0272] (含有高分子材料的載體）
[0273] 與pH敏感性載體的制備法同樣地，制備了 pH敏感性化合物和高分子材料的薄膜， 并制備了載體。對于阿拉伯膠、明膠、甲基纖維素、礦物油、或石蠟的高分子材料來說，使用 1600nmol的pH敏感性化合物的1/5倍、1倍、5倍的質量。
[0274] (pH敏感性脂質體）
[0275] 與pH敏感性載體的制備法同樣地，制備了 DOPE和Chems或油酸的薄膜，并制備了 脂質體。需要說明的是，對于作為pH敏感性脂質體的DOPE-Chems (DOPE =Chems = 3 :2 (摩 爾比））、及DOPE-油酸（DOPE :油酸=7 :3(摩爾比））來說，使用IOOOnmol的DOPE、期望量 的Chems或油酸、和ImL的MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM ρΗ7· 4)進行制備。
[0276] (含肽載體及含蛋白質載體的制備）
[0277] 相對于兩親性物質lOOOnmol，量取0?1536μ g的模型肽的 0VA257-264(SIINFEKL)或模型蛋白的 0VA，使其溶解在 MES 緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM pH7. 4) ImL中。通過使用所述溶液制備載體，得到含有肽或蛋白質的載體的分散液。
[0278] 在使用熒光標記肽的0VA257-264_Rh的情況下，相對于兩親性物質lOOOnmol， 使用140 μ g/mL的熒光標記肽進行制備，在使用β-gal的情況下，相對于兩親性物質 IOOOnmol，使用I. 4mg的β -gal進行制備。
[0279] <測定方法>
[0280] (透過度的測定）
[0281] 向 MES 緩沖液（MES :25mM、NaCl : 125mM pH7. 4) 250 μ L 中加入載體的分散液 25〇μ L，制成測定溶液。使用UV-2450,在常溫下測定500nm處的透過度。
[0282] (ζ電勢及粒徑的測定）
[0283] ζ電勢的測定如下進行，向調節為ρΗ7· 4的I. OmL的Hepes緩沖液（Hepes : I. OmM) 中加入載體的分散液20?50 μ L，制成測定溶液。使用Nan〇ZS90實施多次測定，對得到的 ξ電勢的值進行平均，作為載體粒子的ξ電勢。
[0284] (粒徑及多分散指數的測定）
[0285] 粒徑及多分散指數（PDI :Polydispersity Index)的測定如下進行，向MES緩沖 液_5:25禮、似(：1:1251111?!17.4)中加入適當量的載體的分散液，作為測定溶液。使用 Nan〇ZS90實施多次測定，將利用動態光散射測定得到的Z-average (半徑）的值進行平均， 將其2倍的值作為Diameter (直徑、粒徑）。對于ΗΠ 的值，通過將多次測定得到的ΗΠ 的 值進行平均而求出。
[0286] (溶出性試驗=Leakage (溶出率）的測定）
[0287] 關于 Leakage (溶出率），根據 K. Kono 等，Bioconjugate Chem. 2008 19 1040-1048 中記載的方法，使用包封有作為熒光物質的Pyranine和作為消光劑的DPX的EYPC脂質體 進行評價。
[0288] 稱量溶解在氯仿中的3000nmol的EYPC，將其放入IOmL茄形瓶，使用旋轉蒸 發儀（BuCHI)制成薄膜。力[]入 Pyranine 溶液（Pyraine :35mM、DPX :5〇mM、MES :25mM、 pH7. 4) 500 μ L，使用超聲波照射裝置（USC-J)使其分散，然后，使用擠出機通過孔徑IOOnm 的聚碳酸酯膜，使粒徑一致。使用MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM pH7. 4)和G100柱 進行外水層的置換，得到包封有熒光物質的EYPC脂質體分散液。使用磷脂C-Test Wako求 出磷脂膽堿基的濃度，使用MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM pH7. 4)調整濃度，使得磷 脂為 I. Ommol/L〇
[0289] 將濃度經調整的EYPC脂質體分散液20 μ L、和載體或者pH敏感性化合物單獨或兩 親性化合物單獨等評價樣品分散液20 μ L投入到調整為各種pH的MES緩沖液（MES :25mM、 NaCl :125mM) 2960 μ L中，在37°C下孵育90或30分鐘后（實施例中，只要沒有特別記載， 均為90分鐘的結果）、使用分光光度計FP-6500觀察Ex416、Em512nm的熒光，由此監測 Leakage。DOPE-Chems、及DOPE-油酸在乙酸緩沖液（乙酸：25mM、NaCl :125mM)中進行測 定。另外，在其他樣品中，PH4. 0?pH3. 0的測定也使用乙酸緩沖液實施。
[0290] 需要說明的是，將僅EYPC脂質體分散液的情況作為0%，將加入了 30 μ L稀釋了 10倍的Triton-XlOO的情況的值作為100%，算出溶出率。
[0291] 具體而言，溶出率根據下式進行計算。需要說明的是，在下式中，將測定的熒光強 度表示為L，將僅使用包封有熒光物質的EYPC脂質體分散液時的熒光強度表示為L tl，將加 入了 Triton-XlOO時的熒光強度表示為L1(l。。
[0292] 溶出率（％) = (L-L0Vai00 - L0) X 100
[0293] (膜融合試驗：Fusi〇n (膜融合）的測定）
[0294] 關于 Fusion (膜融合），根據 K. Kono 等，Biomaterials 2008 29 4029-4036 中記 載的方法，利用FRET(突光共振能量轉移,Fluorescence Resonance Energy Transfer)進 行評價。熒光標記使用NBD-PE、Rh-PE。
[0295] 制作相對于 EYPC含有 0. 6mol % 的 NBD-PE、及 Rh-PE 的 EYPC (EYPC IOOOnmol)的薄 膜，加入ImL的MES緩沖液（MES :25mM、NaCl :125mM pH7. 4)，使用超聲波照射裝置（USC-J) 使其分散，然后使用擠出機通過孔徑IOOnm的聚碳酸酯膜，得到經雙重熒光標記的EYPC脂 質體分散液。將經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液20 μ L、和載體、或pH敏感性化合物單 獨、兩親性化合物單獨等評價樣品分散液20 μ L投入到調制成各種pH的MES緩沖液（MES : 25mM、NaCl :125mM)2960y L中，在37°C下孵育60分鐘，然后使用分光光度計（FP-6500)測 定基于450nm的激發光的500nm?620nm的熒光光譜，求出520nm和580nm的熒光強度比。
[0296] 融合率如下計算：將孵育上述得到的經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液和兩 親性物質時的熒光強度比作為〇%，將經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液和pH敏感性載 體或兩親性物質的分散液用甲醇處理時的熒光強度比作為100%。甲醇處理如下實施：將 經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液、和pH敏感性載體或者pH敏感性化合物單獨或兩親 性化合物單獨等評價樣品分散液這兩者溶解于甲醇，然后使用旋轉蒸發儀（BuCHI)制成薄 膜，使用3. OmL的MES緩沖液（25mM :MES、125mM :NaCl)和超聲波照射裝置（USC-J)使其分 散。
[0297] 具體而言，融合率根據下式計算。需要說明的是，在下式中，將測定得到的熒光強 度比表示為R，孵育經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液和兩親性物質時的熒光強度比表 示為R 0,經雙重熒光標記的EYPC脂質體分散液和載體或pH敏感性化合物單獨、兩親性化合 物單獨等評價樣品分散液進行甲醇處理而得到的熒光強度比表示為R ltltlt5
[0298] 融出率（％) = (R-R0V(R100-R0) X100
[0299] (對于細胞膜的膜融合的確認）
[0300] pH敏感載體對于實際的細胞膜也誘發膜融合，使用HeLa細胞進行了確認。
[0301] 在給予pH敏感性載體的前一天，將HeLa細胞接種在松浪玻璃底皿上，在含有10% FBS的DMEM中培養。此時，使用5% CO2、設定為37°C的恒溫箱（MC020AIC)來實施培養。孵 育后，使用含有10% FBS的DMEM洗滌細胞。接著，將使用氫氧化鈉水溶液或鹽酸將pH調節 為7. 4的、含有25mM的H印es及50 μ M的磷酸氯喹的2. OmL DMEM添加到細胞中，進行1小 時預孵育。
[0302] 需要說明的是，在ρΗ5. 3下進行實驗時，將使用氫氧化鈉水溶液或鹽酸將pH調節 為5. 3的、含有25mM的MES及50 μ M的磷酸氯喹的2. OmL DMEM添加到細胞中，進行1小時 預孵育。
[0303] 預孵育后，在具有規定pH的介質中添加相對于兩親性物質為0. 6mol %的用Rh-PE 進行了熒光標記的pH敏感性載體的分散液100 μ L，進行2小時孵育。將細胞在未添加 酚紅的DMEM中至少洗滌3次，然后使用熒光顯微鏡（Axiovert200M-軟件：Axio vision 3.0-光源：Fluo Arc)進行觀察。需要說明的是，細胞的熒光強度如下評價，對于洗滌后的 細胞，使用含有〇. 〇25被％的胰蛋白酶及0. Olwt%的EDTA的PBS剝離細胞，使用流式細胞 儀（Cytomics FC500,軟件：CXP ver2)進行評價。
[0304] (使用了熒光標記肽的細胞質基質遞送的評價）
[0305] 選擇0VA257-264-Rh作為模型肽。使用通過了 0. 22 μ m的濾膜的PBS制備140 μ g/ mL的熒光標記肽溶液，用于載體的制備。細胞使用RAW細胞，培養使用5% CO2、設定為37°C 的恒溫箱（MC020AIC)來實施。在給予載體的前一天，將RAW細胞接種在松浪玻璃底皿上， 在含有10% FBS的MEM介質中進行培養。用PBS洗滌細胞后，置換為新的1900 μ L的含有 10% FBS的MEM介質，分別給予100 μ L的樣品。進行16?20小時孵育，將細胞用PBS至 少清洗3次。然后，添加新的含有10 % FBS的MEM介質2mL，進行3小時后孵育。用PBS 洗滌細胞，置換為不添加酚紅的DMEM介質后，使用熒光顯微鏡（AXi〇Vert200M-軟件:Axio vision 3.0-光源：Fluo Arc)觀察細胞。
[0306] ( β -gal的細胞質基質遞送）
[0307] 使用通過了 0. 22 μ m的濾膜的PBS，制備I. 4mg/mL的β -gal溶液。在由IOOOnmol 的DLPC和1600nmol的脫氧膽酸或熊脫氧膽酸形成的混合薄膜中，使用制備的β -gal溶液 使其分散，制備含β-gal的載體。在給予前一天將RAW細胞接種在松浪玻璃底皿上進行培 養，在即將給予之前用PBS洗滌細胞。培養使用5% CO2、設定為37°C的恒溫箱（MC020AIC)、 及含有10% FBS的MEM介質來實施。置換為新的1900 μ L的含有10% FBS的MEM介質，分 別給予100 μ L的樣品，進行16?20h孵育。將細胞用PBS至少洗滌3次，然后添加新的含 有10% FBS的MEM介質2mL，進行3小時后孵育。用PBS洗滌細胞，使用β-Galactosidase Staining Kit (從Takara Bio購入）將細胞染色，使用顯微鏡（Axiovert200M_軟件：Axio vision 3. 0)觀察細胞。染色根據試劑盒的推薦實施。
[0308] (分別獨立使用pH敏感性載體及生理活性物質時的向細胞質基質的遞送評價）
[0309] 在前一天將RAW細胞接種在松浪玻璃底皿上，在含有10% FBS的MEM中進行培養。 用PBS洗滌后，添加 MEM，進行1小時孵育。制備以30 μ g/mL的濃度含有熒光標記肽-FITC、 或熒光標記OVA-FITC的1900 μ L的MEM，與培養介質進行置換。進而，添加100 μ L的pH敏 感性載體的制備溶液，在培養介質中以兩者混合的狀態進行16?20小時孵育。確認了熒 光標記肽-FITC及熒光標記OVA-FITC在與含有pH敏感性載體的溶液的混合狀態下，不被 載帶于pH敏感性載體上。用PBS洗漆，用2mL的新的MEM進行3小時的后孵育后，用PBS 洗滌細胞，置換為未添加酚紅的DMEM，使用熒光顯微鏡觀察細胞。培養使用5% CO2、設定 為37°C的恒溫箱（MC020AIC)來實施，使用熒光顯微鏡（Axiovert200M-軟件:Axio vision 3.0-光源：Fluo Arc)來實施細胞的觀察。
[0310] (1)關于脫氧膽酸的復合化
[0311] 首先，評價脫氧膽酸和兩親性物質的復合化。
[0312] 根據上述pH敏感性載體的制備，制作IOOOnmol的EYPC或DLPC與各種量（0? 6400nmol)的脫氧膽酸的混合薄膜，加入ImL的pH7. 4MES緩沖液，照射超聲波，分別制備脫 氧膽酸經復合化的分散液。以各種濃度含有脫氧膽酸的、含有EYPC和脫氧膽酸的分散液的 照片示于圖2A，將以各種濃度含有脫氧膽酸的、含有DLPC和脫氧膽酸的分散液的照片示于 圖2B。需要說明的是，圖2A、圖2B從左邊開始依次為含有0nmol、50nmol、100nmol、200nmol、 400nmol、800nmol、1600nmol、3200nmol、6400nmol 的脫氧膽酸的、IOOOnmol 脂質的分散液。 對于EYPC、DLPC中的任一種脂質也同樣，脂質單獨的分散液發生白濁，相對于此，與脫氧膽 酸復合化的產物依賴于復合化量而形成澄清溶液。
[0313] 另外，測定各分散液的500nm處的透過度，結果得到與目視同樣的傾向。圖2C為 測定含有EYPC和脫氧膽酸的分散液的透過度的結果，圖2D為測定含有DLPC和脫氧膽酸的 分散液的透過度的結果。這些結果表示脫氧膽酸和脂質形成了復合體（締合體）。以下，將 脫氧膽酸和脂質的復合體也稱作"脂質-脫氧膽酸復合體"。
[0314] 接下來，研究了這些分散液的ζ電勢。圖3為相對于脫氧膽酸量的、含有EYPC和 脫氧膽酸的分散液（圖中，EYPC-脫氧膽酸復合體）、及含有DLPC和脫氧膽酸的分散液（圖 中，DLPC-脫氧膽酸復合體）的ζ電勢測定結果。需要說明的是，圖3的結果為5次不同 的測定的平均值，土為SD。
[0315] 伴隨脫氧膽酸的復合化，兩分散液的值降為負值。這意味著具有負電荷的脫氧膽 酸與脂質進行復合化，顯示形成了脫氧膽酸和脂質混合存在的復合體。使用任一種脂質時， 脫氧膽酸為1600nmol的復合化量時，ζ電勢顯示約-30mV的值，復合化量為這以上時，ζ 電勢的值沒有大幅降低。因此，認為在該復合化量時，脫氧膽酸充分覆蓋形成的復合體的表 面而進行復合化。
[0316] (2)關于復合體的結構
[0317] 根據上述pH敏感性載體的制備，相對于IOOOnmol的DLPC使用1600nmol的脫氧 膽酸來制備復合體，進行該復合體的熒光物質保持實驗（使用Pyranine溶液使薄膜分散的 實驗），結果該復合體中未保持突光物質。由于復合體無法保持突光物質，所以表明該復合 體不是中空結構，而是膠束的形狀（data not shown)。
[0318] 接著，測定根據上述pH敏感性載體的制備得到的各種復合體的粒徑。基于動態 光散射測定的粒徑測定的結果，可知EYPC-脫氧膽酸復合體（EYPC :脫氧膽酸=IOOOnmol : 1600nmol)的粒徑（Diameter)約為73nm，DLPC-脫氧膽酸復合體（DLPC :脫氧膽酸= IOOOnmol :1600nmol)的粒徑（Diameter)約為43nm大小的粒子（表1)。另外，它們的多分 散指數（PDI)為0. 26和0. 07這樣小的值，明確了脫氧膽酸和脂質的復合體為小且均勻的 粒子。
[0319] 表1.粒徑和PDIs
[0320]
【權利要求】
1. 一種pH敏感性載體，其表現膜破壞功能促進效果，所述載體包含： 選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、高級膽汁酸、甘氨脫氧膽 酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種pH敏感性化合物；和 選自碳原子數10?12的磷脂酰膽堿、碳原子數12?18的聚氧乙烯山梨糖醇酐單脂 肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、二硬 脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及a -生育酚中的至少一種兩親性物質。
2. 如權利要求1所述的pH敏感性載體，其中，所述pH敏感性化合物和所述兩親性物質 形成膠束狀的粒子。
3. 如權利要求2所述的pH敏感性載體，其中，粒徑為10?200nm。
4. 如權利要求1?3中任一項所述的pH敏感性載體，其中，所述pH敏感性化合物相對 于所述兩親性物質100摩爾以10摩爾以上的比例被含有。
5. 如權利要求1?4中任一項所述的pH敏感性載體，其中，將溶出性試驗中的pH敏感 性化合物單獨的溶出率作為La，將兩親性物質單獨的溶出率作為Lb，將pH敏感性載體的溶 出率作為Lc， 將PH7. 4的溶出率分別表示為Lc7.4、La7.4、Lb 7.4，將pH5. 0或4. 5的溶出率分別表示為 Lcx、Lax、Lbx時，下述式（1)表示的A為5以上，下述式⑵表示的A '為5以上， 式（1) A = (Lcx - Lc7.4) - (Lax - La7.4) 式（2) A，= Lcx - (Lax+Lbx)。
6. -種pH敏感性藥物，是權利要求1?5中任一項所述的pH敏感性載體載帶生理活 性物質形成的。
7. 如權利要求6所述的pH敏感性藥物，其中，所述生理活性物質為蛋白質或肽。
8. -種pH敏感性藥物組合物，包含權利要求1?5中任一項所述的pH敏感性載體及 生理活性物質。
9. 如權利要求8所述的pH敏感性藥物組合物，其中，所述生理活性物質為蛋白質或肽。
10. 下述pH敏感性載體的制造方法，所述pH敏感性載體表現膜破壞功能促進效果，所 述方法包括使pH敏感性化合物與兩親性物質締合的步驟， 所述pH敏感性化合物為選自脫氧膽酸、膽酸、熊脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、豬脫氧膽酸、 高級膽汁酸、甘氨脫氧膽酸、甘草酸、甘草亭酸及它們的鹽中的至少一種， 所述兩親性物質為選自碳原子數10?12的磷脂酰膽堿、碳原子數12?18的聚氧乙 烯山梨糖醇酐單脂肪酸酯、碳原子數16?18的失水山梨糖醇脂肪酸酯、單油酸甘油酯、二 月桂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、二油酸甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油及a -生育酚中的至少一 種。
11. 一種培養方法，包括在下述培養基中培養細胞的步驟，所述培養基含有權利要求6 或7所述的pH敏感性藥物、及/或權利要求8或9所述的pH敏感性藥物組合物。
【文檔編號】A61K47/14GK104334194SQ201380028497
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年5月24日 優先權日:2012年5月31日
【發明者】坂口奈央樹 申請人:泰爾茂株式會社