分化無核細胞及其制備方法

分化無核細胞及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種分化無核細胞及其制備方法。所述方法包括：在誘導分化成紅細胞的試劑存在下培養條件永生化造血干細胞，其中所述試劑為IL-3和EPO；其中所述試劑將條件永生化造血干細胞誘導分化為成熟紅細胞。所述紅細胞可以治療選自由以下組成的群組的病癥：表征為成熟紅細胞的缺陷的病癥、表征為失血的病癥、貧血、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球減少癥、血小板減少癥、粒細胞減少和血友病。
【專利說明】分化無核細胞及其制備方法
[0001] 本申請是申請日為2009年7月21日、申請號為200980126312.4、發明名稱為“分化無核細胞及其制備方法”的發明專利申請的分案申請。
[0002] 相關申請案交叉參考
[0003]本申請案主張2008年7月21日申請的標題為分化細胞及其制備方法(Differentiated Cells and Processes for Preparing the Same)的美國臨時申請案第61/082,410號的優先權，其全部內容以引用方式并入本文中。
【技術領域】
[0004]本申請涉及分化無核細胞及其制備方法。
【背景技術】
[0005]無核細胞包括(但不限于)紅細胞及凝血細胞。紅細胞及凝血細胞來源于造血干細胞分化。

【發明內容】

[0006]在某些實施例中，本發明揭示制備多種無核細胞的方法，其包含:在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養條件永生化干細胞；其中通過以下來產生所述條件永生化干細胞:(a)使用第一載體轉染多種干細胞，所述第一載體包含編碼MYC分子的核酸序列；(b)使用第二逆轉錄病毒載體轉染所述干細胞，所述第二載體包含編碼Bcl-2、Bcl-X或其組合的核酸序列；及(c)將所述干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的活性。在一些實施例中，引導朝向無核細胞分化的細胞因子是IL-3、EP0或其組合。在一些實施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其組合。在一些實施例中，第一載體進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，所述方法進一步包含誘導Myc分子移位至細胞核。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞與雌二醇(E2)、4_羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是鼠科動物干細胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV- (IRES) -GFP或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV-(IRES)-GFP，且進一步包含土撥鼠乙型肝炎病毒RNA調控元件(WRE)。
[0007]在某些實施例中，本發明揭示產生多種無核細胞的方法，其包含:在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養條件永生化干細胞；其中通過以下來產生所述條件永生化干細胞:(a)使多種干細胞與外源合成的第一肽接觸，所述第一肽包含移位至細胞核的MYC分子；(b)使所述干細胞與外源合成的第二肽接觸，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其組合；及(c)將所述干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；且其中在分化之前使所述第一肽與所述條件永生化干細胞不接觸。在一些實施例中，第一肽進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，第一肽、第二肽、或第一肽與第二肽二者包含轉運蛋白序列。在一些實施例中，第一蛋白質、第二蛋白質、或第一蛋白質與第二蛋白質二者包含TAT序列。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。
[0008]在某些實施例中，本發明揭示制備多種無核細胞的方法，其包含:(a)使用第一載體轉染多種干細胞(例如，造血干細胞)，所述第一載體包含編碼MYC分子的核酸序列；(b)使用第二 Y逆轉錄病毒載體轉染所述多種干細胞(例如，造血干細胞)，所述第二載體包含編碼Bcl-2、Bcl-X或其組合的核酸序列；(c)將所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；(d)抑制所述Myc分子的活性 '及(c)在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養所述條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，引導朝向無核細胞分化的細胞因子是IL-3、EPO或其組合。在一些實施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc, s-Myc或其組合。在一些實施例中，第一載體進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，所述方法進一步包含誘導Myc分子移位至細胞核。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是鼠科動物干細胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV-(IRES )-GFP或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV-(IRES)-GFP，且進一步包含土撥鼠乙型肝炎病毒RNA調控元件(WRE)。
[0009]在某些實施例中，本發明揭示產生多種無核細胞(例如，造血干細胞)的方法，其包含:(a)使多種干細胞(例如，造血干細胞)與以下物質接觸:(i)外源合成的第一肽，其包含移位至細胞核的MYC分子；及(ii)外源合成的第二肽，其包含Bcl-2、BCL-X或其組合；(b)將所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；(c)移除第一肽；及(d)在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養所述條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，第一肽進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，第一肽、第二肽、或第一肽與第二肽二者包含轉運蛋白序列。在一些實施例中，第一蛋白質、第二蛋白質、或第一蛋白質與第二蛋白質二者包含TAT序列。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。
[0010]在某些實施例中，本發明揭示根據本文所揭示方法制備的凝血細胞。
[0011]在某些實施例中，本發明揭示根據本文所揭示方法制備的紅細胞。
[0012]在某些實施例中，本發明揭示治療特征在于缺乏無核細胞的病癥的方法，其包含:投予根據本文所揭示方法制備的無核細胞。在一些實施例中，所述病癥是貧血(例如，再生障礙性貧血、惡性貧血、缺鐵性貧血、鐮狀細胞性貧血、球形細胞增多癥、溶血性貧血)、高歇氏病(Gaucher' s disease)、溶血、嗜中性白血球減少癥、血小板減少癥、粒細胞減少、血友病、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin' s lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt' s lymphoma)、濾泡樣淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性髓樣白血病、前B急性淋巴細胞白血病、前T急性淋巴細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、難治性白血病或其組合。在某些情形下，特征在于缺乏無核細胞的病癥是由化學療法引起(部分或完全)。在一些實施例中，通過本發明所揭示方法產生的無核細胞與化學療法共投予。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]本發明的新穎特征詳細闡述于隨附權利要求書中。參考闡述利用本發明原理的例示性實施例的下文詳細說明和附圖將會更好地了解本發明的特征及優點，在附圖中:
[0014]圖1顯示產生ctlt-造血干細胞系的途徑。圖1A顯示用于使用Myc-ER及Bcl_2轉導原代鼠科動物HSC細胞的逆轉錄病毒構建體的圖示。圖1B顯示自5-氟尿嘧啶治療供體獲得的HSC在轉導后的FACS 分析。圖1C顯示移植經轉導HSC的小鼠中白血病發生的動力學。圖1D顯示自白血病小鼠的骨髓回收后不久ctlt-造血干細胞的FACS分析。圖1E顯示已建立ctlt-造血干細胞系的FACS分析。圖1F顯示C57/BL6小鼠骨髓的正常未經處理造血干細胞中干細胞標記的FACS分析。
[0015]圖2顯示通過逆轉錄病毒插入物的PCR擴增而實施的ctlt-造血干細胞系的無性系形成能力的分析。
[0016]圖3顯示在移植ctlt-造血干細胞后產生的成熟免疫細胞的表征。圖3A顯示移植后淋巴組織中衍生自ctlt-造血干細胞的細胞頻率。圖3B顯示骨髓中GFP+髓系細胞的檢測。圖3C顯示脾中外周成熟淋巴細胞的分析。圖3D顯示ctlt-造血干細胞第二連續傳代后移植物受體小鼠中外周成熟淋巴細胞的分析。
[0017]圖4顯示ctlt-造血干細胞長期拯救而脫離致死輻照的危險。
[0018]圖5顯示ctlt-造血干細胞在活體外分化成表達Ter-119的紅系祖細胞(erythroid progenitor)。
[0019]圖6顯示致死輻照后通過ctlt-造血干細胞移植物實施的活體內紅細胞重構的視圖。
[0020]圖7顯示致死輻照后通過ctlt-造血干細胞移植物實施的活體內紅細胞重構的視圖。
[0021]圖8顯示致死輻照后通過ctlt-造血干細胞移植物實施的活體內紅細胞重構的視圖。
【具體實施方式】
[0022]本發明揭示制備多種無核細胞的方法、所得無核細胞以及儲存及使用所述無核細胞的方法。具體來說，自經合適基因及/或蛋白質修飾的干細胞(統稱為改造的干細胞)離體產生所述無核細胞。所述改造的干細胞是有核干細胞，且進一步經條件永生化。所述改造的有核干細胞通過使細胞失去條件永生化并視需要分化而提供無核細胞。
[0023]在某些實施例中，本發明揭示制備多種無核細胞的方法，其包含:在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養條件永生化干細胞；其中通過以下來產生所述條件永生化干細胞:(a)使用第一載體轉染多種干細胞，所述第一載體包含編碼MYC分子的核酸序列；(b)使用第二逆轉錄病毒載體轉染所述干細胞，所述第二載體包含編碼Bcl-2、Bcl-X或其組合的核酸序列；及(c)將所述干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的活性。在一些實施例中，引導朝向無核細胞分化的細胞因子是IL-3、EP0或其組合。在一些實施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc或其組合。在一些實施例中，第一載體進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，所述方法進一步包含誘導Myc分子移位至細胞核。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞與雌二醇(E2)、4_羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是鼠科動物干細胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV- (IRES) -GFP或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV-(IRES)-GFP，且進一步包含土撥鼠乙型肝炎病毒RNA調控元件(WRE)。
[0024]在某些實施例中，本發明揭示產生多種無核細胞的方法，其包含:在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養條件永生化干細胞；其中通過以下來產生所述條件永生化干細胞:(a)使多種干細胞與外源合成的第一肽接觸，所述第一肽包含移位至細胞核的MYC分子 ；(b)使所述干細胞與外源合成的第二肽接觸，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其組合；及(c)將所述干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；且其中在分化之前使所述第一肽與所述條件永生化干細胞不接觸。在一些實施例中，第一肽進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，第一肽、第二肽、或第一肽與第二肽二者包含轉運蛋白序列。在一些實施例中，第一蛋白質、第二蛋白質、或第一蛋白質與第二蛋白質二者包含TAT序列。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。
[0025]在某些實施例中，本發明揭示制備多種無核細胞的方法，其包含:(a)使用第一載體轉染多種干細胞(例如，造血干細胞)，所述第一載體包含編碼MYC分子的核酸序列；(b)使用第二 Y逆轉錄病毒載體轉染所述多種干細胞(例如，造血干細胞)，所述第二載體包含編碼Bcl-2、Bcl-X或其組合的核酸序列；(c)將所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；(d)抑制所述Myc分子的活性 '及(c)在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養所述條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，引導朝向無核細胞分化的細胞因子是IL-3、EPO或其組合。在一些實施例中，MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc, s-Myc或其組合。在一些實施例中，第一載體進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，所述方法進一步包含誘導Myc分子移位至細胞核。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是鼠科動物干細胞病毒(MSCV)或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV-(IRES)-GFP或其衍生物。在一些實施例中，第一載體、第二載體、或第一載體與第二載體二者是MSCV- (IRES) -GFP,且進一步包含土撥鼠乙型肝炎病毒RNA調控元件(WRE)。
[0026]在某些實施例中，本發明揭示產生多種無核細胞(例如，造血干細胞)的方法，其包含:(a)使多種干細胞(例如，造血干細胞)與以下物質接觸:(i)外源合成的第一肽，其包含移位至細胞核的MYC分子；及(ii)外源合成的第二肽，其包含Bcl-2、BCL-X或其組合；(b)將所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養；(c)移除第一肽；及(d)在至少一種引導朝向無核細胞分化的細胞因子存在下培養所述條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，第一肽進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。在一些實施例中，第一肽、第二肽、或第一肽與第二肽二者包含轉運蛋白序列。在一些實施例中，第一蛋白質、第二蛋白質、或第一蛋白質與第二蛋白質二者包含TAT序列。在一些實施例中，所述方法進一步包含使所述多種干細胞(例如，造血干細胞)與雌二醇(E2)、4-羥基他莫昔芬(4-OHT)或二者接觸。
[0027]在某些實施例中，本發明揭示根據本文所揭示方法制備的凝血細胞。
[0028]在某些實施例中，本發明揭示根據本文所揭示方法制備的紅細胞。
[0029]在某些實施例中，本發明揭示治療特征在于缺乏無核細胞的病癥的方法，其包含:投予根據本文所揭示方法制備的無核細胞。
[0030]在某些實施例中，本發明提供產生多種分化細胞的方法。在一些實施例中，本發明提供產生多種無核細胞的方法，其包含:
[0031](a).提供永生化干細胞；及
[0032](b).誘導所 述永生化干細胞分化成所選類型的細胞。
[0033]一般定義
[0034]類似或等效于用于實踐或測試本文所述實施例的本文所述方法和材料的任何方法和材料均視為本發明的一部分。
[0035]除非上下文另外明確指出，否則本說明書及隨附權利要求書中所用的單數形式“一(a、an)”及“所述(the) ”包括多個指示物。因此，例如，提及“核酸”包括一或多種核酸、及/或在閱讀本揭示內容后所屬領域的技術人員顯而易見的本文所述類型的組合物等。除非另有說明，否則本文中提及的所有“或”均意欲涵蓋“及/或”。
[0036]本文所用的“干細胞(例如，造血干細胞)”是指如業內通常所了解的術語。例如，與來源無關，干細胞(例如，造血干細胞)是能夠長期分裂并自我更新、非特化(未分化)、且具有產生(分化成)特定細胞類型的能力(即，其為多種不同特定細胞類型的祖細胞或前體細胞)的細胞。在本文某些情形下，本文所述的“干細胞(例如，造血干細胞)”是指長期干細胞(例如，造血干細胞)。
[0037]當與干細胞(例如，造血干細胞)結合使用時，視干細胞的具體類型而定，“長期”是指干細胞(例如，造血干細胞)在長時間段(例如，I個月、2個月、3個月、4個月、6個月、8個月、9個月、12個月、2年、3年)內通過分裂成相同的非特化細胞類型而自我更新的能力。在某些情形下，通過以下細胞表面標記的存在來識別干細胞(例如，造血干細胞):c-kit+、Sca-1+、⑶34ffi/_、⑶38+及/或Thyl+/氣在一些情形下，通過以下標記的存在來識別人類干細胞(例如，造血干細胞):CD34+、CD38ffi/_、c-kif/ffiS/或Thyl+。在某些情形下，人類及鼠科動物干細胞(例如，造血干細胞)均缺乏細胞譜系標記，例如⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、NKl.l、B220、Ter-119 及 / 或 Gr-1。
[0038]本文所用的“永生化劑”是指誘導、促進或能夠實現細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖的試劑。“永生化劑”是指誘導、促進或能夠實現細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖的任何適宜試劑。所述術語涵蓋誘導細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖的所有化學化合物，例如有機及無機分子，包括DNA、RNA、多肽、碳水化合物、脂質及小有機分子。[0039]“誘導永生性的條件激活劑”是指誘導細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖的試劑，視需要誘導或啟動其功能。例如，在多肽情形下，通過激活編碼所述多肽的基因的(例如)表達、轉錄或轉譯來實施條件激活。在其它情形下，通過向多肽上的受體添加配體(例如，使包含ER的多肽暴露于雌激素或使包含GR的多肽暴露于米非司酮(mifepristone))來誘導條件激活多肽的功能。
[0040]術語“癌肽”與“癌蛋白”在本文中可互換使用，且是指由癌基因或原癌基因編碼的氨基酸殘基、其片段或類似物的多聚體。在某些情形下，癌肽誘導細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖。本文中某些實施例的描述針對“癌肽”。應了解，在一些實施例中，所述揭示內容包括使用誘導干細胞生存、存活及/或增殖的任何多肽的揭示內容。
[0041]“永生化劑的內源拮抗劑的抑制劑”是指通過減少、降低或阻止拮抗永生化劑的內源劑的活性、濃度或表達來誘導細胞永生性的試劑。例如，某些內源轉錄阻抑蛋白抑制起誘導細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖作用的多肽的表達。一具體實例是拮抗Myc癌基因家族的MAD轉錄阻抑蛋白家族，例如，MAD-1。 因此，內源轉錄阻抑蛋白(例如，MAD-1)的抑制劑通過減少、降低或阻止所述轉錄阻抑蛋白的活性、濃度或水平而起誘導細胞永生性的作用。
[0042]在其它實施例中，例如，細胞永生性誘導物是細胞周期蛋白依賴性激酶。內源細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(例如，pl6、pl9、p21及p27)起拮抗細胞周期蛋白依賴性激酶所引起的細胞永生性促進的作用。因此，在一些實施例中，“細胞永生性誘導物的內源拮抗劑的抑制劑”是相對于相同類型的野生型干細胞減少、降低或阻止細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的活性、濃度或水平的試劑。
[0043]類似地，“促細胞凋亡多肽的抑制劑”通過減少、降低或阻止促細胞凋亡多肽(例如，內源多肽)的活性、濃度或水平而起誘導細胞永生性的作用。“促細胞凋亡多肽的抑制劑”通過任何適宜手段來減少、降低或阻止促細胞凋亡多肽的活性、濃度或水平，包括抑制多肽的表達、轉錄或轉譯，或直接作用于多肽，例如，通過與多肽結合、使多肽變性、占據多肽的活性位點或阻斷多肽與其靶標的相互作用。
[0044]在某些實施例中，本文所述誘導永生性的多肽的相似物(homologue)、類似物(analogue)或片段包括與誘導永生性的多肽至少40%至100%—致的氨基酸序列，例如，更少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于約40%至約100%之間的任何其它百分比
的一致。
[0045]本文所用的術語17(:”、“(^^”、“1^(3蛋白”及“Myc多肽”可互換使用，且在某些情形下是指NCBI登記號NP002458.2、其功能相似物、類似物或片段。在一些實施例中，Myc的同義詞包括(但不限于)c-Myc、v-Myc、Myc原癌基因蛋白及轉錄因子p64。在一些實施例中，Myc多肽包含與NCBI登記號NP002458.2的序列至少40%至100% —致的氨基酸序列，例如，至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于約40%至約100%之間的任何其它百分比的一致。在一些實施例中，Myc多肽包含與NCBI登記號NP002458.2的序列至少50%至100%—致的長度為40個氨基酸或更多的多肽序列，例如，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或介于約50%至約100%之間的任何其它百分比的一致。在一些實施例中，Myc多肽包含與NCBI登記號NP002458.2的序列至少50%至100%—致的長度為40個氨基酸或更多的多肽序列，例如，至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、90%、91%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或介于約50%至約100%之間的任何其它百分比的一致，其中所述Myc多肽誘導細胞生存、細胞永生性、細胞生長及/或細胞增殖。
[0046]為測定兩個氨基酸序列或兩個核酸間的同源百分比(percent homology),比對所述序列以進行最佳比較(例如，在第一氨基酸序列或核酸序列中引入空位以與第二氨基酸或核酸序列進行最佳比對)。隨后可比較對應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置與第二序列中的對應位置由相同氨基酸殘基或核苷酸占據時，則在所述位置處所述分子一致。兩個序列間的同源百分比是序列共有一致位置數的函數(即，％—致性=一致位置數/位置(例如，重疊位置)總數xlOO)。在一些實施例中，兩個序列具有相同長度。
[0047]為測定兩個序列間的同源百分比，使用如卡琳(Karlin)及奧斯舒爾(Altschul)(1993)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)90:5873-5877中改進的卡琳(Karlin)及奧斯舒爾(Altschul) (1990)美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA)87 =2264-2268的算法。所 述算法已納入奧斯舒爾(Altschul)等人(1990)分子生物學期刊(J.Mol.Biol.) 215 =403-410 的 NBLAST 及 XBLAST 程序中。使用 NBLAST 程序(分值=100，字長=12)來實施BLAST核苷酸搜索以獲得與本文所述或所揭示核酸分子同源的核苷酸序列。使用XBLAST程序(分值=50，字長=3)來實施BLAST蛋白質搜索。為獲得空位比對以進行比較，如奧斯舒爾(Altschul)等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.) 25:3389-3402中所述使用空位型BLAST (Gapped BLAST)。當使用BLAST及空位型BLAST程序時，可使用各程序(例如，XBLAST及NBLAST)的缺省參數。更多細節可參見國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information)的網站(在萬維網(WorldWide Web)上，網址為ncb1.nlm.nih.gov)。適用于本文所述方法的蛋白質還包括與本文所述任何蛋白質的氨基酸序列相比具有I至15個氨基酸變化的蛋白質，所述變化是例如1、
2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個氨基酸取代、缺失或添加。在其它實施例中，所述經改變的氨基酸序列與本文所述任何蛋白質抑制劑的氨基酸序列至少75%—致，例如，77%,80%,82%,85%,88%,90%,92%,95%,97%,98%,99%^； 100%—致。所述序列變體蛋白質適用于本文所述方法，只要所述經改變的氨基酸序列保留足夠的生物活性以在本文所述組合物及方法中發揮作用即可。在某些情形下，使用保守氨基酸取代。氨基酸間的例示性保守取代在以下群組的每一者范圍內:(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸，(3)絲氨酸及蘇氨酸，(4)天冬氨酸鹽及谷氨酸鹽，
(5)谷氨酰胺及天冬酰胺，及(6)賴氨酸、精氨酸及組氨酸。BL0SUM62表是衍生自蛋白質序列區段的約2，000個局部多重比對的氨基酸取代矩陣，其代表多于500個相關蛋白質群組的高度保守區域(赫內科夫(Henikoff)等人(1992)，美國國家科學院院刊(Pioc.Natl.Acad.Sc1.USA), 89:10915-10919)。利用BL0SUM62取代頻率來定義在一些實施例中引入本文所述或所揭示氨基酸序列中的保守氨基酸取代。盡管可僅基于化學特性來設計氨基酸取代(如上文所述)，但用語“保守氨基酸取代”優選是指由大于-1的BL0SUM62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于BL0SUM62值為0、1、2或3，則氨基酸取代是保守的。根據所述系統，優選的保守氨基酸取代的特征在于BL0SUM62值至少為I (例如，1、2或3)，而更優選的保守氨基酸取代的特征在于BL0SUM62值至少為2 (例如，2或3)。
[0048]本文所用的術語“核酸”是指通過組合或插入一或多種核酸以將通常不共同存在于自然界中的序列組合在一起而進行改造的核酸。在一些實施例中，核酸包含誘導物或增強子。在一些實施例中，核酸包含限制性酶位點。在一些實施例中，核酸編碼多肽。在一些實施例中，核酸包含突變。
[0049]本文所用的術語“多肽”是指由核酸產生的多肽。
[0050]本文所用的術語“Myc多肽”包含由核酸產生的Myc多肽。
[0051]本文所用的術語“轉基因”是指將編碼多肽的核酸整合至動物、細菌、病毒或細胞的基因組DNA中。
[0052]本文所用的術語“TRE”是指四環素反應元件。
[0053]本文所用的“過表達”是指與相同多肽或蛋白質在相同細胞內的內源表達水平相比表達水平較高。在某些情形下，“過表達”是指多肽的表達。在一些實施例中，較高表達水平包含增高2%至200%。在一些實施例中，較高表達水平包含增高2倍至1000倍。在一些實施例中，較高表達水平包含增高2倍至1000倍。在一些實施例中，較高表達水平包含增高2倍至10，000倍。 在一些實施例中，較高表達水平包含與先前不可檢測到的表達水平相比為可檢測到的表達水平。在一些實施例中，“過表達”是指外源多肽或蛋白質的任何可檢測到的表達水平。
[0054]術語“多肽”、“肽”及“蛋白質”在本文中可互換使用，其均指氨基酸殘基的多聚體。所述術語適用于天然存在的氨基酸多聚體以及其中一或多個氨基酸殘基是非天然存在氨基酸(例如，氨基酸類似物)的氨基酸多聚體。如本文所用，所述術語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包括全長蛋白質，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接在一起。
[0055]1.永牛化細朐
[0056]干細胞
[0057]擬進行永生化或條件永生化的干細胞(例如，造血干細胞)可自任何適宜來源獲得。在某些實施例中，所用干細胞(例如，造血干細胞)來自動物，例如，人類、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、雞、猴、大鼠、小鼠或諸如此類。在一些實施例中，干細胞自個體的骨髓、外周血、臍帶或胎兒組織獲得，或者從自個體骨髓、外周血、臍帶或胎兒組織獲得干細胞的來源得到。
[0058]在某些實施例中，自人類臍帶或胎盤收獲多種干細胞(例如，造血干細胞)。多種干細胞(例如，造血干細胞)的另一來源是胎兒動物的發育中的血液產生組織。在人類中，在約12至18周的人類胎兒的循環血液中發現多種干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，自任何來源獲得多種干細胞(例如，造血干細胞)，例如，A+、A-、B+、B-、O+、O-、AB+及AB-型血供體的骨髓、臍帶、外周血或胎兒組織。在一些實施例中，通過麻醉干細胞供體、使用針刺穿后上髂嵴(posterior superior iliac crest)并使用注射器抽吸骨髓細胞來獲得多種干細胞(例如，造血干細胞)。
[0059]與其余骨髓細胞的處理有關的其它步驟包含通過離心收集細胞、將細胞再懸浮于培養基或適于隨后處理的緩沖液中。在一些實施例中，自循環血液收獲多種干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，通過給干細胞供體注射細胞因子(例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF))來誘使骨髓中的多種干細胞(例如，造血干細胞)以較大數量自骨髓遷移至循環血液中。
[0060]在本文所述的某些方面中，多種干細胞(例如，造血干細胞)自不同血型或主要組織相容性復合物(MHC)或人類白細胞抗原(HLA)匹配來源獲得。在一些實施例中，自外周血抽取包含在收獲細胞之前數天注射粒細胞刺激因子(G-CSF)。在一些實施例中，獲得多種干細胞(例如，造血干細胞)包含自骨髓抽取多種干細胞(例如，造血干細胞)，其包含注射5-氟尿嘧啶(5-FU)以通過誘導所述細胞增殖來富集多種干細胞(例如，造血干細胞)。
[0061]可任選地使用任何適宜識別方法來識別自供體獲得的干細胞。例如，在一些實施例中，識別多種干細胞(例如，造血干細胞)包含使用與多種干細胞(例如，造血干細胞)相關或與系統的終末分化細胞特定相關的細胞表面標記。在一個實施例中，標記包括c-kit、Sca-1、CD34、CD38、ThyU CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCP1、內皮唾粘蛋白(Endomucin)或 Gr-1 中的一或多者。在另一實施例中，標記包括⑶150、⑶244或⑶46中的一或多者。
[0062]以任何適宜方式(例如，作為非限制性實例，熒光激活細胞分選術(FACS)或磁激活細胞分選術(MACS))將自供體獲得的多種干細胞(例如，造血干細胞)與不是所述多種干細胞(例如，造血干細胞)的細胞分開。
[0063]在一個 非限制性實例中，將鼠科動物骨髓細胞與識別細胞表面分子的抗體一起培育，所述細胞表面分子是例如 c-kit、Sca-l、CD34、CD38、Thyl、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD105、CD133、ABCG2、NK1.l、B220、Ter-119、Flk_2、CDCPl、內皮唾粘蛋白或 Gr-1 中的一或多者。使 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKL l、B220、Ter_119 及 Gr-1 抗體與磁性珠粒接合。在MACS設備中，表面上含有CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119或Gr-1的細胞保留在柱中，所述柱經裝備以捕獲磁性珠粒及附接至接合磁性珠粒的抗體的細胞。對未被MACS柱俘獲的細胞實施FACS分析。實施FACS分析時，使諸如c-kit、Sca-1、CD34、CD38、Thyl等表面分子的抗體與熒光物質接合。根據與細胞結合的熒光抗體的類型自剩余試樣中分離出(:-1^^、50&-1+、0)34<￡/_、0)38+、11^1+/<￡細胞。所述細胞以鼠科動物長期干細胞(例如，造血干細胞)形式提供以用于本文所述的其它方法。在其它實施例中，使用不同標記集合自骨髓、臍帶血、胎兒組織及外周血細胞分離鼠科動物長期干細胞(例如，造血干細胞)。
[0064]在另一非限制性實例中，將人類外周血細胞與識別c-kit、Sca-U⑶34、⑶38、Thyl、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD43、CD45、CD59、CD90、CD 105、CD133、ABCG2、NKl.1、B220、Ter-119、Flk-2、CDCPl、內皮唾粘蛋白或 Gr-1 的抗體一起培育。使 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119 及 Gr-1 抗體與磁性珠粒接合。表達 CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NKl.1、B220、Ter-119或Gr-1的細胞保留在柱中，所述柱經裝備以捕獲磁性珠粒及附接至接合磁性珠粒的抗體的細胞。對未被MACS柱俘獲的細胞實施FACS分析。使c-kit、Sca-l、⑶34、CD38、Thyl抗體與業內已知的熒光物質接合。根據與細胞結合的熒光抗體的類型自剩余試樣中分離出⑶34+、⑶38低/'C-1dtv^Thyl+細胞。所述細胞以人類長期干細胞(例如，造血干細胞)形式提供以用于本文所揭示的其它方法。
[0065]在再一非限制性實例中，使用接合磁性珠粒的抗體(對抗⑶2、⑶3、⑶4、⑶5、⑶8、NKl.UB220,Ter-119或Gr-1中一或多者的抗體)及接合熒光物質的CD150、CD244及/或CD48抗體的相同集合來標記自個體獲得的細胞。自試樣中移除被接合磁性珠粒的抗體俘獲的細胞后，通過FACS分析試樣，且⑶150+、⑶244-及⑶48-細胞留作長期干細胞(例如，造血干細胞)。
[0066]在一些實施例中，用于本文所述任一方法中的多種干細胞(例如，永生化或干細胞)包含一或多種以下標記:c-kit\ Sca-、CD34ffi/' CD38+、Thyl+/低、CD34+、CD38ffi/'c-kit_/ffi及/或11^1+。在一些實施例中，用于本文所述任一方法中的干細胞(例如，永生化或干細胞)缺少一或多種以下標記:CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、NK1.1、B220、Ter-119及/或Gr-1。在某些實施例中，用于本文所述任一方法中的干細胞(例如，永生化或干細胞)是A+、A-、B+、B-、O+、0_、AB+ 或 AB-型。
[0067]在一些實施例中，提供永生化干細胞包括提供至少一種永生化或干細胞。在某些實施例中，提供至少一種永生化干細胞包括提供多種永生化或干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，提供永生化干細胞包含產生永生化或干細胞。在具體實施例中，提供永生化干細胞包含產生多種永生化或干細胞(例如，造血干細胞)。在其它實施例中，通過自任何來源獲取來提供永生化或干細胞。
[0068]永生化
[0069]在某些實施例中，將條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)在適宜條件下連續保持適宜時間段，以成 功地建立永生化或條件永生化干細胞系。
[0070]在某些實施例中，根據本文所述任一方法誘導條件永生化干細胞增殖包括誘導條件永生化干細胞永生化且由此使條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)增殖。在一些實施例中，誘導增殖包含誘導永生性誘導劑的表達。在某些實施例中，在包含編碼永生性誘導劑的轉基因的條件永生化細胞中誘導永生性誘導劑的表達，其中編碼永生化劑的轉基因是一或多種TRE。
[0071]在某些實施例中，永生化干細胞是(作為非限制性實例)永生化造血干細胞、永生化間充質干細胞、永生化神經干細胞、永生化上皮干細胞、永生化腸干細胞、永生化祖心肌細胞干細胞、永生化皮膚干細胞、永生化毛囊干細胞、永生化骨骼肌干細胞、永生化成骨細胞前體干細胞、永生化肝臟干細胞、永生化胚胎干細胞或諸如此類。在具體實施例中，永生化干細胞是永生化造血干細胞。
[0072]在一些實施例中，通過使條件永生化干細胞與永生性誘導劑接觸來產生永生化干細胞。在一些實施例中，條件永生化干細胞的永生化避免了如相同譜系的正常或野生型干細胞一樣不能在長時間(例如，長于6小時、12小時、24小時、3天、I周、2周、I個月、3個月等)后離體存活、增殖及/或分化。在某些實施例中，永生化劑被條件激活。
[0073]在一些實施例中，永生化劑是誘導永生性的癌肽。例如，在某些實施例中，誘導永生性的適宜癌肽是:生長因子及/或促細胞分裂原、受體酪氨酸激酶(尤其組成性活性的受體酪氨酸激酶)、細胞質酪氨酸激酶、細胞質絲氨酸/蘇氨酸激酶及其調控亞基、調控性GTP酶、轉錄因子、端粒末端轉移酶逆轉錄酶及/或激活其它癌肽的因子。在一些實施例中，永生化干細胞經修飾以表達或條件表達癌肽。此外，在一些實施例中，癌肽的功能或表達被條件激活。
[0074]在一些實施例中，永生化劑抑制永生性誘導物的內源拮抗劑。例如，在一些實施例中，永生性誘導劑包含轉錄阻抑蛋白的抑制劑，所述轉錄阻抑蛋白拮抗誘導永生性的基因的表達。在某些實施例中，轉錄阻抑蛋白拮抗癌肽(例如，Myc)。
[0075]在一些實施例中，永生性誘導劑是抑制細胞凋亡的多肽(例如，抗細胞凋亡多肽)。在一些實施例中，永生化干細胞表達及/或條件表達抑制細胞凋亡的多肽，例如，所述細胞包含表達或條件表達抑制細胞凋亡的多肽的轉基因。在一些實施例中，永生性誘導劑是抑制促細胞凋亡多肽(例如，內源促細胞凋亡多肽)的試劑。
[0076]在一些實施例中，通過使干細胞與永生性誘導劑(例如，癌肽或表達或過表達癌肽的轉基因)接觸來產生永生化或條件永生化干細胞。在一些實施例中，通過使干細胞與永生性誘導劑(例如，癌肽或表達或過表達癌肽的轉基因)及選自以下的至少一種其它試劑接觸來產生永生化或條件永生化干細胞:永生性誘導劑(例如，另一癌肽及/或表達或過表達癌肽的另一轉基因)、細胞永生性誘導物的內源拮抗劑的抑制劑、抗細胞凋亡多肽、促細胞凋亡多肽的抑制劑或其組合。
[0077]用于 本文所述方法中的永生化或條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)是以任何適宜方式來制備。在一些實施例中，通過使條件永生化干細胞與多肽及/或編碼誘導永生性的多肽的轉基因(例如，癌基因或原癌基因)接觸來產生條件永生化干細胞。在某些實施例中，通過使條件永生化干細胞與癌肽(例如，Myc)及/或編碼癌肽(例如，Myc)的轉基因接觸來產生條件永生化干細胞。在用于本文所述方法中的永生化或條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)包含編碼癌肽的轉基因的一些實施例中，本文所述的任一方法任選地進一步包含在分化之前自永生化或條件永生化干細胞的細胞核或在分化之后自所選類型細胞的細胞核切除所述轉基因。
[0078]可以任何適宜方式將編碼永生性誘導劑的轉基因遞送至干細胞中，所述永生性誘導劑是例如癌肽、抗細胞凋亡多肽、促細胞凋亡多肽的抑制劑或細胞永生性誘導物的內源拮抗劑的抑制劑等。在某些情形下，使用載體將編碼永生性誘導劑的轉基因轉染至干細胞中。如本文所用，將核酸插入至細胞中任選地包含(作為非限制性實例)顯微注射、基因轉染、基因轉導、電穿孔或類似方法。在一些情形下，將編碼永生性誘導劑的轉基因轉導至條件永生化干細胞中。在一些實施例中，將編碼永生性誘導劑的轉基因轉染或轉導至干細胞中的方法如美國專利第2007/0116691號中所陳述，所述專利的本揭示內容以引用方式并入本文中。可以任何適宜方式將誘導永生性的多肽遞送至干細胞中，所述多肽是例如癌肽、抗細胞凋亡多肽、促細胞凋亡多肽的抑制劑或細胞永生性誘導物的內源拮抗劑的抑制劑等。在一些實施例中，通過表達編碼多肽的轉基因將多肽引入細胞中。在某些實施例中，多肽是包含多肽轉導結構域的融合多肽，并通過將條件永生化干細胞與所述融合多肽一起培養來將所述多肽引入條件永生化干細胞中。在一些實施例中，將多肽引入干細胞中的方法如美國專利第2007/0116691號中所陳述，所述專利的本揭示內容以引用方式并入本文中。
[0079]在一些實施例中，用于本文所述任一方法中的永生化干細胞包含細胞永生性誘導劑。在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含表達或過表達誘導細胞永生性的多肽的轉基因。在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含誘導細胞永生性的多肽。在一些實施例中，誘導細胞永生性的多肽是癌肽。癌肽是誘導細胞永生性的任何適宜種類。例如，在某些實施例中，誘導細胞永生性的適宜癌肽是:生長因子及/或促細胞分裂原(例如，PDGF衍生生長因子，例如c-Sis);受體酪氨酸激酶，尤其組成性活性的受體酪氨酸激酶(例如，表皮生長因子受體(EGFR)、衍生自凝血細胞的生長因子受體(TOGFR)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)及HER2/neu);細胞質酪氨酸激酶(例如，Src-家族、Syk_ZAP-70家族及BTK酪氨酸激酶家族)；細胞質絲氨酸/蘇氨酸激酶及其調控亞基(例如，Raf激酶、細胞周期蛋白依賴性激酶、Akt家族成員);調控性GTP酶(例如，Ras蛋白);轉錄因子(例如，Myc及HIF-1a)；端粒末端轉移酶逆轉錄酶(例如，TERT或hTERT);及/或激活其它癌肽的因子(例如細胞周期蛋白，包括細胞周期蛋白A、B、D及/或E，例如細胞周期蛋白Dl及D3)。在某些實施例中，癌肽是Myc、HIF-la、Notch-1、Akt、hTERT或細胞周期蛋白。在一些實施例中，癌肽是誘導細胞生存、細胞存活及/或細胞增殖的任一癌肽的功能片段、相似物或類似物，例如，Myc、HIF-la、Notch-1、Akt, hTERT或細胞周期蛋白的功能片段、相似物或類似物。 [0080]在一些實施例中，細胞永生性誘導劑抑制細胞永生性誘導物的內源拮抗劑。例如，所述試劑是基因抑制劑或小分子抑制劑(例如，拮抗劑)。例如，在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含轉錄阻抑蛋白的抑制劑，所述轉錄阻抑蛋白抑制誘導細胞永生性的基因的表達。在某些實施例中，轉錄阻抑蛋白拮抗調控誘導細胞永生性的基因的表達的癌肽(例如，Myc)。例如，在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含抑制至少一個MAD轉錄阻抑蛋白家族成員(例如，MAD-1)的試劑。在某些其它實施例中，細胞永生性誘導劑包含細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(例如，pl6、pl9、p21或p27)的抑制劑。
[0081]相對于相同類型的野生型干細胞抑制細胞永生性誘導劑的內源拮抗劑的任何試劑均適用于本文所揭示的方法。細胞永生性誘導劑的內源拮抗劑的抑制劑試劑在任何階段或通過任何機制減少、抑制或降低拮抗劑的活性或水平。例如，在一些情形下，所述試劑在例如轉譯水平或轉錄水平上干擾拮抗細胞永生性誘導劑活性的試劑的表達。在某些實施例中，干擾拮抗細胞永生性誘導劑活性的試劑的表達的試劑是能夠進行RNA干擾的試劑(RNAi分子)。在一些實施例中，通過裂解編碼多肽(例如，癌肽)的mRNA或與其結合來產生RNAi分子。通過任何適宜手段來產生RNAi分子，包括小干擾RNA (siRNA)、微小RNA (miRNA)、雙鏈RNA(dsRNA)或小發夾RNA (shRNA)。在某些實施例中，干擾拮抗細胞永生性誘導劑活性的試劑的表達的試劑是小分子，例如，小有機分子。
[0082]在一些實施例中，抑制細胞永生性誘導劑的內源拮抗劑的試劑直接作用于所述拮抗劑。例如，在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含結合細胞永生性誘導劑的內源拮抗劑并抑制其活性的試劑，例如抗體或小分子。例如，在一些實施例中，適宜試劑是結合或干擾癌肽拮抗劑的試劑，例如結合一或多種MAD家族轉錄阻抑蛋白(例如，MAD-1)或細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(例如，pl6、pl9、p21或p27)并破壞其天然功能的抗體或小分子。
[0083]在一些實施例中，細胞永生性誘導劑是表達或過表達抗細胞凋亡多肽的轉基因。在一些實施例中，細胞永生性誘導劑是抗細胞凋亡多肽。在一些實施例中，干細胞或細胞表達的主干(stem)中的抗細胞凋亡多肽包含一或多個Bcl-2同源結構域。在一些具體實施例中，包含一或多個Bcl-2同源結構域(例如，BH1、BH2、BH3及/或BH4)的抗細胞凋亡多肽是例如 Bcl-2、Bcl-x, Bcl-XL, Mcl-1、CED-9、Al、Bfi_l、Bcl_w 或諸如此類。
[0084]在一些實施例中，相對于相同類型的野生型干細胞，細胞永生性誘導劑是干細胞內的促細胞凋亡多肽(例如，內源促細胞凋亡多肽)的抑制劑。在某些實施例中，促細胞凋亡多肽包含一或多個Bcl-2同源結構域(例如，BH1、BH2、BH3及/或BH4)。在具體實施例中，促細胞凋亡多肽包含 BH3，例如，BIM, PUMA、NOXA, BAK、BAX、BIK、BAD、BID、EGL-1 及 / 或諸如此類。在具體實施例中，促細胞凋亡多肽是僅含有BH3的多肽，例如，BM、PUMA、N0XA、BAD、BID、EGL-1及/或諸如此類。
[0085] 相對于相同類型的野生型干細胞抑制干細胞內促細胞凋亡多肽的活性或水平的任何試劑適宜作為細胞永生性誘導劑。在某些實施例中，降低條件永生化干細胞中促細胞凋亡多肽的水平的試劑是干擾促細胞凋亡多肽表達的試劑。在一些實施例中，干擾促細胞凋亡多肽表達的試劑在轉譯表達水平或轉錄表達水平上干擾表達。在某些實施例中，干擾促細胞凋亡多肽表達的試劑是RNAi分子(例如，通過裂解編碼促細胞凋亡多肽的mRNA或與其結合而干擾RNA的分子，所述mRNA是例如編碼包含BH3結構域的多肽的mRNA)。在一些實施例中，通過任何適宜手段來產生RNAi分子，包括siRNA、miRNA、dsRNA及/或shRNA。在某些其它實施例中，干擾促細胞凋亡多肽表達的試劑是小分子，例如，小有機分子。
[0086]在一些實施例中，相對于相同類型的野生型干細胞抑制干細胞內促細胞凋亡多肽的活性或水平的試劑直接作用于促細胞凋亡多肽。例如，在一些實施例中，細胞永生性誘導劑包含結合促細胞凋亡多肽并抑制其活性的試劑，例如結合促細胞凋亡多肽并破壞其天然功能的抗體或小分子。
[0087]在某些實施例中，細胞永生性誘導劑(例如，多肽或編碼誘導永生性的多肽的轉基因)是(作為非限制性實例)n-Myc、c-MyC、l-MyC、v-Myc、mTOR、細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白 D3、STAT3、STAT5、AML-ETO, AKT、ICN-1、hTERT、PDK-1、MLL-ENL, IL3 受體β 鏈、β-連環蛋白、刺猬(Hedgehog)家族(Shh> Ihh、Dhh)、Bm1-U c_Jun、Wnt> Bcl_2、Bcl-6、Bcl-10、表皮生長因子受體(EGFR、ErbB-1、HER1)、ErbB-2 (HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFR配體家族；胰島素樣生長因子受體(IGFR)家族、IGF結合蛋白質(IGFBPs)、IGFR配體家族；血小板衍生生長因子受體(I3DGFR)家族、I3DGFR配體家族；成纖維細胞生長因子受體(FGFR)家族、FGFR配體家族、血管內皮生長因子受體(VEGFR)家族、VEGF家族；HGF受體家族；TRK受體家族；蝶素(EPH)受體家族;AXL受體家族；白細胞酪氨酸激酶(LTK)受體家族；TIE受體家族、血管生成素1，2 ;受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(ROR)受體家族；盤狀結構域受體(DDR)家族；RET受體家族；KLG受體家族；RYK受體家族；MuSK受體家族；轉化生長因子β (TGF-β)受體、TGF-.β.;細胞因子受體、I類(血細胞生成素家族)及II類(干擾素/IL-10家族)受體、腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族(TNFRSF)、死亡受體家族；癌癥-睪丸(CT)抗原、譜系特異性抗原、分化抗原、α -輔肌動蛋白-4、ARTC1、斷裂點簇集區-阿布爾森(Abelson) (Bcr-abl)融合產物、B-RAF、半胱天冬酶-5(CASP-5)、半胱天冬酶-8(CASP-8)、β -連環蛋白(CTNNBl)、細胞分裂周期27 (CDC27)、細胞周期蛋白依賴性激酶4 (CDK4)、CDKN2A、COA-1、dek-can融合蛋白、EFTUD-2、延伸因子2(ELF2)、Ets變體基因6/急性髓樣白血病I基因ETS (ETC6-AML1)融合蛋白、纖維連接蛋白(FN)、GPNMB、低密度脂質受體/⑶P-L巖藻糖:i3-D半乳糖2-a-L巖藻糖基轉移酶(LDLR/FUT)融合蛋白、HLA-A2基因中α 2_結構域α -螺旋的殘基170處精氨酸換成異亮氨酸的 HLA-A2(HLA-A*201-R170I)、HLA-A11、熱休克蛋白 70-2 突變體(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2、黑色素瘤遍在突變體(melanoma ubiquitous mutated) 1、2、3 (MUM_1、2、3)、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、neo-PAP、I類肌球蛋白、NFYC, 0GT、0S_9、pml-RARα融合蛋白、PRDX5、PTPRK、K-ras (KRAS2)、N-ras (NRAS)、HRAS、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT-SSXl或 SYT-SSX2 融合蛋白、磷酸丙糖異構酶、BAGE, BAGE-U BAGE-2，3，4，5、GAGE-1,2,3,4,5，6，7，8、GnT-V (異常 N-乙酰基葡糖胺基轉移酶 V，MGAT5)、HERV-K-MEL, KK-LC, KM-HN-ULAGE, LAGE-1、黑色素瘤上的 CTL 識別抗原(CAMEL)、MAGE-Al (MAGE-1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-AlO, MAGE-AlU MAGE-Al2, MAGE-3,MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-CU MAGE-C2、粘蛋白 I (MUCl)、MART-1/Melan-A (MLANA)、gplOO、gp100/Pmell7 (SILV)、酪氨酸酶(TYR)、TRP-K HAGE, NA-88、NY-ESO-1、NY-ESO-1/LAGE-2、SAGE、Spl7、SSX-1, 2，3，4、TRP2-1NT2、癌胚抗原(CEA)、激肽釋放酶4、乳腺珠蛋白-A、0A1、前列腺特異性抗原(PSA)、TRP-l/gp75、TRP-2、脂肪分化相關蛋白(adipophilin)、干擾素誘導蛋白(黑色素瘤缺乏因子2，AIM-2)、BING-4、CPSF、細胞周期蛋白D1、上皮細胞粘附分子(Ep-CAM)、EphA3、成纖維細胞生長因子-5 (FGF-5)、糖蛋白 250 (gp250)、EGFR (ERBBl)、HER-2/neu(ERBB2)、白細胞介素 13 受體 α2 鏈(ILI3Ra2)、IL-6 受體、腸羧酸酯酶(iCE)、a -甲胎蛋白(AFP)、M-CSF, mdm_2、MUCl、p53 (TP53)、PBF、PRAME, PSMA, RAGE-K RNF43、RU2AS、S0X10、STEAP1、存活素(BIRC5)、人類端粒末端轉移酶逆轉錄酶(hTERT)、端粒末端轉移酶、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)基因(WTl)、SYCPU BRDT, SPANX, XAGE, ADAM2、PAGE-5, LIPU CTAGE-U CSAGE, MMAU CAGE、BORIS、H0M-TES-85、AF15ql4、HCA661、LDHC、MORC, SGY-1、SP011、TPX1、NY-SAR-35、FTHLl7, NXF2、TDRDU TEX15、FATE、TPTE、免疫球蛋白特異型、本周蛋白(Bence-Jones protein)、雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、癌抗原 72_4(CA72_4)、癌抗原15-3 (CA15-3)、癌抗原 27-29 (CA27-29)、癌抗原 125 (CA125)、癌抗原 19-9 (CA19-9)、β -人絨毛膜促性腺素、鱗狀細胞癌抗原、神經元特異性烯醇酶、熱休克蛋白gp96、GM2、沙格司亭(sargramostim)、CTLA_4、707丙氨酸脯氨酸(707-AP)、T細胞識別的腺癌抗原4 (ART-4)、癌胚抗原肽-1 (CAP-1)、鈣激活氯離子通道-2 (CLCA2)、親環蛋白B (Cyp-B)、人類印戒腫瘤-2(HST-2)、猿猴病毒40(S V40)衍生的轉化基因及蛋白質、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)蛋白(HPV-E6、HPV-E7、主要或次要殼體抗原、其它)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barrvirus) (EBV)蛋白(EBV潛在膜蛋白一LMP1、LMP2 ;其它)、乙型肝炎或丙型肝炎病毒蛋白、人類免疫缺陷病毒(HIV)蛋白、其功能相似物、功能類似物或功能片段。在某些實施例中，用于本文所述任一方法中的編碼癌肽的轉基因、其它永生化轉基因、其功能相似物、功能類似物或功能片段包括編碼誘導細胞生存、存活及/或增殖的多肽的轉基因。
[0088]在某些實施例中，條件過表達誘導細胞永生性的多肽(例如，癌肽)的轉基因包含對四環素或其類似物(例如，多西環素(doxycycline))起反應的元件。在某些情形下，編碼本文所述任一多肽(例如，癌肽)的轉基因由tTA或rtTA驅動(例如，TRE-Myc)。因此，在某些實施例中，本文所述條件永生化干細胞包含編碼可誘導細胞永生性的多肽的第一轉基因，其中所述第一轉基因包含一或多種TRE，且進一步包含編碼可條件激活所述一或多種TRE的多肽的第二轉基因(例如，tTA或rtTA)。
[0089]在某些實施例中，用于本文所述任一方法中的條件永生化干細胞包含表達誘導細胞永生性的條件激活多肽(例如，癌肽)的轉基因，其中由所述轉基因表達的多肽是融合多肽。在一些實施例中，多肽的融合多肽包含受體(例如，雌激素受體(ER))，其中對受體進行調節(例如，激動、拮抗及/或與配體結合)使融合多肽的存活及增殖特征激活。例如，在某些實施例中，條件激活多肽是癌肽的融合多肽，例如，作為非限制性實例，Myc-ER。在一些實施例中，通過使條件永生化干細胞與誘導細胞永生性的條件激活多肽(例如，癌肽)(例如，Myc-ER)接觸來產生條件永生化干細胞。[0090]在一些情形下，任選地在條件永生化干細胞的外部表達或合成永生性誘導劑(例如，癌肽或抗細胞凋亡多肽)，并隨后遞送至條件永生化干細胞中以使其永生化或條件永生化。在某些實施例中，通過使條件永生化干細胞與能夠將多肽遞送至條件永生化干細胞中的轉導結構域接觸來產生在條件永生化干細胞的外部表達或合成并隨后遞送至條件永生化干細胞中的細胞永生性誘導劑。在某些具體實施例中，在條件永生化干細胞的外部表達或合成并隨后遞送至條件永生化干細胞中的細胞永生性誘導劑是例如Tat-Myc、Vpr-Myc>VP22-Myc、Tat-Bcl-2、Vpr-Bcl-2、VP22_Bcl_2、Tat-Bcl-x、Vpr-Bcl-x、VP22_Bcl_x、Tat-Bcl-XL、Vpr-Bc 1-XL, VP22_Bcl_XL、Tat-Mc 1-1, Vpr-Mcl-l、VP22_Mcl_l、Tat-CED-9、Vpr-CED-9、VP22-CED-9、Tat-AU Vpr-AU VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-Bfl_l、Tat-Bcl-w、Vpr-Bcl-w及/或VP22-Bcl-w。在某些實施例中，包含受體(例如，ER或GR)的癌肽還進一步包含能夠將多肽遞送至條件永生化干細胞中的轉導結構域，例如，Tat-Myc > Vpr-Myc > Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 及 /或 VP22-Myc-GR。
[0091]在某些情形下，通過將干細胞與包含轉導結構域的多肽一起培養來制備包含細胞永生性誘導劑(包含轉導結構域)的條件永生化干細胞。在具體實施例中，通過將干細胞與以下物質一起培養來制備條件永生化干細胞:(l)Tat_Myc、Vpr-Myc> Tat_Myc_ER、Vpr-Myc-ER, VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR, Vpr-Myc-GR 或 VP22-Myc_GR ；及(2) Tat-Bcl-2、Vpr-Bcl-2、VP22-Bcl-2、T at-Bcl-x、Vpr-Bc 1-x, VP22_Bcl_x、Tat-Bcl-XL, Vpr-Bc 1-XL,VP22-Bcl-XL、Tat-Mcl-1、Vpr-Mc 1-1, VP22_Mcl_l、Tat-CED-9, Vpr-CED-9, VP22-CED-9、Tat-Al、Vpr-Al、VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-Bfl_l、Tat-Bcl-w、Vpr-Bc1-w或VP22-Bcl-w。在一些實施例中，包含轉導結構域且由原癌基因編碼的多肽是例如Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 或VP22-Myc-GR。在某些實施例中，條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)是闡述于美國專利第2007/0116691號中者或通過闡述于美國專利第2007/0116691號中的方法制備者，所述專利的本揭示內容以引用方式并入本文中。
[0092]在一些實施例中，通過使干細胞與永生性誘導劑(例如，癌肽或表達或過表達癌肽的轉基因)接觸來產生永生化或條件永生化干細胞。在一些實施例中，通過使干細胞與永生性誘導劑(例如，癌肽或表達或過表達癌肽的轉基因)及選自以下的至少一種其它試劑接觸來產生永生化或條件永生化干細胞:永生性誘導劑(例如，另一癌肽及/或表達或過表達癌肽的另一轉基因)、細胞永生性誘導物的內源拮抗劑的抑制劑、抗細胞凋亡多肽、促細胞凋亡多肽的抑制劑或其組合。
[0093]用于本文所述方法中的永生化或條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)是以任何適宜方式來制備。在一些實施例中，通過使條件永生化干細胞與多肽及/或編碼誘導永生性的多肽的轉基因(例如，癌基因或原癌基因)接觸來產生條件永生化干細胞。在某些實施例中，通過使條件永生化干細胞與癌肽(例如，Myc)及/或編碼癌肽(例如，Myc)的轉基因接觸來產生條件永生化干細胞。在用于本文所述方法中的永生化或條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)包含編碼癌肽的轉基因的一些實施例中，本文所述的任一方法任選地進一步包含在分化之前自永生化或條件永生化干細胞的細胞核或在分化之后自所選類型細胞的細胞核切除所述轉基因。[0094]在某些實施例中，用于本文所揭示方法的干細胞(例如，造血干細胞)包含癌肽或表達癌肽的轉基因與至少一種誘導細胞永生性的其它試劑的組合。所述組合的具體實例包括癌肽或表達癌肽的轉基因(例如，Myc、Myc-ER、Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER, VP22-Myc_ER、Myc-GR、Tat-Myc-GR, Vpr-Myc-GR, VP22-Myc_GR、細胞周期蛋白Dl、細胞周期蛋白D3及/或HIF-la)與細胞永生性誘導劑的內源拮抗劑的抑制劑(例如，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(例如，pl6、pl9、p21或p27)的抑制劑及/或抑制誘導細胞永生性的基因表達的轉錄阻抑蛋白(例如，MAD轉錄阻抑蛋白家族成員(例如，MAD-1))的抑制劑)。
[0095]在其它實施例中，永生性誘導劑的組合包括癌肽或表達癌肽的轉基因(例如，Myc> Myc-ER、Tat-Myc> Vpr-Myc> Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Myc-GR>Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR、VP22-Myc-GR、細胞周期蛋白 Dl、細胞周期蛋白 D3 及 / 或HIF-la)與包含一或多個Bcl-2同源結構域的抗細胞凋亡多肽(例如，Bcl-2、Bcl-x、Bcl-XL、Mcl-l、CED-9、Al、Bfl-U Bc li或諸如此類);及/或促細胞凋亡多肽(例如，BIM, PUMA、NOXA,BAK、BAX、BIK、BAD、BID、EGL-1)的抑制劑。在某些實施例中，用于本文所揭示方法的誘導干細胞(例如，造血干細胞)永生性的試劑的具體組合是:Myc多肽與Bcl-2多肽；Myc多肽與促細胞凋亡多肽(例如，BIM)的抑制劑。在某些實施例中，所述抑制劑包含核酸、氨基酸，或者是小有機分子。
[0096]在一些其它實施例中，用于本文所揭示方法的干細胞(例如，造血干細胞)包含干細胞永生化誘導物的內源拮抗劑的抑制劑與至少一種誘導干細胞永生化的其它試劑的組合，所述其它試劑是例如干細胞永生化誘導物的內源拮抗劑的另一抑制劑、及/或癌肽、及/或抗細胞凋亡多肽、及/或促細胞凋亡多肽的抑制劑。所述組合的具體非限制性實例包括MAD-1抑制劑與Bcl-2多肽、及MAD-1抑制劑與促細胞凋亡多肽(例如，BIM)的抑制劑。
[0097]在某些實施例中還包括細胞永生性誘導劑的組合，其中至少一種試劑(多達及包括所有試劑)被條件表達或激活。例如，所述組合包括(作為非限制性實例)條件激活癌妝(例如，Myc-ER、Tat-Myc > Vpr-Myc > Tat-Myc-ER、Vpr-Myc-ER、VP22-Myc_ER、Myc-GR、Tat-Myc-GR、Vpr-Myc-GR 及 / 或 VP22-Myc_GR)與抗細胞凋亡多肽(例如，Bcl-2,Tat_Bcl_2、Vpr_Bcl_2> VP22_Bcl_2> Tat-Bcl-X> Vpr-Bcl-X> VP22_Bcl_x、Tat_Bcl_XL、Vpr-Bcl-XL、VP22_Bcl_XL、Tat-Mcl-1、Vpr-Mc1-U VP22_Mcl_l、Tat-CED-9, Vpr-CED-9,VP22-CED-9、Tat-Al、Vpr-AU VP22-A1、Tat-Bf1-U Vpr-Bfl-U VP22-BA-1、Tat-Bcl-w,Vpr-Bcl-w 或 VP22_Bcl_w)的組合。
[0098]以任何適宜方式將本文所述的轉基因及多肽遞送至多種干細胞(例如，造血干細胞)中以使其永生化或條件永生化，所述適宜方式是例如(作為非限制性實例)利用載體轉染至干細胞中、顯微注射、轉染、轉導、電穿孔或類似方法。在某些情形下，通過任何適宜技術將轉基因構建至載體中，包括例如利用聚合酶鏈反應自基因組分離一種基因或一或多種基因的片段、利用限制性酶來修飾自基因組分離的一種基因或一或多種基因的片段、利用核酸修飾酶(例如拓撲異構酶、DNA連接酶、DNA核酸酶)、及利用與自細胞獲得mRNA并將mRNA轉化成cDNA并將cDNA克隆至適宜載體中有關的方法實施進一步克隆。
[0099]在某些實施例中，利用蛋白質轉導將永生化劑引入細胞中。例如，對于蛋白質轉導，在轉導之前融合蛋白已經純化。因此，使細胞條件永生化不需要對細胞進行遺傳修飾。[0100] 在某些實施例中，利用病毒轉導。在一些實施例中，將永生化基因(例如Myc或Bcl-2)克隆至病毒載體中，其中在各種病毒誘導物(例如單純皰疹病毒胸苷激酶誘導物或HIV LTR(長末端重復(long term repeat))誘導物)控制下獲得基因表達。在具體實施例中，使多種干細胞(例如，造血干細胞)與包含編碼Myc基因、Bcl-2基因或其組合的核酸序列的病毒載體接觸。在一些實施例中，使多種干細胞(例如，造血干細胞)與包含編碼Myc基因、Bcl-2基因或其組合的核酸序列的逆轉錄病毒載體接觸。在一些實施例中，使多種干細胞(例如，造血干細胞)與包含編碼Myc基因、Bcl-2基因或其組合的核酸序列的腺病毒載體接觸。在一些實施例中，使多種干細胞(例如，造血干細胞)與包含編碼Myc基因、Bcl-2基因或其組合的核酸序列的慢病毒載體接觸。在一些實施例中，利用細胞轉染方法來遞送轉基因。因此，在一些實施例中，將基因克隆至哺乳動物表達載體中，并由市售細胞轉染劑基于例如陽離子脂質技術來遞送含有轉基因的載體。在一些實施例中，任選地利用電穿孔方法(其為轉染方法的變化形式)來遞送哺乳動物表達載體。在某些情形下，在轉染之前將載體線性化以有效轉染。
[0101]在一些實施例中，使用包含編碼永生性誘導多肽(例如，癌肽)的轉基因的永生化或干細胞的任一本文所述方法進一步包含在分化之前自干細胞或在分化之后自分化細胞切除轉基因。在某些實施例中，通過使用Cre-1oxP或類似系統來達成轉基因的切除。在所述系統中，編碼誘導細胞存活、細胞生存及/或細胞增殖的多肽的轉基因包含在轉基因之前及之后插入的序列元件，例如，1xP基因座(5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3' (SEQ ID NO:1))。在某些情形下，由重組酶(例如，Cre)來識別1xP序列，任選地使用重組酶來切除位于兩個1xP之間的轉基因(例如，編碼誘導細胞存活、細胞生存及/或細胞增殖的多肽的序列元件)。在使用Cre-1oxP系統的一個實施例中，構建其中融合轉基因(例如，Tat-Myc、Vpr-Myc、Tat-Myc_ER或Tat-MYC)兩側側接兩個1xP序列的病毒質粒。在某些實施例中，通過任何適宜方法(例如，轉導)將轉基因整合至多種干細胞(例如，造血干細胞)的基因組中。
[0102]分化
[0103]在一些實施例中，本發明提供制備多種所選類型細胞的方法，其包含:
[0104](a).提供干細胞；
[0105](b).將編碼永生性誘導劑或誘導永生性的癌肽的轉基因引入條件永生化干細胞中以產生條件永生化干細胞；及
[0106](c).誘導多種永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成多種細胞類型。
[0107]在某些實施例中，用于本文所述任一方法中的永生化干細胞是條件永生化干細胞(ctlt-干細胞)。在一些實施例中，在未誘導條件永生化干細胞永生化的條件下實施條件永生化干細胞的分化。在其它實施例中，在誘導條件永生化干細胞永生化的條件下實施條件永生化干細胞的分化。
[0108]在一些實施例中，本文所揭示方法進一步包含使條件永生化干細胞與誘導分化的多肽及/或編碼誘導分化的多肽的轉基因接觸。在一些實施例中，多肽包含輸出序列(export sequence)及質膜保留兀件(plasma membrane retention element)。在某些實施例中，當細胞中的或由細胞表達的多肽保留在質膜上時，所述多肽進一步包含有助于自細胞表面移除多肽的序列。在某些實施例中，有助于自細胞表面移除多肽的序列是蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，蛋白酶裂解位點是血清蛋白酶的底物。
[0109]在某些實施例中，誘導分化的多肽是細胞因子。在某些實施例中，細胞因子是生長及/或分化因子。在某些實施例中，生長及/或分化因子是EPO、THPO或G-CSF。
[0110]通過本文所述方法產生的細胞是可自正常或野生型干細胞分化的任何細胞。例如，本發明提供自永生化或條件永生化干細胞制備紅細胞(紅細胞)、淋巴樣細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞、天然殺傷細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、凝血細胞或諸如此類的方法。在具體實施例中，自永生化或條件永生化干細胞制備紅細胞。在其它具體實施例中，自永生化或條件永生化干細胞制備凝血細胞。在一些實施例中，根據本文所述任一方法制備的分化細胞是無核細胞，例如，紅細胞。
[0111]此外，通過根據本文所述任一方法使永生化或條件永生化干細胞分化而制備的所選類型細胞包括(作為非限制性實例)淋巴祖細胞、淋巴母細胞、幼淋巴細胞、幼稚T細胞、T輔助細胞、天然殺傷細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調控T細胞、Y δ T細胞、祖B細胞、早期祖B細胞、晚期祖B細胞、大前B細胞、小前B細胞、不成熟B細胞、成熟B細胞、漿B細胞、記憶B細胞、B-1細胞、淋巴樹突細胞、共同髓樣祖細胞(common myeloid progenitorcell)、原巨核細胞、幼巨核細胞、巨核細胞、凝血細胞、原紅細胞、嗜堿性成紅血細胞、多染性成紅血細胞、正染性成紅血細胞、網織紅細胞、紅細胞、原粒細胞、嗜堿性早幼粒細胞、嗜堿性中幼粒細胞、嗜 堿性晚幼粒細胞、嗜堿性桿狀核細胞、嗜堿性粒細胞、嗜中性早幼粒細胞、嗜中性中幼粒細胞、嗜中性晚幼粒細胞、嗜中性桿狀核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性早幼粒細胞、嗜酸性中幼粒細胞、嗜酸性晚幼粒細胞、嗜酸性桿狀核細胞、嗜酸性粒細胞、成單核細胞、幼單核細胞、單核細胞、巨噬細胞、髓樣樹突細胞及肥大細胞。而且，在一些實施例中，永生化或條件永生化干細胞分化成非譜系細胞，例如上皮、肝臟、肺、胃腸道、腦、心臟、骨骼肌及皮膚細胞。
[0112]在一些實施例中，自永生化或條件永生化間充質干細胞制備骨細胞(bone cell或 osteocyte)、軟骨細胞(cartilage cell 或 chondrocyte)、脂肪細胞(fat cell 或adipocyte)、肺細胞或諸如此類。在某些實施例中，自永生化或條件永生化神經干細胞制備神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞或諸如此類。在一些實施例中，自永生化或條件永生化上皮干細胞制備上皮細胞(例如，組織上皮的組成細胞(component cell))。在某些實施例中，自永生化或條件永生化皮膚干細胞制備角質形成細胞或諸如此類。在一些實施例中，自永生化或條件永生化毛囊干細胞制備毛囊細胞、表皮細胞或諸如此類。
[0113]在某些實施例中，以任何適宜方式使永生化或條件永生化干細胞分化成所選類型的細胞。在一些實施例中，通過使永生化或條件永生化干細胞與誘導分化的試劑(例如，細胞因子)接觸來使所述細胞分化。在某些實施例中，使永生化或條件永生化干細胞與誘導永生化或條件永生化干細胞分化的試劑接觸包含將試劑(或試劑組合)與永生化或條件永生化干細胞一起培養。在某些情形下，細胞因子由細胞表面上的多種細胞受體識別，且觸發與所述受體功能相關的細胞反應。一方面，本文所用的細胞因子是指任何種類的細胞因子，包括自分泌細胞因子、旁分泌細胞因子或內分泌細胞因子。任選地使用用于誘導分化的試劑(例如，細胞因子)或試劑組合。在具體實施例中，用于使永生化或條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化的試劑(例如，細胞因子)包括(作為非限制性實例)以下試劑中的一或多者:IL-1至IL-35范圍內的白細胞介素(IL)家族、干擾素(IFN)、白細胞遷移抑制因子(LMIF)、白血病抑制因子(LIF)、制癌蛋白M(OSM)、骨橋蛋白、紅細胞生成素(EPO)、血小板生成素(THPO)、轉化生長因子β (TGFi3)、腫瘤壞死因子(TNF)、干細胞因子(SCF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、β -凝血球蛋白、C家族趨化因子、CC家族趨化因子、CXC家族趨化因子、CX3C家族趨化因子、凝血細胞因子4、巨噬細胞炎性蛋白、腫瘤自分泌活動因子、肝細胞生長因子、神經白細胞素、T細胞抑制因子、B細胞激活因子、外胚層發育不良因子(ectodysplasins)、Fas-配體蛋白、0X40配體、RANK配體、淋巴毒素或其組合。
[0114]例如，在一些實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與EPO接觸(例如，一起培養)。在其它實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與IL-3、IL-6、G-CSF及EPO接觸(例如，一起培養)。此外，在某些實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成凝血細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與THPO接觸(例如，一起培養)。在其它實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成祖凝血細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與IL-3、IL-6、G-CSF及THPO接觸(例如，一起培養)。在一些實施例中，在本文所述的分化方法中使用細胞因子，例如地塞米松(dexamethasone)、B-雌二醇、胰島素生長因子-1及/或環孢菌素A (cyclosporin A)。
[0115]在一些情形下，在使多種干細胞(例如，造血干細胞)與誘導分化的試劑接觸之前，自條件永生化干細胞切除永生化誘導劑(例如，癌肽及/或編碼癌肽的轉基因及/或抗細胞凋亡肽)。以任何適宜方式來達成永生化誘導劑的切除，包括經由細菌重組酶(例如，Cre 或 Flp)。
[0116]在具體實施例中，本發明提供產生多種分化細胞的方法，其包含:
[0117](d).提供干細胞；
[0118](e).將編碼永生性誘導劑或永生性誘導多肽的轉基因引入條件永生化干細胞中以產生永生化或條件永生化干細胞；及
[0119](f).誘導永生化干細胞分化成所選類型的細胞。
[0120]在多個實施例中，條件永生化干細胞是(作為非限制性實例)干細胞、間充質干細胞、神經干細胞、上皮干細胞、腸干細胞、祖心肌細胞干細胞、皮膚干細胞、毛囊干細胞、骨骼肌干細胞、成骨細胞前體干細胞、肝臟干細胞、胚胎干細胞或諸如此類。在具體實施例中，自任何適宜來源獲得多種干細胞(例如，造血干細胞)。例如，在一些實施例中，干細胞自個體的骨髓、外周血、臍帶或胎兒組織獲得，或者從自個體骨髓、外周血、臍帶或胎兒組織獲得干細胞的來源得到。在一些實施例中，通過麻醉干細胞供體、使用針刺穿后上髂嵴并使用注射器抽吸骨髓細胞來獲得多種干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，自循環血液收獲多種干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，通過給干細胞供體注射細胞因子(例如粒細胞集落刺激因子(G-CSF))來誘使骨髓中的多種干細胞(例如，造血干細胞)以較大數量自骨髓遷移至循環血液中。在某些實施例中，自人類臍帶或胎盤收獲多種干細胞(例如，造血干細胞)。在一些實施例中，多種干細胞(例如，造血干細胞)的來源是胎兒動物的發育中的血液產生組織。在人類中，在約12至18周的人類胎兒的循環血液中發現干細胞(例如，造血干細胞)。[0121]此外，在一些實施例中，本發明提供制備本文所述任一細胞的祖細胞或前體的方法。例如，在一些實施例中，利用本文所述任一方法來制備紅細胞或凝血細胞的祖細胞或前體。所述祖細胞或前體包括(作為非限制性實例)髓樣祖細胞。祖細胞是具有有限分化潛能的細胞。其自多種干細胞(例如，造血干細胞)產生，且產生終末分化的特定細胞亞群。例如，髓樣祖細胞產生髓系細胞，而淋巴祖細胞產生淋巴祖細胞，例如T細胞或B細胞。在某些實施例中,根據本文所述任一方法來產生祖細胞。
[0122]在某些實施例中，對通過本文所述任一方法制備的細胞實施進一步分離以達到最終細胞產物的同質性。例如，紅細胞在分化方法期間經歷多個具有不同形態及特征的階段。在某些實施例中，為收集基本上同質的多種紅細胞，利用各種方法根據形狀、大小、重量及/或體積來分離紅細胞。各種分離方法包括(作為非限制性實例)離心、使用分選機或過濾。在某些實施例中，當終末分化產物不能容易地與培養物中的非分化細胞區分開來時，通過與終末分化形式的細胞特定相關的標記的存在來分離終末分化產物。例如，在一些實施例中，為分離終末分化的巨噬細胞，使用接合熒光物質的Gr-1抗體來處理含有巨噬細胞、永生化或條件永生化干細胞及其它祖細胞的混合物的培養物以識別培養物中的巨噬細胞。在一些實施例中，通過使用FACS設備將所識別的巨噬細胞分離成同質群體。
[0123]在某些實施例中，通過本文所述的任一方法來產生非終末分化的祖細胞。例如，在一些實施例中，給需要持續血液供應而非立即輸注大量紅細胞的個體遞送根據本文所述方法制備的網織紅細 胞或原紅細胞以在活體內持續產生紅細胞。在某些實施例中，為有助于自永生化或條件永生化干細胞分化祖細胞而非終末分化細胞，任選地對細胞因子選擇、濃度及/或自培養基的移除時間進行調節。例如，通過調節所述參數，紅細胞分化朝向有利于產生原紅細胞而非終末分化紅細胞的狀態。在某些實施例中，以任何適宜方式來識別及/或分離祖細胞。在某些實施例中，通過(作為非限制性實例)使用FACS設備來達成分離、識別及/或分開。在一些實施例中，基于附接至Ter-119抗體的能力來識別及/或分離祖紅細胞。圖5顯示條件永生化的多種干細胞(例如，造血干細胞)在活體外分化成表達Ter-119的紅系祖細胞。
[0124]紅細胞及凝血細胞
[0125]此外，本發明提供根據本文所述任一方法制備的分化細胞(例如，紅細胞、凝血細胞或其祖細胞)。
[0126]在一些實施例中，本發明提供制備紅細胞的方法，其包含:
[0127](g).提供條件永生化干細胞；及
[0128](h).誘導條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞。
[0129]在具體實施例中，誘導條件永生化干細胞分化成紅細胞或其祖細胞包含使條件永生化干細胞與紅細胞生成素(EPO)接觸。
[0130]在一些實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與EPO接觸(例如，一起培養)。在其它實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與G-CSF及EPO接觸(例如，一起培養)。在一些實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與IL-3、G-CSF及EPO接觸(例如，一起培養)。在某些實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與IL-3、G-CSF、IL-6及EPO接觸(例如，一起培養)。在其它實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與IL-3、G-CSF、環孢菌素A及EPO接觸(例如，一起培養)。在其它實施例中，根據本文所述任一方法誘導永生化或條件永生化干細胞分化成紅細胞或祖紅細胞包括使永生化或條件永生化干細胞與G-CSF及EPO以及IL-3、IL-6、環孢菌素A或TNF-α中的一或多者接觸(例如，一起培養)。
[0131]在一些實施例中，本發明提供制備凝血細胞的方法，其包含:
[0132](i).提供條件永生化干細胞；及
[0133](j).誘導條件永生化干細胞分化成凝血細胞或祖凝血細胞。
[0134]在具體實施例中，誘導條件永生化干細胞分化成紅細胞或其祖細胞包含使條件永生化干細胞與血小板生成素(THPO)接觸。
[0135]I1.篩詵方法
[0136]在某些實施例中，本發明提供用于識別選擇性地誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化的化合物的方法及試劑盒，其通過以下來實施:
[0137](a).提供條件永生化干細胞；
[0138](b).使條件永生化干細胞與化合物接觸；
[0139](c).檢測或測量化合物對條件永生化干細胞分化狀態的影響；及
[0140](d).在與永生化干細胞接觸時化合物身份未知的情況下，任選地分離及表征與永生化干細胞接觸的化合物。
[0141]在誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成所選類型細胞的化合物的篩選方法中使用本文所揭示的任一永生化或條件永生化干細胞。
[0142]在某些實施例中，使條件永生化干細胞與化合物接觸包含使條件永生化干細胞與化合物在其中條件永生化干細胞未處于永生化狀態的條件下接觸(即，用于條件誘導永生化狀態的外部因子或分子已自條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)移除或尚未暴露于條件永生化干細胞(例如，造血干細胞))。例如，在通過使條件永生化干細胞與Myc-ER或Myc-GR多肽接觸來產生條件永生化干細胞的一些實施例中，使條件永生化干細胞與化合物于不存在雌激素受體調節劑或配體(例如，他莫昔芬或4-羥基他莫昔芬)或糖皮質激素受體配體(例如，米非司酮)下接觸。因此，在所述具體實施例中，ER或GR未激活且融合多肽的Myc結構域仍然不具有功能。在一些實施例中，條件永生化細胞包含TRE-Myc，例如，由tTA或rtTA激活的Myc，并使條件永生化干細胞與化合物接觸但TRE-Myc不激活，例如在tTA激活的Myc情況下不存在四環素時及在rtTA激活的Myc情況下存在多西環素時。
[0143]在一些情形下，在使多種干細胞(例如，造血干細胞)與篩選方法中的化合物接觸之前，自條件永生化干細胞切除永生化誘導劑(例如，癌肽及/或編碼癌肽的轉基因及/或抗細胞凋亡肽)。以任何適宜方式來達成永生化誘導劑的切除，包括經由細菌重組酶(例如，Cre 或 Flp)。
[0144]在某些實施例中，在不存在EPO下實施識別誘導分化的化合物的篩選。在所述情形下，通過所述篩選識別的化合物在沒有EPO幫助下誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成所選類型的細胞(例如，紅細胞)。在一些實施例中，當在不存在EPO下實施篩選時，EPO受體的表達受到破壞。在治療上投予通過本文所揭示篩選方法識別的在不存在EPO下誘導多種干細胞(例如，造血干細胞)分化成紅細胞的化合物不會有長期投予EPO而引起的發生紅白血病(erythroleukemia)的風險。
[0145] 在其它實施例中，在存在EPO下實施誘導多種干細胞(例如，造血干細胞)分化的化合物的篩選。當存在EPO時，通過所述篩選方法識別的化合物調節(例如，增加或降低)EPO的活性。通過本文所揭示篩選方法識別的調節EPO活性的化合物可有效治療紅系白血病(erythroid leukemia)。
[0146]在某些實施例中，在不存在THPO下實施識別誘導分化的化合物的篩選。在所述情形下，在所述篩選中識別的化合物在沒有THPO幫助下誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成所選類型的細胞(例如，凝血細胞)。在一些實施例中，當在不存在THPO下實施篩選時，THPO受體的表達受到破壞。在其它實施例中，在存在THPO下實施篩選。當存在THPO時，通過所述篩選方法識別的化合物調節(例如，增加或降低)ΤΗΡ0的活性。
[0147]在某些實施例中，通過任何適宜方法來檢測或測量化合物對條件永生化干細胞分化狀態的影響，包括(作為非限制性實例)功能獲得篩選(gain-of-function screen)、基因表達及微陣列分析、免疫細胞化學、細胞標記的標記抗體檢測或測量、細胞分子標簽的HPLC分析、小分子熒光團篩選及細胞功能分析。
[0148]在某些實施例中，通過所屬領域的技術人員已知的適宜方法來分離與細胞接觸的化合物，例如(作為非限制性實例)，氣相色譜、高效液相色譜、快速色譜、沉淀及結晶。在某些實施例中，利用業內已知的適宜方法來表征所表征的化合物，例如(作為非限制性實例)，NMR, IR、質譜及X射線晶體學。
[0149]在一些實施例中，本發明提供通過本文所述任一方法識別的化合物。通過篩選各個化合物或化合物的混合物來識別化合物。任選地使條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)與各個化合物或化合物的集合(例如，化合物的組合文庫)接觸。以高通量方式利用比色分析來篩選化合物以識別誘導分化或調節其它分化劑活性的化合物。
[0150]在某些實施例中，用于識別適于誘導多種干細胞(例如，造血干細胞)、尤其條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化的化合物的試劑盒包含多種干細胞(例如，造血干細胞)，尤其條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)，其中所述試劑盒描述本文所述的用于識別誘導多種干細胞(例如，造血干細胞)分化的化合物的篩選方法。
[0151]II1.治療方法
[0152]在治療上或作為研究的細胞來源而任選地使用根據本文任一方法制備的細胞。
[0153]無核細胞缺乏癥
[0154]在某些實施例中，本發明揭示治療特征在于缺乏無核細胞的病癥的方法，其包含:投予根據本文所揭示方法制備的無核細胞。在一些實施例中，所述病癥是貧血(例如，再生障礙性貧血、惡性貧血、缺鐵性貧血、鐮狀細胞性貧血、球形細胞增多癥、溶血性貧血)、高歇氏病、溶血、嗜中性白血球減少癥、血小板減少癥、粒細胞減少、血友病、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡樣淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性髓樣白血病、前B急性淋巴細胞白血病、前T急性淋巴細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、難治性白血病或其組合。在某些情形下，特征在于缺乏無核細胞的病癥是由化學療法引起(部分或完全)。在一些實施例中，通過本發明所揭示方法產生的無核細胞與化學療法共投予。
[0155]在一些實施例中，將凝血細胞、紅細胞或其祖細胞投予或輸注至有需要的個體(例如，患有失血)。在一些實施例中，通過給予髓樣前體細胞以彌補髓樣細胞缺乏來治療患有髓樣細胞亞群數量低的患者。在需要立即輸注的某些實施例中，將根據本文所述方法制備的大量紅細胞及/或凝血細胞投予至個體。在一些實施例中，期望持續輸注血液及/或凝血細胞,且將紅細胞及/或凝血細胞的祖細胞投予至個體。
[0156]在各種病狀個體的細胞替代療法及/或補充療法中任選地使用根據本文所述任一方法制備的所選類型的細胞，所述病狀包括(作為非限制性實例)貧血、嗜中性白血球減少癥、血小板減少癥、粒細胞減少、何杰金氏淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、濾泡樣淋巴瘤、彌漫性大B細胞淋巴瘤、多發性骨髓瘤、急性髓樣白血病、前B急性淋巴細胞白血病、前T急性淋巴細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、難治性白血病或其組合。
[0157]遞送裝置
[0158]任選地將根據本文所揭示任一方法制備的細胞作為目標多肽的遞送運載體投予至患者以用于例如治療或診斷目的。例如，使用根據本文所述方法制備的細胞(例如，紅細胞及凝血細胞)遞送蛋白質的主要優勢包括細胞的短暫性、不含完全成熟的無核細胞中的遺傳物質、以及個體產生的淋巴室(lymphoid compartment)能耐受用于遞送的“自容器”。
[0159]在一些實施例中，多 肽是治療上有益的多肽。在其它實施例中，多肽是診斷性多肽。在某些實施例中，多肽不是癌肽。在一些實施例中，多肽包含輸出序列及質膜保留元件，由此細胞中的或由細胞表達的多肽保留在質膜上。在一些非限制性實施例中，質膜保留元件是GPI連接蛋白、CD8或CD16。在某些實施例中，當細胞中的或由細胞表達的多肽保留在質膜上時，所述多肽進一步包含有助于自細胞表面移除多肽的序列，例如蛋白酶裂解位點。在一些實施例中，蛋白酶裂解位點是血清蛋白酶(例如，人類血清蛋白酶)的底物。使用以此方式產生的細胞通過將特定肽引入患者的外周血中來將所述特定肽遞送至患者中，在外周血中血清蛋白酶將自細胞表面裂解及釋放肽。在質膜上表達所選多肽(包括可裂解多肽)的以本文所揭示方式產生的細胞是遞送治療性蛋白質的運載體。例如，在某些實施例中，當使用紅細胞作為蛋白質遞送的運載體時，主要優勢包括紅細胞及其遞送的編碼蛋白的短暫性、不含完全成熟的無核紅細胞中含有的遺傳物質、使用能被個體產生的淋巴室所耐受的蛋白質遞送容器以及能夠產生用于活體外遞送的細胞。
[0160]在一些實施例中，多肽是誘餌受體。在某些實施例中，誘餌受體是細胞因子受體。在一些實施例中，細胞因子受體是可溶性的。在某些實施例中，誘餌受體是IL3R-FC、IL6R-Fc、TNF- a R-FC, IFN- a R-Fc 或 BAFFR-Fc。
[0161]在其它實施例中，多肽是毒素。在某些實施例中，毒素是蓖麻毒蛋白或白喉毒素。
[0162]在一些實施例中，多肽是血管生成抑制劑。
[0163]在其它實施例中，多肽是促血管生成因子。
[0164]在又一些其它實施例中，多肽是淋巴管生成因子(lymphangiogenic factor)。
[0165]在其它實施例中，多肽是血管擴張肽。
[0166]在其它實施例中，多肽是抗原。
[0167]在又一些其它實施例中，多肽是蛋白酶。在某些實施例中，所述蛋白酶對栓塞團塊(embolitic mass)中的纖維化組織具有特異性。
[0168]在一些實施例中，多肽是諸如病毒、細菌、真菌、原生動物或寄生蟲等微生物的受體。在一些具體實施例中，所述微生物受體是遺傳修飾的微生物受體，其由于對微生物具有較高結合親和性而超過微生物的內源受體。
[0169]在一些實施例中，通過本發明所揭示方法產生的細胞是多肽血管生成抑制劑的遞送運載體。在其它實施例中，多肽是促血管生成因子及/或淋巴管生成因子，且將通過本發明所揭示方法產生的所述細胞投予至患者以遞送用于治療例如凍瘡、與癌癥相關的血管收縮或風濕性關節炎的多肽。
[0170]在又一些其它實施例中，根據本文所揭示任一方法制備的細胞中的或由所述細胞表達的多肽是血管擴張肽。以此方式，通過本文所揭示方法產生的細胞是用于遞送用以治療心肌梗塞、胎兒分娩或偏頭痛期間的血管收縮的蛋白質的運載體。
[0171]在其它實施例中，多肽是抗原。通過本文所揭示方法產生的表達抗原的細胞是用于遞送抗原以產生免疫 反應的運載體。
[0172]在一些實施例中，將所述細胞與鐸樣受體配體(TLR配體)一起遞送至患者以加強終生免疫性。
[0173]在又一些其它實施例中，多肽是蛋白酶。在某些實施例中，所述蛋白酶對栓塞團塊中的纖維化組織具有特異性。例如，在某些實施例中，將表達對栓塞團塊中的纖維化組織具有特異性的蛋白酶的通過本文所揭示方法產生的細胞投予至患者以減少血凝塊形成或降低肺栓塞的風險。
[0174]在一些實施例中，多肽是病毒受體。在一些實施例中，將表達病毒受體的通過本文所揭示方法產生的細胞投予至患者以例如通過將病毒與其天然靶細胞隔離而降低病毒載量。
[0175]圖6顯示致死輻照后通過條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)移植物實施的活體內紅細胞重構-宏觀視圖1。圖7顯示致死輻照后通過條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)移植物實施的活體內紅細胞重構-宏觀視圖1I。圖8顯示致死輻照后通過條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)移植物實施的活體內紅細胞重構-無核紅細胞的顯微鏡視圖。
[0176]IV.牛物反應器
[0177]在一些實施例中，通過使用生物反應器來產生分化的血細胞(例如，紅細胞或凝血細胞)。在某些實施例中，生物反應器是流動反應器或間歇反應器。在具體實施例中，流動反應器是連續流動反應器或間歇流動反應器。在某些實施例中，通過在容器中接種永生化或條件永生化干細胞群體而在反應器中實施合成。在一些實施例中，誘導或使永生化或條件永生化干細胞群體增殖(例如，緣于由其中的多肽引起的對細胞存活、生存及/或增殖的促進)。在制備足夠永生化或條件永生化干細胞群體(例如，至少0.1kg、1kg、IOkg或100kg)后，使所述條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)與誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成期望細胞(例如，根據本文所述任一方法)的培養基接觸。在某些實施例中，隨后收集期望的分化細胞(例如，祖細胞及/或終末分化細胞)。
[0178]本文所述的永生化或條件永生化干細胞能夠冷藏保存(例如，短于約I天、約I天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約2周、約3周、約I個月、約3個月、約4個月、約6個月、約8個月、約9個月、約12個月)。此特征使得能夠方便地大規模按需合成所選類型的細胞。在某些實施例中，對永生化或條件永生化干細胞進行處理以移除永生化基因，且隨后冷藏保存以用于將來分化。在某個實施例中，使永生化或條件永生化干細胞分化成祖細胞(例如原巨核細胞)，并冷藏保存以用于立即產生凝血細胞。
[0179] 在某些實施例中，本發明提供反應器系統，其包含:
[0180](k).進料容器，其包含多種條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)；
[0181](I).反應容器，其包含多種條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)及誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成紅細胞或凝血細胞的試劑，其中所述反應容器與所述進料容器連通 '及
[0182](m).與所述反應容器連通的下游收獲容器，所述收獲容器包含多種紅細胞或凝血細胞。
[0183]在某些實施例中，所述進料容器進一步包含誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)增殖的試劑。在一些實施例中，所述系統進一步包含反應器管控系統，其調控反應容器與進料容器之間以及反應容器與下游收獲反應器之間的連通。在某些實施例中，通過使條件永生化干細胞與Myc基因或多肽及任選地Bcl-2基因(即，Bcl-2轉基因)或多肽接觸來產生條件永生化干細胞。在一些實施例中，通過使條件永生化干細胞與Myc-ER融合基因或融合多肽及任選地Bcl-2基因或多肽接觸來產生條件永生化干細胞。在某些實施例中，誘導多種干細胞(例如，造血干細胞)增殖的試劑是雌激素受體調節劑。在一些實施例中，誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成紅細胞的試劑是IL-3及ΕΡ0。在某些實施例中，誘導條件永生化干細胞(例如，造血干細胞)分化成凝血細胞的試劑是IL-3及 THPO。
[0184]實例
[0185]實例I
[0186]圖1A顯示用于使用MYC.ER及Bcl-2轉導原代鼠科動物HSC細胞的逆轉錄病毒構建體的圖示。產生PMSCV骨架的變體以編碼人類MYC.ER或Bcl-2以及IRES元件及報告基因(EGFP)的cDNA。所得病毒產生雙順反子轉錄物，由此報告基因的表達水平與第一 cDNA的表達水平相關。圖1B顯示自5-氟尿嘧啶治療供體獲得的HSC在使用pMIG-MYC.ER及pMIG-Bcl-2轉導后的流式細胞術分析。圖1C顯示移植顯示于圖B中的經轉導HSC的小鼠中白血病發生的動力學。給致死輻照的小鼠群移植105個經pMIG-MYC.ER及pMIG-Bcl-2轉導的HSC。移植后一周，每周給小鼠注射一次40HT。曲線表示開始注射40HT (在圖中為第O天)后給定時間點時存活小鼠的百分比。所有小鼠一律死于AML樣白血病。此處顯示的數據來自4個獨立實驗中的一個代表實驗。圖1D顯示自白血病小鼠的骨髓回收后不久ctlt-造血干細胞的FACS分析。在建立條件永生化造血干細胞系方法的早期階段，細胞一律表達高水平的GFP，最顯著地表達高水平的c-kit及Sca-1，但不表達Flk_2、⑶34或譜系標記，例如CD19、B220(顯示于圖中)或Thyl.2、Mac-l、Gr-l、Ter-119。圖1E顯示已建立的條件永生化造血干細胞系的FACS分析。擴增條件永生化造血干細胞系并冷藏保存后，其保持穩定的表面表型，此表示于圖B中。所述細胞表達高水平的Sca-1，但具有較低的c-Kit表面水平，且 Flk-2、CD34、B220、CD19 或其它譜系標記(Thyl.2、Gr-l、Mac-l、Ter_119 ;未顯示)仍為陰性。c-kit表面水平的降低似乎為連續信號傳導的結果，這是因為其需要G-CSF來保持其HSC樣表型。圖1F顯示野生型C57/BL6小鼠骨髓的正常未經處理造血干細胞中干細胞標記的FACS分析。骨髓干細胞自野生型未經處理的C57/BL6小鼠獲得。使用c_kit、sca-UFlk-2及⑶34的抗體對細胞進行染色，以比較正常HSC及ctlt-造血干細胞系中標記蛋白質的表達水平。
[0187]實例2
[0188]圖2顯示通過逆轉錄病毒插入物的PCR擴增而實施的條件永生化造血干細胞系的無性系形成能力的分析。我們從獲自C57/BL6小鼠的正常骨髓細胞、或兩種親代細胞系、或七種衍生自親代細胞系的單細胞無性系的細胞系分離基因組DNA。使用嵌套式兩階段PCR程序來擴增整合的逆轉錄病毒插入物。泳道I顯示正常C57/BL6細胞的圖譜(pattern)。泳道2及3顯示多克隆細胞系中逆轉錄病毒整合體的圖譜。泳道4至10顯示最初衍生自任一親代細胞系的單細胞無性系的細胞系中逆轉錄病毒插入物的圖譜。與親代細胞系一樣，克隆群體能夠拯救小鼠脫離致死輻照的危險并產生造血細胞譜系。
[0189]實例3 [0190]圖3顯示在移植ctlt-造血干細胞后產生的成熟免疫細胞的表征。圖3A顯示移植后淋巴組織中衍生自ctlt-造血干細胞的細胞頻率。將C57/BL6小鼠群致死輻照，并給予由IO3個ctlt-造血干細胞及3xl05個自Rag-1+小鼠獲得的載體全骨髓細胞組成的移植物。通過逆轉錄病毒編碼的報告基因GFP在活體內追蹤自條件永生化造血干細胞產生的細胞。嵌合小鼠的骨髓、胸腺、脾及淋巴結中表達GFP的造血細胞的頻率表示于圖A中。所述直方圖是自例示5只小鼠組成的群內每一者的一只小鼠的器官獲得。圖3B顯示骨髓中GFP+髓系細胞的檢測。針對Mac-1及Gr-1對骨髓細胞進行染色。圖B顯示盡管并非嵌合小鼠骨髓中發現的所有髓樣細胞均表達逆轉錄病毒編碼的報告基因，但相當大一部分是GFP+，且因此衍生自ctlt-造血干細胞。圖3C顯示脾中外周成熟淋巴細胞的分析。通過流式細胞術針對成熟T及B細胞對嵌合小鼠的脾進行分析。C圖顯示存在CD4或CD8單一陽性的TCRaB T細胞。另外，C圖還顯示檢測到表面上表達IgM及IgD的⑶19+B細胞。盡管所述脾中成熟T細胞的頻率與野生型未經處理的C57/BL6小鼠中所發現者相當，但B細胞的發育延遲。圖3D顯示條件永生化造血干細胞第二連續傳代后移植物受體小鼠中外周成熟淋巴細胞的分析。自嵌合小鼠收集脾，并制備單細胞懸浮液并且用于FACS分析。比較受體及野生型C57/BL6小鼠中發現的成熟T及B細胞的頻率。圖D顯示在所述脾中以類似于正常小鼠的頻率存在成熟⑶4或⑶8單一陽性TCRa β T細胞。存在⑶19+IgM+及IgD+B細胞，盡管其頻率較正常小鼠低。
[0191]實例4
[0192]圖4顯示ctlt-造血干細胞長期拯救而脫離致死輻照的危險。單獨條件永生化造血干細胞移植未賦予可脫離由失去紅細胞誘導的危險的輻射防護。繪制經致死輻照并給予移植物的小鼠群的卡普蘭/麥耶爾(Kaplan/Mayer)存活曲線，所述移植物由IO3個或IO5個來自兩種不同條件永生化造血干細胞系的細胞(條件永生化造血干細胞或條件永生化造血干細胞.2)組成。所有群均由10只小鼠組成，且所述動物一律死于嚴重貧血。另外，我們還給出了經致死輻照并給予3xl05個自Rag-1+小鼠獲得的載體全骨髓細胞以及IO3個來自任一細胞系的條件永生化造血干細胞的兩個小鼠群的死亡率曲線。每一群由3至4只小鼠組成，且動物在移植后長達6個月仍保持活著且健康。[0193]實例5-通過投予通過本發明所揭示方法產生的紅細胞來活體內治療貧血
[0194]給予兩個健康小鼠群亞致死劑量的輻照以誘導貧血。給第一貧血小鼠群組投予存于適宜載劑中的紅細胞(如本文所揭示而產生)。僅給第二小鼠群組(對照小鼠)投予適宜載劑。比較兩個小鼠群組的死亡率以測定投予本文所揭示紅細胞拯救小鼠脫離貧血危險的功效。
_5] 實例6-在腎衰竭小鼠模型中活體內治療貧血.[0196]如文獻哈馬莫瑞(Hamamori)等人，臨床研究期刊(J.Clin.1nvest.) (1995) ,95:1808-1813中所報導，在腎衰竭小鼠模型中誘導貧血。簡單來說，對7至8周齡的雄性裸小鼠實施兩步驟腎切除術。通過測量血細胞比容水平來證實小鼠貧血。將接受投予通過本發明所揭示方法產生的紅細胞的小鼠的死亡率與僅接受細胞載劑的小鼠的死亡率進行比較，以測定投予本文所揭示紅細胞對于治療由腎衰竭引起的貧血的功效。
[0197]盡管已在本文中顯示及闡述本發明的優選實施例，但所屬領域的技術人員顯然了解所述實施例僅作為實例提供。所屬領域的技術人員現將構想出許多變更、改變及替代，此并不背離本發明。應了解，可在本發明實踐中使用本文所述本發明實施例的各種替代實施例。本發明的范圍 打算由以下權利要求書界定，且因此在所述權利要求書和其等效內容的范圍內的方法和結構均涵蓋在本發明內。
【權利要求】
1.一種制備成熟紅細胞的方法，其包含:在誘導分化成紅細胞的試劑存在下培養條件永生化造血干細胞，其中所述試劑為IL-3和EPO ;其中所述試劑將條件永生化造血干細胞誘導分化為成熟紅細胞； 其中通過以下來產生所述條件永生化造血干細胞: a.使用第一核酸轉導多個造血干細胞，所述第一核酸包含編碼MYC分子的核酸序列； b.使用第二核酸轉導所述造血干細胞，所述第二核酸包含編碼Bcl-2、Bcl-X或其組合的核酸序列；及 c.將所述造血干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養； 且其中在分化之前已抑制所述Myc分子的一種或多種活性，或已抑制Myc分子的存在。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一核酸進一步包含人類雌激素受體的激素結合結構域。
3.根據權利要求1所述的方法，其進一步包含誘導所述Myc分子移位至細胞核。
4.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中所述第二核酸編碼Bcl-2。
5.—種產生成熟紅細胞的方法，其包含:在誘導分化成紅細胞的試劑存在下培養條件永生化造血干細胞，所述試劑為IL-3和EPO ;其中所述試劑將條件永生化造血干細胞誘導分化為成熟紅細胞； 其中通過以下來產生所述條件永生化造血干細胞: a.使多個造血干細胞與重組的第一肽接觸，所述第一肽包含移位至細胞核的MYC分子，所述第一肽具有MYC生物活性； b.使所述造血干細胞與重組的第二肽接觸，所述第二肽包含Bcl-2、BCL-X或其組合，所述第二肽在所述細胞內具有抗凋亡功能；及 c.將所述造血干細胞與IL-3、IL-6、干細胞因子、血小板生成素、Flt3配體或其組合一起培養； 且其中在分化之前所述第一肽的活性或存在降低。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述第一肽、所述第二肽、或所述第一肽與所述第二肽二者包含轉運蛋白序列。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述第一肽、所述第二肽、或所述第一肽與所述第二肽二者包含TAT序列。
8.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的方法，其中所述MYC分子是c-Myc、1-Myc、n-Myc、s-Myc 或其組合。
9.根據權利要求5至7中任一權利要求所述的方法，其中所述第二肽是Bcl-2。
10.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的方法，其進一步包含使所述造血干細胞與雌二醇(E2)、4_羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen) (4-OHT)或二者接觸。
11.根據權利要求1至6中任一權利要求所述的方法，其中所述造血干細胞進一步包含編碼目標多肽的核酸。
12.—種成熟的紅細胞，其由根據權利要求1至6中任一權利要求所述的方法所產生。
13.—種組合物，包括:根據權利要求12所述的成熟的紅細胞，所述組合物用于治療選自由以下組成的群組的病癥:表征為成熟紅細胞的缺陷的病癥、表征為失血的病癥、貧血、高歇氏病、溶血、嗜中性 白血球減少癥、血小板減少癥、粒細胞減少和血友病。
【文檔編號】A61P7/06GK103937749SQ201410168106
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2009年7月21日 優先權日:2008年7月21日
【發明者】優素福·里菲利, 布賴恩·柯蒂斯·特納 申請人:泰加生物工藝學公司