具有治療老年性癡呆及改善學習記憶新用途的14肽化合物的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種用于治療老年性癡呆及改善學習記憶的14肽，其氨基酸序列為：Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser。該14肽可以通過化學合成的方法合成，也可以將14肽序列推導成核苷酸序列，然后克隆到表達載體中進行生物合成。通過14肽對神經細胞培養液中NO及NOS的影響試驗及14肽對Aβ所致大鼠老年性癡呆的治療作用的試驗的結果本發明的14肽用于治療老年性癡呆的活性顯著。14肽對東莨菪堿所致小鼠學習記憶障礙的改善作用試驗結果表明14肽用于改善學習記憶作用明顯。
【專利說明】具有治療老年性癡呆及改善學習記憶新用途的14肽化合物
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種全合成的14肽，以及該14肽為活性成分在制備治療老年性癡呆與改善學習記憶的藥品及保健食品中的應用。
【背景技術】
[0002]老年性癡呆又稱阿爾茨海默病，臨床表現以進行性認知障礙，智力衰退和人格改變為特征。流行病學調查顯示，AD患病率占老年人的7%-8%左右，患病率成逐年上升趨勢。目前該病列死亡原因第4位，成為當年老年醫學所面臨的最為嚴峻的問題之一，據統計顯示，目前，我國約有老年性癡呆患者600萬人，占世界總病例的四分之一，并且每年平均還有30萬的新增病例。老年性癡呆已嚴重危及老年人的健康，并且給患者、家庭和社會帶來了巨大的精神和經濟壓力。
[0003]對于記憶力減退的癥狀常表現為做事丟三落四，注意力分散，不能集中，常伴有頭疼、頭暈、心悸、健忘、多夢等。中醫學認為其因多由五志過極，勞逸失調，素質不強或病后體虛，飲食不節所引發，上述癥狀屬于病癥，目前，該病無明顯治療藥物，雖有些安神、醒腦、鎮靜的藥物具有一定緩解病癥的作用，但療效并不顯著，影響著人們正常生活。
[0004]近年來，國外對肽類作為增強學習和記憶能力活性成分的研究有一定的進展。2010 年 Matharu B.等人(Peptides, 2010, 31,1866-1872 頁)發現一種妝(retro-1nverspeptides)可作為治療由β _淀粉樣蛋白引起的老年癡呆的藥物。Gozes 1.等人(Neurobiology of Aging, 2000, 21,169頁)選用一種具有神經保護作用的肽的片段(NAP)，通過鼻內途徑給藥的方式治療AD。結果顯示，用膽堿能阻斷劑ethylcholineaziridium(AF64A)處理過的小鼠，經鼻吸入NAP，可顯著提高空間學習記憶(水迷宮)能力。實驗結果還表明，該物質可通過血腦屏障。體外實驗結果表明，NAP增加cGMP和一氧化氮產物的同時具有抗氧化作用。其結果表明，NAP可以作為治療阿爾茨海默病藥物開發的先導化合物。SnowA.D.等人(Alzheimer，s and Dementia, 2008, 4(4),463-464 頁)在轉基因鼠模型中發現一種新型可改善阿爾茨海默病情的小肽(DP-74)，這種肽具有可穿過血腦屏障降低腦淀粉樣蛋白沉積以及增強APP轉基因小鼠記憶的作用，揭示了新型小肽對AD和其相關異常疾病的治療與預防方面的發展提供了新的希望。Kita Y.等人(Neuropeptides,2006, 40(6)，434頁)發現一種新型的神經保護性肽Colivelin，它可保護神經免受AD相關損傷及 Αβ 引起的死亡。Windisch Μ.等人(Alzheimer，s and Dementia, 2006, 2(3),643頁)研究發現，β-突觸核蛋白衍生的小肽在慢性的和急性的神經退行性病變的組織培養中表現出顯著地神經保護作用。此小肽同樣在AD的動物模型中進行了研究，包括對認知功能的影響和同樣的減少淀粉樣蛋白的相關病理學改變，結果顯示突觸核蛋白衍生肽可能成為不同神經退行性病變有效治療策略發展的基礎。
[0005]本發明通過全合成方法得到了此14肽，細胞水平與動物的實驗研究結果表明具有較強治療老年性癡呆以及改善學習記憶能力的活性作用，因此該14肽可能成為良好的治療老年性癡呆及改善學習記憶的藥品及保健食品活性成分。
【發明內容】
[0006]本發明的目的之一是提供了一種14肽具有治療老年性癡呆的活性。具體的說是14肽用于治療老年性癡呆的新用途。14肽對神經細胞培養液中NO及NOS的影響試驗表明能夠明顯抑制Αβ 25_35誘導的SH-SY5Y細胞NO含量增加及NOS活性，提示14肽對Αβ 25_35致SH-SY5Y細胞氧化損傷具有較好的保護作用。大鼠Αβ所致老年性癡呆的試驗結果表明14肽具有改善大鼠老年癡呆作用，且能恢復到正常大鼠水平。細胞水平和大鼠整體試驗結果表明本發明的14肽具有較強的治療老年性癡呆的活性作用。
[0007]本發明的目的之二是提供了一種14肽具有改善學習記憶的活性。具體的說是14肽用于改善學習記憶的新用途。東莨菪堿所致小鼠學習記憶障礙試驗表明14肽對小鼠學習記憶障礙有明顯的改善作用。
[0008]在本發明之前，尚未見14肽(氨基酸序列為=Lys-Ser-Leu-Thr- Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser)在治療老年癡呆及改善學習記憶的藥
品及保健食品中的應用的報道。
[0009]本發明的14肽，是通過以下的方法來制備的:
(1)將0.1 mmol Tenta Gel Amide樹脂放入反應器中，加入二氯甲燒溶脹半小時,然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一個氨基被9-芴甲氧羰基保護的絲氨酸0.2 mmol, 二異丙基乙胺0.2 mmol，適量的二甲基甲酰胺和二氯甲烷，此處適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜，用氮氣鼓泡反應60 min,然后加入約I mmol當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈；
(2)加入適量20%哌啶和80 % 二甲基甲酰胺去除9-芴甲氧羰基保護基，露出氨基，洗凈，茚三酮檢測；
(3)往反應器中加入序列中第二個氨基酸天冬氨酸Immol，0.2 mmol N, N’-二異丙基碳二亞胺及1-羥基苯并三唑，氮氣鼓泡反應半小時，抽掉液體，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈，茚三酮檢測；
(4)依步驟1.2,1.3的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈，茚三酮檢測；
(5)將樹脂用氮氣吹干后，從反應柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量的95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應2小時；
(6)濾掉樹脂，得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗即可得到該序列的粗產物；
(7)分析提純和質譜檢測:用電噴霧電離離子源質譜儀檢測該序列分子量的正確性，用凝膠色譜將粗品提純至要求純度；
(8)收集純化好的目標多肽溶液放入凍干機中進行濃縮，凍干成白色粉末，收率為
85%。
[0010]本發明的14肽，除通過上述的化學方法合成外，也可以將14肽序列推導成核苷酸序列，然后克隆到表達載體中進行生物合成。
[0011]本發明的14肽，可以根據需求與其他載體共同制成藥物制劑，這些載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、香味劑、甜味劑。藥物制劑可以是硬膠囊、軟膠囊、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、袋泡茶、口服液、液體飲料、注射劑中的一種或多種。
[0012]I本發明的14肽具有治療老年性癡呆及改善學習與記憶的用途，是通過以下活性試驗得到證實。
[0013]一、本發明14肽對神經細胞培養液中NO及NOS的影響 1.實驗方法
本發明實例中SH-SY5Y細胞獲得自中國科學院細胞庫。
[0014]1.1細胞培養
人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y培養于含10%小牛血清的DMEM培養基中，37°C飽和濕度5% C02培養。每周更換培養基2~3次，0.125%胰蛋白酶工作液消化分散細胞，進行傳代培養。
[0015]1.2八運25_35老化實驗
將A β 25_35用超純水配制成濃度為500 μ mol/L的溶液，在37°C培養箱中放置7天老化，分裝至EP管中，-20 V保存備用。
1.3 A β 25_35致SH-SY5Y細胞損傷濃度的測定
將對數生長期細胞以1.0Χ105的濃度接種至96孔板，每孔100 μ L，培養24小時，對照孔加入培養液100 yL，樣品孔加入Αβ25_35使終濃度為10、20、40、80Mmol/L，每個濃度設定3個復孔，培養24小時，吸取上清，按照試劑盒操作步驟測定NO、NOS0
[0016]1.4細胞培養液中NO、NOS的測定
取對數生長期的SH-SY5Y細胞，胰酶消化后稀釋成I X IO5細胞/mL，接種于96孔板，每孔加100 μL細胞懸液，置培養箱中培養24小時，棄去培養液，對照孔加入不含血清的DMEM培養液120 PL，模型孔加入Αβ 25_35(終濃度為20 Mmol/L)，樣品孔分別加入不含血清的培養液配制的 14 肽(終濃度為 12.5、25、50、100、200、400 Pg/mL)及 A β 25_35 (終濃度為 20 Mmol/L),置培養箱中孵育，分別在24、48小時吸取上清，按照試劑盒操作步驟測定NO、NOS0
[0017]1.5數據統計
所列數據以均數加減標準差(—X 土s)表示，統計學處理方法采用組間t-檢驗。
[0018]2.實驗結果
2.1 A β 25_35致SH-SY5Y細胞損傷濃度的確定
由實驗結果表明(表1)，隨著Αβ25_35濃度的升高，細胞培養液中NO含量及NOS活性增強，Αβ 25_35 2 0 Mmol/L與SH-SY5Y細胞共同孵育24小時，細胞上清中NO含量已經具有極顯著性差異0°〈0.001)，NOS活性與對照組比較雖沒有顯著性差異，也已經有明顯升高，因此選定細胞實驗中模型藥物Αβ 25_35終濃度為20 Mmol/L。
[0019]表1不同濃度A β25_35作用下細胞培養液中NO含量及NOS活性G 土 s，n=3)
【權利要求】
1.一種14肽在制備治療老年性癡呆的藥品、保健食品中的應用。
2.—種14肽在制備改善學習記憶的藥品、保健食品中的應用。
3.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的14肽的氨基酸序列為=Lys-Ser-Leu-Thr-Leu-Thr-Ser-Ser-Leu-Ser-Tyr-Thr-Asp-Ser0
4.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的14肽的制備方法為: (1)將0.1 mmol Tenta Gel Amide樹脂放入反應器中，加入二氯甲燒溶脹半小時,然后抽掉二氯甲烷，加入序列中第一個氨基被9-芴甲氧羰基保護的絲氨酸0.2 mmol，二異丙基乙胺0.2 mmol，適量的二甲基甲酰胺和二氯甲烷，此處適量是指以可使樹脂充分鼓動起來為宜，用氮氣鼓泡反應60 min,然后加入約I mmol當量甲醇，反應半小時，抽掉反應液，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈； (2)加入適量20%哌啶和80 % 二甲基甲酰胺去除9-芴甲氧羰基保護基，露出氨基，洗凈，茚三酮檢測； (3)往反應器中加入序列中第二個氨基酸天冬氨酸Immol，0.2 mmol N, N’-二異丙基碳二亞胺及1-羥基苯并三唑，氮氣鼓泡反應半小時，抽掉液體，用二甲基甲酰胺、甲醇洗凈，茚三酮檢測； (4)依步驟1.2,1.3的方式依次加入序列中氨基酸.抽掉液體，用二甲基甲酰胺洗凈，茚三酮檢測； (5)將樹脂用氮氣吹干后，從反應柱中取下并稱取重量，倒入燒瓶中，然后往燒瓶中加一定量的95 %三氟乙酸切割液，震蕩反應2小時； (6)濾掉樹脂，得到濾液，然后向濾液中加入大量乙醚，析出粗產物，然后離心，清洗即可得到該序列的粗產物； (7)分析提純和質譜檢測:用電噴霧電離離子源質譜儀檢測該序列分子量的正確性，用凝膠色譜將粗品提純至要求純度； (8)收集純化好的目標多肽溶液放入凍干機中進行濃縮，凍干成白色粉末，收率為85%。
5.根據權利要求1或者2所述的用途，其特征在于含有有效治療劑量的14肽及一種或多種藥學上可接受的藥用載體，包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體、潤滑劑、香味劑、甜味劑。
6.根據權利要求1或2所述的用途，其特征在于:它是硬膠囊、軟膠囊、片劑、顆粒劑、散劑、丸劑、袋泡茶、口服液、液體飲料、注射劑中的一種或多種。
【文檔編號】A61K38/10GK104013953SQ201410282671
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】羅浩銘, 王穎, 陳英紅, 姜瑞芝 申請人:羅浩銘