一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述的細菌源性抗生素anisomycin，其結構式如式1所示；所述的anisomycin能明顯抑制16種不同組織學類型的腫瘤細胞的增殖，顯著促進腫瘤細胞凋亡，從而導致實體瘤的瘤體積明顯縮小，荷瘤動物的存活時間顯著延長，且anisomycin的使用劑量低，毒副作用也低于臨床常用的化療藥物。同時本發明還提供了一種細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，該方法制備的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物能大大提高藥物的溶解度至20mg/mL，又能避免常規需要用乙醇或二甲基亞砜等溶劑溶解，毒副作用小，用藥途徑簡單，易操作。
【專利說明】一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腫瘤死亡率高居全世界第一或第二位，極大地威脅著人類的生存與健康。腫瘤治療一直是醫學界面臨的難題，抗腫瘤化合物的不斷涌現給患者帶來了新的希望。抗腫瘤抗生素是由微生物產生的具有抗腫瘤活性的化合物，可分為(I)蒽環類，如阿霉素、柔紅霉素、表阿霉素、米托蒽醌和吡喃阿霉素；(2)放線菌素類，如放線菌素D ； (3)博萊霉素類，如博萊霉素和平陽霉素；(4)絲裂霉素類，如絲裂霉素A、絲裂霉素B和絲裂霉素C ; (5)光輝霉素類，如光輝霉素和橄欖霉素；(6)其它，如鏈脲霉素。這些抗腫瘤藥物的作用機制主要是能抑制DNA合成或抑制RNA合成，此外，鏈脲霉素還能抑制嘧啶核苷代謝和糖原異生的某些關鍵酶。由于這些化療藥物普遍存在用藥劑量大、缺乏選擇性、腫瘤耐藥、對實體瘤的療效差、抑制造血系統、消化系統、免疫系統、神經和內分泌系統的問題，使其臨床應用受到極大的限制。因此，人們仍在為尋找高效低毒和選擇性的化療藥物而不懈努力。
[0003]anisomycin是從鏈霉菌屬Streptomyces的培養液中分離得到的細菌組份(分子式為C14-H19-N-04，分子量265.3)，能夠通過與60S核糖體亞單位結合、阻斷肽鍵形成從而阻止肽鏈延長和導致多核糖體降解，最終抑制蛋白質合成，是一種可逆轉的蛋白合成抑制劑。anisomycin最初被視為抗真菌和抗阿米巴原蟲的抗生素，之后發現anisomycin能夠激活絲裂原活化蛋白激酶家族成員p38和c-Jun氨基末端激酶，因而常被作為絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活劑(Tang ZL, Xing FY et al.1n vivotoxicological evaluat1n of anisomycin.Toxicol Lett, 2012，208 (I): 1-11)。國夕卜學者近來發現它與健忘癥、創傷后記憶恢復及學習等關系密切，又被廣泛用于中樞神經記憶系統中的石開究(Sharma AV, et al.Neurosilence:profound suppress1n of neuralactivity following intracerebral administrat1n of the protein synthesisinhibitor anisomycin.J Neurosci, 2012, 32(7):2377-87 ；Guo X et al.Epigeneticmechanisms of amyloid-β product1n in anisomycin-treated SH—SY5Y cells.Neuroscience.2011, 194:272-81)。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于克服現有技術中臨床上抗腫瘤藥物的用藥劑量高、藥效不理想、缺乏選擇性、產生耐藥性以及抑制造血系統、消化系統、免疫系統、神經和內分泌系統的毒副作用的缺點和不足，提供一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0005]一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用，所述的細菌源性抗生素為anisomycin，其結構式如式I所示:
[0006]
OCH3
H
j\ I:
[0007]所述的細菌源性抗生素ani somycin可作為新型的抗腫瘤藥物，應用于腫瘤的治療。
[0008]一種細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，含有上述細菌源性抗生素；
[0009]上述細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，包含如下步驟:
[0010](I)將10?10mg細菌源性抗生素與0.5?3mL生理鹽水(NS)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)混合；
[0011](2)在步驟(I)得到的溶液中滴加HCl溶液，并輕輕反復抽吸或攪拌直至細菌源性吡咯烷類化合物完全溶解時停止滴加HCl溶液；
[0012](3)在步驟⑵得到的溶液中滴加NaOH溶液，調整pH至7.0?7.2 ;再用生理鹽水(NS)或磷酸緩沖鹽溶液(PBS)補足溶液總體積至I?5mL，得到濃度為10?20mg/mL的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物；
[0013]所述的細菌源性抗生素為anisomycin ；
[0014]步驟⑴、⑵中所述的磷酸鹽緩沖鹽溶液的pH為7.2，其組成如下:NaC18.0g,KCL0.20g, Na2HPO4.12Η203.484g, NaH2PO4.12Η200.20g，用三蒸水定容至 100mL ；
[0015]步驟⑵所述的HCl溶液的濃度為0.5?3.0moI/L ；
[0016]步驟⑵所述的HCl溶液的濃度優選為lmol/L ；
[0017]步驟(3)中所述的的NaOH溶液濃度0.5?3.0moI/L ；
[0018]步驟(3)中所述的的NaOH溶液濃度優選為lmol/L ；
[0019]步驟(I)、⑵和(3)優選在無菌條件下操作；
[0020]步驟(I)和(3)中所述的生理鹽水和磷酸緩沖鹽溶液優選經過無菌處理；
[0021]步驟(2)中所述的HCl溶液優選經過無菌處理；
[0022]步驟(3)中所述的NaOH溶液優選經過無菌處理；
[0023]本發明的原理:腫瘤細胞的本質特性是惡性增值,抑制腫瘤細胞增殖、阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡是遏制腫瘤生長的關鍵環節。本發明發現和確證anisomycin能抑制16種不同組織學類型的腫瘤細胞的增殖，使某些腫瘤細胞主要停滯在G0/G1期，顯著促進腫瘤細胞凋亡，從而導致實體瘤的瘤體積明顯縮小，荷瘤動物的存活時間顯著延長，且anisomycin的使用劑量低，在同樣劑量下的毒副作用也低于臨床常用的化療藥物adriamycin。
[0024]本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果:
[0025](I)本發明首次發現細菌源性抗生素anisomycin在體外能顯著抑制不同組織學類型腫瘤細胞的增殖，尤其是抑制實體瘤的生長，延長荷瘤動物的存活時間，作用優于臨床常用的化療藥物阿霉素(adriamycin),從體內外證明了 anisomycin可作為抗腫瘤藥物的新用途。
[0026](2)anis0mycin主要阻斷腫瘤細胞的蛋白質合成，而目前已發現的抗腫瘤抗生素主要干擾腫瘤細胞的DNA合成，因此，它們的作用機制明顯不同。
[0027](3)anis0mycin的用藥劑量明顯低于現有臨床上常用化療藥物阿霉素的使用劑量，且在有效用藥劑量范圍內毒性較低。
[0028](4)本發明制備的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，無需常規所用對細胞有很大毒性的乙醇或二甲基亞砜等溶劑，使其水溶解度從2mg/mL提高到20mg/mL。用藥途徑簡單，易操作。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1anisomycin對HL60、Jurkat T、K562和B16腫瘤細胞生長抑制率影響的結果分析圖。
[0030]圖2anisomycin對HeLa、U87、!fepG2、A549和MG63腫瘤細胞生長抑制率影響的結果分析圖。
[0031]圖3anisomycin 對 HT29、SGC7901、Ecal09、H印2 和 MDA-MB-231 腫瘤細胞生長抑制率影響的結果分析圖。
[0032]圖4anisomycin對EAC和CT26腫瘤細胞生長抑制率影響的結果分析圖，A =EAC腫瘤細胞組，B:CT26腫瘤細胞組；其中，control:對照組；500ng/mLadriamycin:陽性對照組;*:與對照組比較，Ρ〈0.05 ;林:與對照組比較，Ρ〈0.01。
[0033]圖5anisomycin誘導EAC和CT26腫瘤細胞凋亡的流式圖，A =EAC腫瘤細胞組，B:CT26腫瘤細胞組；其中，control:對照組；500ng/mL adriamycin:陽性對照組；C:CT26荷瘤小鼠瘤內注射5mg/kg anisomycin或adriamycin,治療14d后,瘤組織內腫瘤細胞的凋亡情況。
[0034]圖6anisomycin對EAC荷瘤小鼠的體內治療效果分析圖,A:EAC荷瘤BALB/c小鼠瘤周多點注射5mg/kg anisomycin或adriamycin，治療后實體瘤的瘤體積變化；B:EAC荷瘤BALB/c小鼠瘤周注射5mg/kg anisomycin或adriamycin,治療后荷瘤小鼠的存活時間。
[0035]圖7anisomycin對CT26荷瘤小鼠的體內治療效果分析圖，A:給CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤內注射5mg/kg anisomycin或adriamycin,治療后實體瘤的瘤體積變化；B:給CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤內注射5mg/kg anisomycin或adriamycin,治療后荷瘤小鼠的存活時間；C:給CT26荷瘤BALB/c小鼠瘤內注射5mg/kg anisomycin或adriamycin,治療后原位腫瘤變化。
【具體實施方式】
[0036]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0037]實施例中所述的磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)的pH為7.2，其組成如下:NaC18.0g,KCL0.20g, Na2HPO4.12Η203.484g, NaH2PO4.12Η200.20g，用三蒸水定容至 100mL ；
[0038]實施例1細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備
[0039](I)在無菌條件下，將 10mg anisomycin (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)與3mL無菌PBS混合；
[0040](2)在步驟⑴得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L HCl溶液，并用ImL移液器輕輕反復抽吸，至白色結晶完全溶解時停止滴加HCl溶液；
[0041](3)在步驟(2)得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L NaOH溶液，pH試紙監測溶液pH值以調整pH至7.2，再用PBS補足溶液總體積至5mL，得到透明澄清的濃度為20mg/mL的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，置_20°C下避光保存備用。
[0042]實施例2細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備
[0043](I)在無菌條件下,將1mg anisomycin與0.5mL無菌PBS混合；
[0044](2)在步驟⑴得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L HCl溶液，并用200 μ L移液器輕輕反復抽吸，至白色結晶完全溶解時停止滴加HCl溶液；
[0045](3)在步驟(2)得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L NaOH溶液，pH試紙監測溶液pH值以調整pH至7.0,再用PBS補足溶液總體積至lmL，得到透明澄清的濃度為10mg/mL的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，置_20°C下避光保存備用。
[0046]實施例3細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備
[0047](I)在無菌條件下,將25mg anisomycin與ImL無菌PBS混合；
[0048](2)在步驟⑴得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L HCl溶液，并用ImL移液器輕輕反復抽吸，至白色結晶完全溶解時停止滴加HCl溶液；
[0049](3)在步驟(2)得到的溶液中緩慢滴加無菌雙蒸水配制的lmol/L NaOH溶液，pH試紙監測溶液pH值以調整pH至7.1，再用PBS補足溶液總體積至2mL，得到透明澄清的濃度為12.5mg/mL的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，置_20°C下避光保存備用。
[0050]實施例4 anisomycin抑制不同組織學類型腫瘤細胞增殖
[0051]分別取生長旺盛的人肝癌!fepG2細胞、人食管癌Ecal09細胞、人喉癌H印2細胞、人肺癌A549細胞(人肝癌HepG2細胞、人食管癌Ecal09細胞、人喉癌H印2細胞、人肺癌A549細胞購自武漢大學中國典型培養物保藏中心)、人骨肉瘤MG63細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人胃癌SGC7901細胞、人結腸癌HT29細胞、人宮頸癌HeLa細胞(人骨肉瘤MG63細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人胃癌SGC7901細胞、人結腸癌HT29細胞、人宮頸癌HeLa細胞購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心)、人腦膠質瘤U87細胞、小鼠黑色素瘤B16細胞、人紅白血病K562細胞、人急性T淋巴細胞白血病Jurkat T細胞、人粒細胞白血病HL60細胞、艾氏腹水癌EAC細胞和結腸癌CT26細胞(人腦膠質瘤U87細胞、小鼠黑色素瘤B16細胞、人紅白血病K562細胞、人急性T淋巴細胞白血病Jurkat T細胞、人粒細胞白血病HL60細胞、艾氏腹水癌EAC細胞和結腸癌CT26細胞購自長沙贏潤生物技術有限公司)，1000?1500rpm離心3?5min，棄上清，用含質量分數為5?10% FBS的RPM1-1640培養基調整細胞數為2.5X 105/mL，100 μ L接種于96孔培養板中，各組分別加入anisomycin(終濃度為 1.0ng/mL、5.0ng/mL> 10.0ng/mL、20.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL和160.0ng/mL)，另加等體積的PBS作為對照組。在37°C、5% CO2培養箱中培養48h，每孔加入20 μ L噻唑藍(MTT)，放入培養箱中孵育4h，1500rpm離心3min之后棄上清，每孔加入100 μ L 二甲基亞砜(DMSO)，避光放置于微量振蕩器均勻震蕩lOmin，用酶標儀測量在490nm波長下的OD值，計算細胞增殖抑制率。
[0052]與對照組比較，anisomycin對16種不同組織學類型的腫瘤細胞生長的抑制率隨著濃度的增加而增高，20ng/mL anisomycin組細胞抑制率升高，以40?160ng/mL濃度范圍內更為明顯；對不同組織學類型腫瘤細胞的抑制強度各有不同，其中，對HL-60細胞和CT26細胞的抑制率最高，達80%左右，而HeLa細胞的抑制率最低，約30% ;與adriamycin組比較，anisomycin對CT26細胞的抑制作用強于adriamycin (P<0.05)(圖1?4)。
[0053]實施例5 anisomycin體內外誘導腫瘤細胞凋亡
[0054]分別取生長旺盛的EAC細胞和CT26細胞，1000?1500rpm離心3?5min，棄上清，用含質量分數為5?10% FBS的RPM1-1640培養基調整細胞數為IX 106/mL，接種于12孔培養板中，加入 anisomycin (終濃度為 10ng/mL、20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL 和 160ng/mL),并設adriamycin (終濃度為500ng/mL)陽性對照組和等體積的PBS陰性對照組。置37°C、5% CO2培養箱中培養24h，收集細胞于流式管中，用PBS洗2次(1200rpm，3min)，按細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司產品)說明書操作:500 μ L Binding Buffer重懸細胞，加入5 μ L Annexin V-FITC混勻后，加入5 μ L碘化丙啶(PI)工作液混勻，室溫避光孵育15min ;用流式細胞儀(FACscalibur, BD B1sciences)分析細胞的凋亡情況。
[0055]取生長旺盛的CT26細胞，1000?1500rpm離心3?5min，棄上清，用PBS調整細胞數為lXlOVmL，每只BALB/c小鼠(廣東省醫學實驗動物中心提供)背部右側皮下接種細胞懸液100 μ L0當實體瘤體積平均達到10mm3左右時,瘤內注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin,每天I次,共14次,治療14d后,檢測瘤組織內腫瘤細胞的凋亡情況:取小鼠體內治療后實體瘤組織，剪碎研磨，加入終濃度0.25 %的胰酶消化lOmin，過200目篩網，制成單細胞懸液，收集細胞并調整密度為I X 1VmL,轉移至流式管中，用PBS洗滌2次(1200rpm, 3min),其后處理同上。
[0056]與對照組比較，anisomycin能促進EAC細胞(圖5A)和CT26細胞凋亡(圖5B)，細胞凋亡率隨著anisomycin濃度的增加而增高；160ng/mL ans1mycin誘導細胞的凋亡率高于500ng/mL adriamycin ；CT26細胞對anisomycin誘導凋亡的作用較EAC細胞更敏感；與體外誘導CT26細胞凋亡的結果一致,與對照組比較,anisomycin在體內也能促進實體瘤組織內CT26細胞凋亡,作用優于adriamycin (圖5C)。
[0057]實施例6 anisomycin體內抑制艾氏腹水癌生長，提高荷瘤動物存活率
[0058]取生長旺盛的EAC細胞，1000?1500rpm離心3?5min，棄上清，用PBS調整細胞數為IXlO8AiL,每只BALB/c小鼠(廣東省醫學實驗動物中心提供)背部右側皮下接種細胞懸液100 μ L。將接種EAC細胞的BALB/c小鼠隨機分為3組，每組10只，共30只，分別為對照組，adriamycin陽性對照組和anisomycin治療組。當實體瘤體積達平均達到10mm3左右時，瘤周多點注射5mg/kg的anisomycin或adriamycin,隔天I次,共7次,對照組小鼠注射等體積的PBS。每天用電子游標卡尺測量腫瘤的長度和寬度，按如下公式計算其瘤體積和抑瘤率，并記錄小鼠存活時間:
[0059]
體積(mm5)=|.Lenth(Inm)XWidth(mm)2
[0060]
【權利要求】
1.一種細菌源性抗生素在制備抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于:所述的細菌源性抗生素為anisomycin,其結構式如式I所示:
OCH3 HK0
H式I。
2.—種細菌源性抗生素抗腫瘤藥物，其特征在于:含有權利要求1所述的細菌源性抗生素。
3.權利要求2所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于包含如下步驟: (1)將10?10mg權利要求1所述的細菌源性抗生素與0.5?3mL生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液混合； (2)在步驟(I)得到的溶液中滴加HCl溶液，并輕輕反復抽吸或攪拌直至細菌源性吡咯烷類化合物完全溶解時停止滴加HCl溶液； (3)在步驟⑵得到的溶液中滴加NaOH溶液，調整pH至7.0?7.2 ;再用生理鹽水或磷酸緩沖鹽溶液補足溶液總體積至I?5mL，得到濃度為10?20mg/mL的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物； 所述的細菌源性抗生素為權利要求1所述的anisomycin。
4.根據權利要求3所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟⑵所述的HCl溶液的濃度為0.5?3.0moI/L0
5.根據權利要求4所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟⑵所述的HCl溶液的濃度為lmol/L。
6.根據權利要求3所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的的NaOH溶液濃度為0.5?3.0moI/L0
7.根據權利要求6所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟(3)中所述的的NaOH溶液濃度為lmol/L。
8.根據權利要求3所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟(I)、⑵中所述的磷酸鹽緩沖鹽溶液的pH為7.2，其組成如下:NaC18.0g，KCL0.20g, Na2HPO4.12Η203.484g, NaH2PO4.12Η200.20g，用三蒸水定容至 100mL0
9.根據權利要求3所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟(I)、(2)和(3)在無菌條件下操作。
10.根據權利要求3所述的細菌源性抗生素抗腫瘤藥物的制備方法，其特征在于: 步驟(I)和(3)中所述的生理鹽水和磷酸緩沖鹽溶液經過無菌處理； 步驟(2)中所述的HCl溶液經過無菌處理；
步驟(3)中所述的NaOH溶液經過無菌處理。
【文檔編號】A61K31/40GK104161753SQ201410398211
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月13日 優先權日:2014年8月13日
【發明者】邢飛躍, 劉靜, 潘山, 尤朋濤, 傅海峰 申請人:暨南大學