一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法，包括：將活化的桑黃和靈芝菌種接種于添加黃連木提取物的液體種子培養基中培養制得桑黃和靈芝液體菌種；先將桑黃液體菌種接入添加有胡蘿卜、大麥的固體培養基中培養，培養產物干燥粉碎后得固體培養物Ⅰ；再將靈芝液體菌種接入添加有固體培養物Ⅰ和甘藍酶解物的液體發酵培養基中培養，培養一段時間再接入乳酸菌菌種進行培養得到發酵產物。本發明根據胡蘿卜、甘藍傳統富含葉酸果蔬原料特點及食藥真菌桑黃、靈芝的發酵特性，通過采用先食藥真菌發酵，后乳酸菌發酵的兩階段發酵，提高了最終發酵產物中葉酸的含量，是一種極具工業化前景的生產方法。
【專利說明】一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方 法。
【背景技術】
[0002] 桑黃（Phellinus igniarius)屬擔子菌亞門，層孔菌綱，銹革孔菌科，針層孔菌屬。 桑黃菌提取物在抑制癌細胞轉移和防止癌癥手術后復發等的臨床應用中具有顯著效果，是 目前國際公認的生物治癌藥劑中有效率最高的一種食藥真菌。
[0003] 由于受生理狀態的特殊性和復雜性以及外部環境的制約，造成桑黃在自然界中形 成子實體稀少，特別是形成可用子實體需要多年。而且人工栽培極其困難，培養條件苛刻， 且生長周期長達3-4年，難以滿足日益膨脹的市場需要。采用桑黃液體發酵的方法生產桑 黃藥用活性成分因為具有生產周期短、勞動力省以及受外部環境影響小等優點被認為是一 種有效的方法。目前，國內外對桑黃菌絲體培養生產活性藥用成分研究和工藝應用主要集 中在發酵條件及產物提取分離等層面上，整體發酵水平不高。
[0004] 葉酸（folate)屬于水溶性維生素 B族，是具有蝶酰谷氨酸分子結構的一類化合物 的總稱，又名蝶酰谷氨酸，維生素 Be、維生素 M、維生素 B11。葉酸的重要生理功用是作為一 碳化合物的載體參加代謝活動。葉酸轉化為四氫葉酸衍生物以輔酶形式作為一碳單位的載 體，對轉移甲基和利用甲酸基及甲醛都有重要功用。葉酸在核酸和蛋白質生物合成過程中 也具有重要作用。由于人體內無法自主合成葉酸，幾乎完全依賴于食物攝入，因此當攝入量 不足或利用率降低時，體內便會出現葉酸缺乏的癥狀。近年的研究表明，葉酸缺乏與巨幼紅 細胞性貧血有關，還與兒童智力低下、神經管畸形、心腦血管疾病、某些癌癥（如子宮頸癌、 結腸癌、支氣管癌和食管癌）等有關。葉酸缺乏可導致胎兒神經管畸形、巨幼紅細胞性貧 血，且與心血管疾病、老年性癡呆、直腸癌及子宮頸癌密切相關。膳食葉酸對人類至關重要， 這是因為哺乳動物細胞不能合成葉酸，但組織的生長需要大量葉酸。植物和微生物可以合 成葉酸，是膳食葉酸的重要來源，如植物中的甘藍、柑橘、大麥、扁豆等。
[0005] 基于葉酸對人體健康的重要程度不斷增加，葉酸的開發與應用成為當今世界強化 食品研究與開發的新熱點。天然葉酸的主要來源是綠色植物的葉子、動物肝臟、蛋黃、大豆、 小麥和以葉酸發酵產生的早餐谷物類及酵母當中。市售的葉酸以化學合成為主，但化學合 成的葉酸和天然葉酸在人體內的代謝不盡相同，攝入過多的人工葉酸，會引起不良作用，t匕 如減弱巨噬細胞的吞噬作用，甚至會促進部分癌細胞的生長。而微生物發酵產生的葉酸質 量安全，不會給人體帶來副作用。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法，該方法操作容易，轉 化率高,可明顯提高發酵產物中葉酸含量。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[0008] -種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法，包括步驟：
[0009] (1)食藥真菌液體種子液制備：取活化后的桑黃菌種接種于添加黃連木提取物的 桑黃液體種子培養基中培養3天-10天，得到桑黃液體菌種；取活化后的靈芝菌種接種于添 加黃連木提取物的靈芝液體種子培養基中培養3天-10天，得到靈芝液體菌種；
[0010] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積8% -20%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在22°C -30°C下培養3天-15天后，將 培養產物真空冷凍干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;所述的胡蘿卜固體發酵培養基中 含有胡蘿卜和大麥；
[0011] (3)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積 4% -15 %的用量先接入液體發酵培養基中，在22°C -28°C下培養1天-6天后，調pH值為 4. 0-6. 8,升溫至35°C -37°C并保持在該溫度下2h-2. 5h后，再接入占液體發酵培養基體 積2% -12%的乳酸菌液體菌種培養6h-48h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產 物；所述的液體發酵培養基含有胡蘿卜固體培養物I和甘藍酶解物。
[0012] 本發明根據胡蘿卜、甘藍傳統富含葉酸果蔬原料特點及食藥真菌桑黃、靈芝的發 酵特性，利用食藥真菌具有降解纖維素、果膠、淀粉等物質的酶系，可將纖維素、果膠等分解 為更易被微生物利用的小分子碳源，提高了最終發酵產物中葉酸的含量。
[0013] 所述的桑黃菌種可采用任意一種桑黃菌種，可采用市售產品。例如桑黃 (Phellinus linteus)ACCC51181菌種，來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0014] 所述的靈芝菌種可采用任意一種靈芝菌種，可采用市售產品。例如靈芝 (Ganoderma lucidium)ACCC 51515菌種，來源于中國農業微生物菌種保藏管理中心。
[0015] 為了達到更好的發明效果，進行以下優選：
[0016] 步驟（1)中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為Ig-IOg ;每升 靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為lg-10g。
[0017] 所述的黃連木提取物可以選用市售產品，也可以采用現有方法制備；優選以黃連 木樹葉為原料制備的黃連木提取物，進一步優選由黃連木樹葉乙醇提取物和黃連木樹葉水 提取物組成的黃連木提取物，可采用以下制備方法制備的黃連木提取物，包括：稱取一定量 的黃連木樹葉，粉碎（優選過40目-100目），先加占黃連木樹葉重量10倍量-16倍量的質 量百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清 液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘渣加入占黃連木樹葉重量 10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0018] 步驟（1)中，所述的活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種在添加黃連木提取物 的液體種子培養基中培養的溫度為自然環境溫度，優選為20°C -30°C。一般IL添加黃連木 提取物的液體種子培養基中接入lcm2-4cm2大小的活化后的桑黃菌種菌塊或活化后的靈芝 囷種囷塊。
[0019] 步驟（1)中，桑黃菌種、靈芝菌種的活化方法為本領域常規的菌種活化方法，包 括：將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養基上，進行活化培養，培養 溫度22°C _30°C，培養時間3天-10天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0020] 所述的PDA平板培養基和液體種子培養基均采用本領域種子培養常用的培養基， 可采用市售產品。進一步優選，所述的PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂 15g-20g，用水定容至1000mL。進一步優選，所述的桑黃液體種子培養基：葡萄糖5g-20g、酵 母粉4g、蛋白胨3g、KH 2PO4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。所述的靈芝液體種子培養 基：葡萄糖8g-25g、酵母粉6g、蛋白胨6g、KH2PO 4Ig和MgSO4O. 5g，用水定容至1000mL。
[0021] 步驟（2)中，所述的胡蘿卜固體發酵培養基優選由以下質量百分比的組分組成： K2HPO4O. 1% -0. 2%、MgS040 . 05% -0. 1 %、水40% -65%和余量的營養物質。所述的營養物 質優選由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜70% -90%和大麥10% -30%。
[0022] 所述的胡蘿卜固體發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗 干凈，晾干，切分為lcm-2cm長的片狀或小塊；將1( 2即04、1%504和營養物質充分攪拌均勻，力口 水，使固體培養基中水的質量百分比達到40% -65%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發酵培養 基。
[0023] 步驟（2)中，所述的固體發酵培養的溫度為自然環境溫度，優選為22°C -28°C。
[0024] 步驟（3)中，所述的液體發酵培養基中含有2% -6%的胡蘿卜固體培養物I和 0.05%-0.4%的甘藍酶解物，％為質量百分比。進一步優選，所述的液體發酵培養基由 以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 2% -6%、葡萄糖1% -2%、甘藍酶解物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040 . 05% -0· 1%和余量的水。
[0025] 所述的甘藍酶解物優選甘藍葉酶解物。所述的甘藍葉酶解物的制備方法，包括：將 甘藍葉加水磨成漿液，滅酶；調節漿液pH至4. 0-6. 5,加入纖維素酶在45°C -55°C進行酶解 反應0. 5小時-1. 5小時，滅酶后調節漿液pH至5. 5-7. 5,加入果膠酶在45°C -65°C進行酶 解反應0. 5小時-1. 5小時，滅酶后離心，上清液經過濾、濃縮和干燥，得到甘藍葉酶解物。
[0026] 所述的纖維素酶與甘藍葉的質量比優選為1 :30-100。
[0027] 所述的果膠酶與甘藍葉的質量比優選為1 :25_70。
[0028] 所述的果膠酶的酶活力優選為3. 0萬U/g-5. 0萬U/g、纖維素酶的酶活力優選為 2. 0 萬 U/g-3. 0 萬 U/g。
[0029] 將甘藍葉加水磨成漿液的步驟中，甘藍葉與水的重量比優選為1:8至1:15。所述 的甘藍葉可選用采摘后經清洗、真空冷凍干燥后的甘藍葉，也可直接選用市售的干燥甘藍 葉。
[0030] 所述的滅酶的條件依據酶失活的條件，一般為：90°C -95°c下滅酶5分鐘-8分鐘。
[0031] 所述的甘藍葉酶解物的制備方法中，優選：上清液用截留分子量為lkDa-3. 5kDa 的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，得到甘藍葉酶解物。
[0032] 所述的乳酸菌液體菌種可采用乳酸菌菌種在液體MRS培養基中于35°C _37°C靜置 培養6h-15h獲得。所述的乳酸菌菌種可采用任意一種乳酸菌菌種，可采用市售產品；優選 乳酸乳球菌乳亞種，如乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis) ACCC10535菌種，購于中國 農業微生物菌種保藏管理中心。
[0033] 所述的液體MRS培養基為乳酸菌培養常用的培養基，可采用市售產品，也可采用 現有配制方法配制。一般液體MRS培養基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵母浸 膏5. 0g、葡萄糖20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀2. 0g、 硫酸鎂0. 2g、硫酸錳0. 05g和蒸餾水1. 0升。
[0034] 本發明，調節pH值所用的pH值調節劑采用本領域常用的pH值調節劑，如lmol/L 的HCl水溶液或Imol/L的磷酸水溶液。
[0035] 本發明，所述的富含葉酸的食藥真菌發酵產物經過后續的分離處理后可以測定葉 酸含量。所述的分離處理為本領域常規的分離方法，例如離心或者過濾等分離方法。
[0036] 本發明所用的培養基均需滅菌后使用，滅菌的條件采用本領域的常規條件，例如 可在 120°C _125°C下滅菌 20min-30min。
[0037] 黃連木（Pistacia chinensis Bunge)屬于漆樹科黃連木屬落葉喬木，是一種兼具 藥用、材用、綠化及觀賞價值的優良樹種，也是一種極具開發潛力的能源植物。黃連木中的 活性成分主要分為單寧、黃酮類、萜類、留醇類及多不飽和脂肪酸等，這些成分多具有藥用 和營養價值。本發明優選黃連木的樹葉。
[0038] 胡蘿卜（Daucus carota)是傘形科二年生草本植物的呈肉質的根，另Ij名黃蘿卜、丁 香蘿卜、葫蘆菔金，又被稱為胡蘆菔、紅菜頭、黃蘿卜等。
[0039] 大麥（Hordeum vulgare L.)別名牟麥、飯麥、赤膊麥，為禾本科植物大麥的果實。
[0040] 甘藍（Brassica oleracea L.)為十字花科蕓苔屬的一年生或兩年生草本植物。
[0041] 與現有技術相比，本發明具有如下優點：
[0042] 1.通過微生物發酵生產葉酸，生產過程安全，有利于保護環境，且不受季節限制， 可規模化生產；制成的葉酸產品，吸收利用率高，其生物效價高，可開發成葉酸功能食品 (如口服液）等，營養豐富。
[0043] 2.本發明根據胡蘿卜、甘藍傳統富含葉酸果蔬原料特點及食藥真菌桑黃、靈芝的 發酵特性，利用食藥真菌具有降解纖維素、果膠、淀粉等物質的酶系，可將纖維素、果膠等分 解為更易被微生物利用的小分子碳源，通過采用先食藥真菌發酵，后乳酸菌發酵的兩階段 發酵，提高了最終發酵產物中葉酸的含量和活性。
[0044] 3.本發明以來源廣泛、價廉且富含葉酸的胡蘿卜、甘藍為主要培養原料，使其中的 有益成分得到較好的轉化，有利于葉酸的生成，是一種極具工業化前景的生產方法。
【具體實施方式】
[0045] 下面結合部分具體實施例對本
【發明內容】
進行進一步闡明，但本發明的內容并不僅 限于下面的實施例。
[0046] 桑黃（Phellinus linteus)ACCC51181菌種購于中國農業微生物菌種保藏管理中 心。
[0047] 靈芝（Ganoderma lucidium) ACCC 51515菌種購于中國農業微生物菌種保藏管理 中心。
[0048] 乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactis)ACCC10535菌種購于中國農業微生物菌 種保藏管理中心。
[0049] 實施例1
[0050] 一、材料準備
[0051] 果膠酶（酶活力為5. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0052] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂15g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0053] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養基中于37°C靜置培 養15h獲得。
[0054] 液體MRS培養基的組成為：蛋白胨10. 0g、牛肉浸膏10. 0g、酵母浸膏5. 0g、葡萄糖 20. 0g、乙酸鈉5. 0g、檸檬酸氫二銨2. 0g、吐溫-801. 0ml、磷酸氫二鉀2. 0g、硫酸鎂0· 2g、硫 酸錳0.05g和蒸餾水1.0升。
[0055] IL桑黃液體種子培養基組成為：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0056] IL靈芝液體種子培養基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0057] a.甘藍葉酶解物的制備，包括：將甘藍葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 800mL水，磨成漿液，95°C滅酶5min，使各種酶失活；調節漿液pH5. 5,加入Ig纖維素酶在 50°C進行酶解反應1. 5小時，在95°C下滅酶5分鐘；然后調節漿液pH6. 5,加入I. 5g果膠酶 于55°C進行酶解反應I. 5h，在95°C下滅酶5min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留 分子量為2kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得甘藍葉酶解物。
[0058] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過100目，先加占 黃連木樹葉重量13倍量的質量百分濃度為70%的乙醇水溶液在60°C浸提I. 0h，過濾后得 到上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘渣加入占 黃連木樹葉重量10倍量的蒸餾水在85°C下浸提lh，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷 凍干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0059] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養基上，進行活化培 養，培養溫度25°C，培養時間8天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0060] 二、富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
[0061] (1)食藥真菌液體種子液制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養基中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為8g，25°C培養4天，制備桑黃液體菌種。
[0062] 取2cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養基中，每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為6g，26°C培養5天，制備靈 芝液體菌種。
[0063] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積15%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在25°C下培養12天后，將培養產物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;
[0064] 胡蘿卜固體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：K2HP040.15 %、 MgSO4O. 05%、水55%和余量的營養物質；營養物質由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜 80 %和大麥20%。
[0065] 胡蘿卜固體發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長的片狀或小塊；將K2HPO4JgSO4和營養物質充分攪拌均勻，加水，使固 體培養基中水的質量百分比達到55%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發酵培養基。
[0066] (3)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積10% 的用量先接入液體發酵培養基中，25°C下培養3天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調為 5. 5,升溫至37 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發酵培養基體積8%的乳酸菌液體 菌種培養24h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；
[0067] 液體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 4%、葡萄 糖1.5%、甘藍葉酶解物0.2%、K2HPO4O. HMgSO4O. 05%和余量的水。
[0068] 三、測定
[0069] 葉酸含量的測定（高效液相色譜法）：將步驟（3)獲得的食藥真菌發酵產物經 8000r/min離心IOmin得到上層澄清的發酵液，取上述IOmL澄清的發酵液加入0. 5mL緩沖 液（濃度為〇. 〇5mol/L磷酸緩沖液中加入質量分數為1 %抗壞血酸鈉），50°C，攪拌提取Ih ; 8000r/min離心IOmin ;取上清液經0. 45 μ m膜過濾，進行高效液相色譜分析。對照葉酸純 品的高效液相色譜標準曲線，計算葉酸含量。
[0070] HPLC 色譜條件：C18 柱（4. 6mmX 250mm);流動相：甲醇：水（Na2HPO4-NaH2PO 4 緩 沖液，pH 7. 6) = 10:90,體積比；流速：I. 5mL/min ;柱溫：25°C ;檢測波長：280nm ;進樣 量：20 μ L。
[0071] 檢測結果見表1。
[0072] 實施例2
[0073] 一、材料準備
[0074] 果膠酶（酶活力為4. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為2. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0075] PDA平板培養基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g和瓊脂20g，用水定容至1000ml，自然 pH，在 121°C 下滅菌 20min。
[0076] 乳酸菌液體菌種同實施例1。
[0077] IL桑黃液體種子培養基組成為：葡萄糖15g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0078] IL靈芝液體種子培養基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0079] a.甘藍葉酶解物的制備，包括：將甘藍葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 IOOOmL水，磨成漿液，90°C滅酶8min，使各種酶失活；調節漿液pH6. 0,加入2g纖維素酶在 55°C進行酶解反應1小時，在90°C下滅酶8分鐘；然后調節漿液pH7.0,加入2g果膠酶于 60°C進行酶解反應lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分子 量為3kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得甘藍葉酶解物。
[0080] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過60目，先加占黃 連木樹葉重量16倍量的質量百分濃度為80%的乙醇水溶液在80°C浸提2h，過濾后得到上 清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘渣加入占黃連 木樹葉重量20倍量的蒸餾水在95°C下浸提2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4體 積后加入濃縮物體積5倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷凍 干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0081] C.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養基上，進行活化培 養，培養溫度28°C，培養時間6天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0082] 二、富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
[0083] (1)食藥真菌液體種子液制備：取3cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養基中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為7g，28°C培養8天，制備桑黃液體菌種。
[0084] 取3cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養基中，每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為7g，28°C培養8天，制備靈 芝液體菌種。
[0085] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積12%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在28°C下培養10天后，將培養產物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;
[0086] 胡蘿卜固體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：K2HP040.15 %、 MgSO4O. 08%、水50%和余量的營養物質；營養物質由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜 80 %和大麥20%。
[0087] 胡蘿卜固體發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長的片狀或小塊；將K2HPO4JgSO4和營養物質充分攪拌均勻，加水，使固 體培養基中水的質量百分比達到50%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發酵培養基。
[0088] (3)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積8% 的用量先接入液體發酵培養基中，28°C下培養5天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調為 6. 0，升溫至36 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發酵培養基體積6 %的乳酸菌液體 菌種培養30h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；
[0089] 液體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 5%、葡萄 糖1. 5%、甘藍葉酶解物0· 3%、K2HPO4O. 15%、MgSO4O. 08%和余量的水。
[0090] 三、測定，同實施例1。
[0091] 檢測結果見表1。
[0092] 實施例3
[0093] 一、材料準備
[0094] 果膠酶（酶活力為3. 0萬U/g)、纖維素酶（酶活力為3. 0萬U/g)，由廣西龐博生 物工程有限公司提供。
[0095] PDA平板培養基：同實施例1。
[0096] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養基中于35°C靜置培 養IOh獲得。液體MRS培養基同實施例1。
[0097] IL桑黃液體種子培養基組成為：葡萄糖20g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0098] IL靈芝液體種子培養基組成為：葡萄糖25g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、 KH2P04lg/L、MgSO4O. 5g/L 和余量的水，pH 自然。
[0099] a.甘藍葉酶解物的制備，包括：將甘藍葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1200mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調節漿液pH5. 0,加入I. 5g纖維素酶 在45°C進行酶解反應0. 5小時，在90°C下滅酶8分鐘；然后調節漿液pH6. 0,加入3g果膠 酶于45°C進行酶解反應0. 5h，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截 留分子量為3. 5kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得甘藍葉酶解物。 [0100] b.黃連木提取物的制備，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎過40目，先加占黃 連木樹葉重量10倍量的質量百分濃度為60%的乙醇水溶液在70°C浸提I. 5h，過濾后得到 上清液，上清液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘渣加入占黃 連木樹葉重量15倍量的蒸餾水在90°C下浸提I. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積4倍量的無水乙醇，5000rpm離心IOmin收集沉淀物，沉淀物真空冷 凍干燥后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
[0101] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養基上，進行活化培 養，培養溫度22°C，培養時間10天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0102] 二、富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
[0103] (1)食藥真菌液體種子液制備：取4cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養基中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為10g，22 °C培養10天，制備桑黃液體菌種。
[0104] 取4cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養基中，每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為lg，30°C培養3天，制備靈 芝液體菌種。
[0105] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積18%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在22°C下培養7天后，將培養產物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;
[0106] 胡蘿卜固體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成=K2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1%、 水40%和余量的營養物質；營養物質由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜90%和大麥 10%。
[0107] 胡蘿卜固體發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長的片狀或小塊；將K 2HPO4JgSO4和營養物質充分攪拌均勻，加水，使固 體培養基中水的質量百分比達到40%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發酵培養基。
[0108] (3)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積12% 的用量先接入液體發酵培養基中，22°C下培養6天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調為 5. 0,升溫至35°C并保持在該溫度下2. 5h后，再接入占液體發酵培養基體積10%的乳酸菌 液體菌種培養40h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；
[0109] 液體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 6%、葡萄 糖1 %、甘藍葉酶解物0.4%、K2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1 %和余量的水。
[0110] 三、測定，同實施例1。
[0111] 檢測結果見表1。
[0112] 實施例4
[0113] 一、材料準備
[0114] 果膠酶、纖維素酶和PDA平板培養基，均同實施例1。
[0115] 乳酸菌液體菌種采用乳酸乳球菌乳亞種菌種在液體MRS培養基中于36°C靜置培 養6h獲得。液體MRS培養基同實施例1。
[0116] IL桑黃液體種子培養基組成為：葡萄糖5g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、KH2P04lg/ UMgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0117] IL靈芝液體種子培養基組成為：葡萄糖8g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2P04lg/ UMgSO4O. 5g/L和余量的水，pH自然。
[0118] a.甘藍葉酶解物的制備，包括：將甘藍葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1500mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調節漿液pH6. 5,加入2. 5g纖維素酶 在50°C進行酶解反應1小時，在90°C下滅酶8分鐘；然后調節漿液pH7. 5,加入4g果膠酶 于65°C進行酶解反應lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分 子量為IkDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得甘藍葉酶解物。
[0119] b.黃連木提取物同實施例1。
[0120] c.將斜面保藏的桑黃菌種、靈芝菌種分別接種到PDA平板培養基上，進行活化培 養，培養溫度30°C，培養時間3天，分別得到活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種。
[0121] 二、富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
[0122] (1)食藥真菌液體種子液制備：取Icm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養基中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為lg，30°C培養3天，制備桑黃液體菌種。
[0123] 取Icm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養基中，每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為l〇g，22°C培養10天，制備 靈芝液體菌種。
[0124] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積20%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在30°C下培養3天后，將培養產物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;
[0125] 胡蘿卜固體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成=K2HPO4O. 1%、MgSO4O. 1%、 水65%和余量的營養物質；營養物質由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜70%和大麥 30%。
[0126] 胡蘿卜固體發酵培養基的制備方法，包括：將新鮮胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，晾 干，切分為lcm-2cm長的片狀或小塊；將K 2HPO4JgSO4和營養物質充分攪拌均勻，加水，使固 體培養基中水的質量百分比達到65%，pH值自然，得到胡蘿卜固體發酵培養基。
[0127] (3)液體發酵培養：將步驟⑴中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積15% 的用量先接入液體發酵培養基中，28°C下培養1天后，用lmol/L的HCl水溶液將pH值調為 6. 8,升溫至37°C并保持在該溫度下2. 5h后，再接入占液體發酵培養基體積12%的乳酸菌 液體菌種培養48h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；
[0128] 液體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 2%、葡萄 糖2%、甘藍葉酶解物0. HK2HPO4O. 2%、MgSO4O. 1%和余量的水。
[0129] 三、測定，同實施例1。
[0130] 檢測結果見表1。
[0131] 實施例5
[0132] 一、材料準備
[0133] 果膠酶、纖維素酶、PDA平板培養基、乳酸菌液體菌種、桑黃液體種子培養基和靈芝 液體種子培養基，均同實施例4。
[0134] a.甘藍葉酶解物的制備，包括：將甘藍葉清洗、真空冷凍干燥后，稱量IOOg加 1500mL水，磨成漿液，95°C滅酶8min，使各種酶失活；調節漿液pH4. 0,加入3. 3g纖維素酶 在50°C進行酶解反應1小時，在90°C下滅酶8分鐘；然后調節漿液pH5. 5,加入4g果膠酶 于50°C進行酶解反應lh，在90°C下滅酶8min，得到酶解液；離心酶解液，取上清液用截留分 子量為2kDa的超濾膜超濾，截留液真空濃縮后進行冷凍干燥，獲得甘藍葉酶解物。
[0135] b.黃連木提取物同實施例1。
[0136] c.活化后的桑黃菌種、活化后的靈芝菌種，同實施例4。
[0137] 二、富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法
[0138] (1)食藥真菌液體種子液制備：取2cm2大小活化后的桑黃菌種菌塊接種于IL添加 黃連木提取物的桑黃液體種子培養基中，每升桑黃液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為2g，20°C培養9天，制備桑黃液體菌種。
[0139] 取3cm2大小活化后的靈芝菌種菌塊接種于IL添加黃連木提取物的靈芝液體種子 培養基中，每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加量為9g，20°C培養6天，制備靈 芝液體菌種。
[0140] (2)固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體 積8%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在22°C下培養15天后，將培養產物真空冷凍 干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;
[0141] 胡蘿卜固體發酵培養基，同實施例4。
[0142] (3)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積4% 的用量先接入液體發酵培養基中，26°C下培養2天后，用lmol/L的磷酸水溶液將pH值調為 4. 0，升溫至37 °C并保持在該溫度下2h后，再接入占液體發酵培養基體積2 %的乳酸菌液體 菌種培養6h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；
[0143] 液體發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 2%、葡萄 糖2 %、甘藍葉酶解物0· 05 %、K2HPO4O. 2 %、MgSO4O. 1 %和余量的水。
[0144] 三、測定，同實施例1。
[0145] 檢測結果見表1。
[0146] 對照例
[0147] 乳酸菌液體菌種同實施例1。
[0148] (1)搖瓶種子培養
[0149] IL液體種子培養基：葡萄糖15g/L、酵母粉6g/L、蛋白胨6g/L、KH2P04lg/L、 MgS04(X5g/L和余量為水。pH自然，在121°C下滅菌20min。
[0150] 將實施例1中活化后的靈芝菌種取2cm2大小的菌塊接入滅菌后IL液體種子培養 基中，26°C，120r/min下搖床培養5天，得到培養好的靈芝液體菌種。
[0151] (2)液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占靈芝液體發酵培養基體積 1〇%的接種量接入靈芝液體發酵培養基中，在251：，12〇1'/1^11搖床中培養3天后，用1111 〇1/ L的HCl水溶液將pH值調為5. 5,升溫至37°C并保持在該溫度下2h后，接入占靈芝液體發 酵培養基體積8%的乳酸菌液體菌種培養24h，終止發酵后，得到食藥真菌發酵產物；
[0152] IL靈芝液體發酵培養基組成為：葡萄糖10g/L、酵母粉4g/L、蛋白胨3g/L、 KH2P04lg/L、MgS040. 5g/L 和余量的水，pH 自然，在 121°C下滅菌 20min。
[0153] 檢測結果見表1。
[0154] 表1發酵液中葉酸含量檢測結果
【權利要求】
1. 一種富含葉酸食藥真菌發酵產物的制備方法，其特征在于，包括步驟： (1) 食藥真菌液體種子液制備：取活化后的桑黃菌種接種于添加黃連木提取物的桑黃 液體種子培養基中培養3天-10天，得到桑黃液體菌種；取活化后的靈芝菌種接種于添加黃 連木提取物的靈芝液體種子培養基中培養3天-10天，得到靈芝液體菌種； (2) 固體發酵培養：將步驟（1)中的桑黃液體菌種按占胡蘿卜固體發酵培養基體積 8% -20%的用量接入胡蘿卜固體發酵培養基中，在22°C _30°C下培養3天-15天后，將培養 產物真空冷凍干燥、粉碎后得胡蘿卜固體培養物I ;所述的胡蘿卜固體發酵培養基中含有 胡蘿卜和大麥； (3) 液體發酵培養：將步驟（1)中的靈芝液體菌種按占液體發酵培養基體積4% -15% 的用量先接入液體發酵培養基中，在22°C -28°C下培養1天-6天后，調pH值為4. 0-6. 8,升 溫至35 °C -37 °C并保持在該溫度下2h-2. 5h后，再接入占液體發酵培養基體積2% -12 %的 乳酸菌液體菌種培養6h-48h，終止發酵后，得到富含葉酸的食藥真菌發酵產物；所述的液 體發酵培養基含有胡蘿卜固體培養物I和甘藍酶解物。
2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴中，每升桑黃液體種子培養 基中黃連木提取物的添加量為lg-l〇g ;每升靈芝液體種子培養基中黃連木提取物的添加 量為 lg-l〇g。
3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物為以黃連木樹 葉為原料制備的黃連木提取物。
4. 根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物由黃連木樹葉 醇提取物和黃連木樹葉水提取物組成。
5. 根據權利要求1或3所述的制備方法，其特征在于，所述的黃連木提取物的制備方 法，包括：稱取一定量的黃連木樹葉，粉碎，先加占黃連木樹葉重量10倍量-16倍量的質量 百分濃度為60% -80%的乙醇水溶液在60°C -80°C浸提lh-2h，過濾后得到上清液，上清 液濃縮后真空冷凍干燥得提取物II ;上述醇提后的黃連木樹葉殘渣加入占黃連木樹葉重量 10倍量-20倍量的水在85°C -95°C下浸提lh-2. 5h，過濾后得到上清液，上清液濃縮至1/4 體積后加入濃縮物體積2倍量-5倍量的無水乙醇，離心收集沉淀物，沉淀物真空冷凍干燥 后得提取物III，合并上述提取物II和提取物III得黃連木提取物。
6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述的胡蘿卜固體 發酵培養基由以下質量百分比的組分組成：K2HP0 40. 1 % -0. 2%、MgS040. 05% -0. 1%、水 40% -65%和余量的營養物質；所述的營養物質由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜 70% -90 %和大麥 10% -30%。
7. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的液體發酵培養基 中含有2% -6%的胡蘿卜固體培養物I和0. 05% -0. 4%的甘藍酶解物，％為質量百分比。
8. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的液體發酵培養基 由以下質量百分比的組分組成：胡蘿卜固體培養物I 2% -6%、葡萄糖1% -2%、甘藍酶解 物 0· 05% -0· 4%、Κ2ΗΡ040· 1% -0· 2%、MgS040. 05% -0· 1%和余量的水。
9. 根據權利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的甘藍酶解物為甘藍葉酶解 物。
10. 根據權利要求1或7所述的制備方法，其特征在于，所述的甘藍酶解物的制備方法， 包括：將甘藍葉加水磨成漿液，滅酶；調節漿液pH至4. 0-6. 5,加入纖維素酶在45°C -55°C 進行酶解反應〇. 5小時-1. 5小時，滅酶后調節漿液pH至5. 5-7. 5,加入果膠酶在45°C_65°C 進行酶解反應〇. 5小時-1. 5小時，滅酶后離心，上清液經過濾、濃縮和干燥，得到甘藍葉酶 解物。
【文檔編號】A61K36/074GK104256575SQ201410562582
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】程俊文, 賀亮, 胡傳久, 魏海龍, 付立忠, 李海波 申請人:浙江省林業科學研究院