用于軟骨退行性變的使用橄欖苦苷和槲皮素的組合的組合物和方法與流程

1.本發明涉及關節健康，并且具體地涉及包含橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其代謝物的組合的組合物用于預防或治療關節障礙或維持關節健康的用途。


背景技術：

2.骨關節炎(oa)是一種具有重要社會經濟影響的高流行性疾病。其是關節的關節軟骨的退行性疾病，并且是關節炎的最常見形式，影響10％的成人群體。oa是全世界老年人殘疾和衛生保健花費的主要原因。關節軟骨的漸進退行性變和損失是主要的病狀特征，伴隨著其它關節結構的改變，諸如滑膜增生、軟骨下骨的硬化和增厚、關節邊緣的骨贅形成、韌帶松弛和肌肉萎縮，所有這些都導致了oa的臨床癥狀。這些癥狀包括劇烈的疼痛、僵硬、關節運動損失和殘疾。因為關節軟骨僅依賴于其固有細胞(軟骨細胞)來維持細胞外基質，所以軟骨細胞功能和生存受到損害將導致關節軟骨的衰竭。
3.最近的離體研究已經報道了人oa軟骨細胞中的線粒體功能障礙，并且這些細胞中線粒體電子傳輸鏈活性的分析示出與正常軟骨細胞相比，復合物i、ii和iii的活性降低，并且atp產生降低。這種線粒體功能障礙可影響與軟骨退行性變有關的幾種途徑，包括氧化應激、軟骨細胞生物合成和生長反應缺陷、細胞因子誘導的軟骨細胞炎癥和基質分解代謝增加、軟骨基質鈣化和軟骨細胞凋亡增加(blanco等人，
″
the role of mitochondria in osteoarthritis
″
nat.rev.rheumatol.7，161-169(2011)。
4.線粒體是哺乳動物細胞中有氧能量產生的主要來源，并且還在其內膜上維持大ca2+梯度，從而為該分子提供信號電勢。此外，線粒體ca2+在線粒體中起到atp生成的調節方面的作用，并且潛在地有助于細胞代謝穩態的協調。(glancy，b.和r.s.balaban(2012年)，
″
role of mitochondrial ca2+in the regulation of cellular energetics
″
，biochemistry，第51期第14卷：第2959-2973頁)。
5.盡管患有oa的個體增加，但是仍然沒有治愈方法，并且目前的醫學療法仍然僅僅是保守療法，關注于緩解癥狀。例如，使用止痛藥(諸如對乙酰氨基酚)和非甾體抗炎藥物(nsaid)治療疼痛和炎癥。此外，這些藥物的使用通常與副作用諸如胃腸或心血管風險相關聯。因為目前對oa的治療不能預防或治愈oa，所以軟骨細胞凋亡將是調節軟骨退行性變的有效靶點。


技術實現要素：

6.本發明人已經令人驚訝地展示出，橄欖苦苷(或橄欖苦苷苷元)和槲皮素的組合經由線粒體鈣升高在細胞水平上協同地激活線粒體功能。
7.因此，本發明的一個目的涉及提供用于改善關節健康的組合物。具體地講，本發明的一個目的是提供通過預防或治療軟骨退行性變來改善關節健康的組合物，并解決現有技術中關于副作用(諸如胃腸和/或心血管風險)的上述問題。
8.因此，本發明的一個方面涉及包含有效量的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合的組合物，其用于預防或治療個體的軟骨退行性變。
9.本發明的另一個方面涉及一種制造根據本發明的用途的組合物的方法。
10.在最后一個方面，本發明涉及一種套件，該套件包括在一個或多個容器中的有效量的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合。
11.另外的特征和優點在本文中有所描述，并且將從以下附圖和具體實施方式中顯而易見。
附圖說明
12.圖1是示出在海拉(hela)細胞刺激期間，橄欖苦苷(ole)與槲皮素(q)協同作用以經由線粒體ca2+升高激活線粒體的圖。插圖示出了橄欖苦苷(3μm，黑色)、槲皮素(3μm，灰色)以及3μm橄欖苦苷+3μm槲皮素(ole/q)的組合對由100μm組胺誘發的整合線粒體鈣升高的效果。插圖中的數據用于在主圖中確定組合(橄欖苦苷+槲皮素，ole/q)的預期理論效果(橄欖苦苷效果和槲皮素效果之間的總和)和實際測量效果，并推斷協同作用。結果表示為n＝6-9次實驗的平均值+/-sem。*指示線粒體鈣中的測得值相對于理論差異的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
13.圖2是示出在受刺激的海拉細胞中，橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體的圖。插圖示出了橄欖苦苷(3μm，黑色)、槲皮素(3μm，灰色)以及3μm oea+3μm q(oea/q)的組合對由100μm組胺誘發的整合線粒體鈣升高的效果。插圖中的數據用于在主圖中確定組合(oea+槲皮素，oea/q)的預期理論效果(oea效果和槲皮素效果之間的總和)和實際測量效果，并推斷協同作用。結果表示為n＝6-9次實驗的平均值+/-sem。*指示線粒體鈣中的測得值相對于理論差異的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
14.圖3是示出在受刺激的海拉細胞中，橄欖苦苷(ole)不與橄欖苦苷苷元(oea)協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體的圖。柱狀圖示出了橄欖苦苷(3μm，黑色)、橄欖苦苷苷元(3μm，灰色)和3μmole+3μm oea的組合(ole/oea)對由100μm組胺誘發的整合線粒體鈣上升的效果。結果表示為n＝6-9次實驗的平均值+/-sem。*指示線粒體鈣中的測得值相對于理論差異的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(單因素anova檢驗)。
15.圖4是示出橄欖苦苷(ole)和橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)組合促進相同水平的協同作用的圖。如圖1和圖2中所述計算協同作用。結果表示為n＝6次實驗的平均值+/-sem。ns，不顯著，指示兩組(組合)之間沒有統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
16.圖5示出骨關節炎軟骨細胞(sw1353細胞，用促炎細胞因子白介素-1β，il-1β處理)的
″
體外
″
模型，其揭示了軟骨細胞功能障礙。因此，圖5a是示出與對照軟骨細胞相比，膠原-iia1含量在該模型中顯著降低的圖。此外，圖5b和圖5c是示出金屬蛋白酶mmp3(圖5b)和mmp13(圖5c)的表達在il-1β處理的細胞中增加的兩個圖。結果表示為每個條件，n＝5(圖5a)或n＝3(圖5b)或n＝4(圖5c)次實驗的平均值+/-sem。*指示對照相對于用il-1β處理24小時或48小時的sw1353細胞的統計意義上的顯著差異，如圖所示，p＜0.05(單因素anova檢驗)。
17.圖6示出骨關節炎軟骨細胞(用il-1β處理的sw1353細胞)的
″
體外
″
模型，其揭示了
sw1353軟骨細胞的細胞死亡增加。因此，在il-1β處理5天后膜聯蛋白-v陽性細胞顯著增加，如圖所示。結果表示為每個條件n＝11次實驗的平均值+/-sem。*指示在指定時間點處，對照相對于用il-1β處理的sw1353細胞的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
18.圖7示出骨關節炎軟骨細胞(用il-1β處理的sw1353細胞)的
″
體外
″
模型，其揭示了線粒體功能障礙，其中線粒體膜電位受損。因此，在il-1β24小時后，線粒體膜電位傳感器jc10的熒光比(在590nm/525nm處)顯著降低，從而指示線粒體的通電減少。結果表示為每個條件n＝8次實驗的平均值+/-sem。*指示在指定時間點處，對照相對于用il-1β處理的sw1353細胞的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(單因素anova檢驗)。
19.圖8示出骨關節炎軟骨細胞(用il-1β處理的sw1353細胞)的
″
體外
″
模型，其揭示了在刺激期間線粒體功能障礙，其中線粒體鈣攝取受損。該圖示出在所示時間點處，由激動劑(組胺)刺激的線粒體ca2+升高，在用il-1β處理的sw1353細胞中減少。結果表示為每個條件n＝46-96次實驗的平均值+/-sem。*指示在指定時間點處，對照相對于用il-1β處理的sw1353細胞的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(單因素anova檢驗)。
20.圖9示出線粒體鈣攝取功能障礙(mcu-敲低，mcu-kd)的軟骨細胞(sw1353細胞)的
″
體外
″
遺傳模型，其揭示了軟骨細胞功能受損。圖9a是示出在mcu-消融的sw1353細胞(mcu-kd)中mcu的表達減少的蛋白質印跡。如圖9b和圖9c所示，當mcu，介導線粒體中鈣攝取的轉運蛋白的表達減少時，膠原-iia1含量和聚集蛋白聚糖含量分別顯著減少。此外，圖9d是示出金屬蛋白酶mmp3的表達在mcu耗盡的細胞中增加的圖。結果表示為在每個圖(圖9b、圖9c、圖9d)中，每個條件n＝3次實驗的平均值+/-sem。*指示對照相對于mcu耗盡的細胞的統計意義上的顯著差異，如圖所示，p＜0.05(單因素anova檢驗)。
21.圖10是示出在前述圖中描述的骨關節炎軟骨細胞(用il-1β)處理的sw1353細胞)的細胞模型中，橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體的圖。插圖示出了橄欖苦苷苷元(0.3μm，黑色)、槲皮素(3μm，灰色)和0.3μm oea+3μm q的組合(oea/q)對由100μm組胺誘發的整合線粒體鈣上升的效果。插圖中的數據用于在主圖中確定組合(oea+槲皮素，oea/q)的預期理論效果(oea效果和槲皮素效果之間的總和)和實際測量效果。*指示線粒體鈣中的測得值相對于理論差異的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
22.圖11是示出在前述圖中描述的骨關節炎軟骨細胞(用il-1β)處理的sw1353細胞)的細胞模型中，橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)的幾種組合協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體的圖。oea和q的量顯示在每個圖(a、b、c)的上部中，并且以微摩爾(mm)表示。如圖10所述，測量該組合(oea+槲皮素，oea/q)的預期理論效果(oea效果和槲皮素效果之間的總和)和實際測量效果，并且在此將它們進行比較以推斷協同作用。結果表示為對于每個條件，n＝7次實驗的平均值+/-sem。*指示線粒體鈣中的測得值相對于理論差異的統計意義上的顯著差異，p＜0.05(學生t檢驗)。
具體實施方式
23.定義
24.在進一步詳細討論本發明之前，首先定義下列術語和慣例。
25.在本發明的上下文中，提及的百分比為重量/重量百分比，除非另行指出。
26.在
″
x和/或y
″
上下文中使用的術語
″
和/或
″
應解釋為
″
x
″
或
″y″
，或者
″
x和y
″
。
27.本文所用的數值范圍旨在包括該范圍內包含的每個數值和數值子集，無論是否具體公開。另外，這些數值范圍應理解為對涉及該范圍內任何數值或數值子集的權利要求提供支持。例如，1至10的公開應理解為支持1至8、3至7、4至9、3.6至4.6、3.5至9.9等的范圍。
28.術語
″
預防
″
是指將本文所公開的組合物施用于沒有顯示該病癥的任何癥狀的個體以降低或預防與該病癥相關的至少一種癥狀的發展。此外，
″
預防
″
包括減少病癥或障礙的風險、發生率和/或嚴重程度。
29.如本文所用，
″
有效量
″
是在個體中治療或預防缺陷、治療或預防疾病或醫學病癥的量，或更一般地說，是減少癥狀、管理疾病進展或向個體提供營養、生理或醫學益處的量。
30.″
動物
″
包括但不限于哺乳動物，其包括但不限于嚙齒動物；水生哺乳動物；家畜，諸如狗、貓和其它寵物；農場動物，諸如綿羊、豬、牛和馬；和人類。在使用
″
動物
″
、
″
哺乳動物
″
或它們的復數形式時，這些術語還適用于能夠具有通過段落上下文表現出的或意欲表現出的作用的任何動物，例如受益于改善的線粒體鈣輸入的動物。雖然本文中常用術語
″
個體(individual)
″
或
″
個體(subject)
″
來指人，但本公開并非限制于此。因此，術語
″
個體(individual)
″
或
″
個體(subject)
″
是指可受益于本文所公開的方法和組合物的任何動物、哺乳動物或人。
31.術語
″
寵物
″
意指可得益于或享用本公開所提供組合物的任何動物。例如，寵物可以是鳥類動物、牛科動物、犬科動物、馬類動物、貓科動物、山羊類動物、狼類動物、鼠科動物、綿羊類動物或豬類動物，但寵物也可以是任何合適的動物。術語
″
伴侶動物
″
意指狗或貓。
32.″
受試者
″
或
″
個體
″
是哺乳動物，優選人。在人的背景中，術語
″
老年
″
是指自出生起的年齡為至少60歲，優選63歲以上，更優選65歲以上，并且最優選70歲以上。在人的上下文中，術語
″
中老年
″
是指自出生起年齡為至少45歲，優選50歲以上，更優選55歲以上，并且包括老年個體。在人的上下文中，術語
″
中老年
″
是指自出生起年齡為至少45歲，優選50歲以上，更優選55歲以上，并且包括老年個體。
33.″
口服營養補充劑
″
或
″
ons
″
是包含至少一種宏量營養素和/或至少一種微量營養素的組合物，例如無菌液體、半固體或粉末的形式，并且旨在補充其它營養攝入量，諸如來自食物的營養攝入量。可商購獲得的ons產品的非限制性示例包括和在一些實施方案中，ons可以是可在不進一步添加液體的情況下食用的液體形式的飲料，例如為一份組合物的一定量液體。
34.″
套件
″
是指該套件的多個組分在一個或多個容器中物理上相關聯，或與一個或多個容器物理上相關聯，而且被視作制造、分裝、銷售或使用的單元。容器包括但不限于袋、盒、紙盒、瓶、外包裝、收縮包裝、附連部件(例如，裝訂部件、粘附部件等)，任何類型、任何設計或任何材料的包裝，或它們的組合。
35.本發明提及的所有單數特征或限定應該包括對應的復數特征或限定，反之亦然，除非提及這些內容的語境中另外指明或明確暗示與此相反。
36.除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語的含義與本領域的技術人員通常所理解的含義相同。
37.使用的組合物
38.關節疾病可伴有或大或小程度的炎癥。在一些疾病中，炎癥是最重要的組成，諸如例如在類風濕性關節炎(ra)中。在其它疾病中，諸如例如oa，炎癥看起來不那么顯著。然而，這兩種疾病都具有分解代謝組分，其中關節軟骨被分解。
39.本發明人已示出，提供橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或衍生物的組合協同地改善了例如在骨關節炎中改變的線粒體功能。
40.因此，本發明在第一方面涉及包含有效量的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合的組合物，其用于改善關節健康，例如預防或治療個體的軟骨退行性變。
41.在另一種方式中，本發明的這一方面可以描述為有效量的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合在制備用于預防或治療個體的軟骨退行性變的藥物中的用途。
42.用于預防或治療軟骨退行性變的用途與用于抑制或減少軟骨退行性變的用途同義。
43.因此，本發明的實施方案包括包含有效量的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合的組合物，其用于預防或治療軟骨退行性變。
44.本發明的另外的實施方案包括根據本發明的用途的組合物，其中該組合物還包含鈣。
45.成分-主要生物活性化合物
46.橄欖苦苷和槲皮素是根據本發明的主要生物活性分子。
47.橄欖苦苷是存在于屬于木犀科的植物、并且尤其是油橄欖的果實、根部、樹干中并且更具體地葉片中的多酚。
48.在一個實施方案中，橄欖苦苷的至少一部分通過提取獲得，例如通過從植物諸如屬于木犀科的植物中提取，優選地從屬于木犀科的植物諸如油橄欖(橄欖樹)、女貞屬的植物、丁香屬的植物、白蠟屬的植物、茉莉屬的植物和木犀屬的植物的莖、葉、果實或果核中的一者或多者中提取。附加地或另選地，橄欖苦苷和/或代謝物的至少一部分可通過化學合成獲得。
49.橄欖苦苷的合適代謝物的非限制性示例包括橄欖苦苷苷元、羥基酪醇、橄欖酸、高香草醇、異高香草醇、它們的葡糖醛酸化形式、它們的硫酸化形式、它們的衍生物、以及它們的混合物。
50.槲皮素是存在于柑橘類果實、蕎麥和洋蔥中的許多其它黃酮苷的苷元形式，諸如蕓香苷和櫟素。槲皮素分別來自糖苷櫟素和蕓香苷連同鼠李糖和蕓香糖。
51.類似地，番石榴苷是3-o-阿拉伯糖苷，金絲桃苷是3-o-半乳糖苷，異槲皮素是3-o-葡糖苷，并且繡線菊苷是
′?
o-葡糖苷。miquelianin是槲皮素3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷。
52.在一個優選的實施方案中，槲皮素的衍生物可選自槲皮素3-o-半乳糖苷、槲皮素3-o-葡糖苷(izoquercetin)、槲皮素3-o-木糖苷、槲皮素3-o-鼠李糖苷(櫟素)、槲皮素3-o-葡糖苷酸、槲皮素7-o-葡糖苷、槲皮素3-o-二葡糖苷、槲皮素3,4
′?
二葡糖苷、槲皮素3-o-鼠李糖苷-7o-葡糖苷、槲皮素3-o-蕓香糖苷(蕓香苷)、槲皮素3-o-6
″?
乙酰基葡糖苷、槲皮素3-甲醚、槲皮素3，3
′?
二甲醚、以及它們的混合物。
53.槲皮素可來自任何合適的來源，并且可分離和/或化學合成。
54.在一個優選的實施方案中，橄欖苦苷和槲皮素以及衍生物從植物來源中獲得。例如，橄欖苦苷可以從橄欖植物中獲得，蕓香苷可以從洋蔥中獲得，槲皮素可以從洋蔥、綠茶、蘋果、漿果、銀杏、圣約翰草、美洲接骨木、蕎麥茶等中獲得。
55.橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物中每一者的有效量隨特定組合物、接受者的年齡和病癥以及所治療的特定障礙或疾病而變化。然而，在一般實施方案中，每天可向個體施用0.001mg至1.0g，優選地每天0.01mg至0.9g，更優選地每天0.1mg至750mg，更優選地每天0.5mg至500mg，并且最優選地每天1.0mg至200mg。此外，本發明人發現可降低組合中橄欖苦苷或衍生物的活性劑量以獲得等同功效。
56.在一些實施方案中，橄欖苦苷或代謝物與槲皮素或衍生物的組合以還包含鈣的組合物形式施用。鈣的至少一部分可為一種或多種鈣鹽，諸如乙酸鈣、碳酸鈣、氯化鈣、檸檬酸鈣、葡乳醛酸鈣、葡萄糖酸鈣、乳酸鈣或它們的混合物。在一般實施方案中，每天向個體施用0.1g至1.0g的鈣，優選每天125mg至950g的鈣，更優選每天150mg至900mg的鈣，更優選每天175mg至850mg的鈣，并且最優選每天200mg至800mg的鈣。
57.在另選的實施方案中，橄欖苦苷和槲皮素的組合可與鈣以單獨的組合物形式依次施用。術語
″
依次
″
意指鈣與橄欖苦苷或其代謝物中的至少一者以相繼的方式施用，使得橄欖苦苷或其代謝物中的至少一者在第一時間施用但不施用鈣，并且鈣在第二時間(在第一時間之前或之后)施用但不施用橄欖苦苷和槲皮素的組合。在順序施用之間的時間可以是例如在同一天中的一秒或幾秒、一分鐘或幾分鐘或一小時或幾小時；同一個月中的一天或幾天或一周或幾周；或同一年中的一個或幾個月。
58.在一些實施方案中，橄欖苦苷或其代謝物與槲皮素或其衍生物是組合物中的唯一多酚和/或施用給個體的唯一多酚。
59.該組合物可包含有效量的橄欖苦苷或其代謝物中的至少一者。例如，組合物的單份或劑量可包含有效量，而包裝可包含一份或多份，或一個或多個劑量。任選地，組合物還可包含鈣。
60.在另一個實施方案中，橄欖苦苷和/或衍生物可以通過wo 2019/092068和wo 2019/092066(各自名稱為
″
橄欖苦苷的生物轉化(bioconversion of oleuropein)
″
和
″
選擇益生菌的方法(method of selecting a probiotic)
″
)以及wo 2019/092069(名稱為
″
高香草醇(hva)、hva異構體、制備包含此類化合物的組合物的方法和使用此類化合物的方法(homovanillyl alcohol(hva)，hva isomer，methods of making compositions comprising such compounds，and methods of using such compounds)
″
)中所公開的組合物中的任一種和方法來提供，這些專利文獻各自全文以引用方式并入本文。
61.成分-另外的生物活性化合物
62.根據本發明的用途的組合物還可包含至少一種選自抗氧化劑、抗炎化合物、糖胺聚糖、益生元、纖維、益生菌、脂肪酸、酶、礦物質、痕量元素和/或維生素的另外的生物活性化合物。
63.在本技術的上下文中，術語
″
生物活性
″
意指除了滿足基本營養需要之外，該化合物有助于個體的健康，或對人體有作用。
64.至少一種另外的生物活性化合物可來自于天然來源。因此，該化合物可來自于植物、動物、魚類、真菌、藻類、微生物發酵的提取物。礦物質被認為來自天然來源，也在該定義
內。
65.在一個優選的實施方案中，例如，酶可以是蛋白酶諸如胰蛋白酶，或酶提取物諸如菠蘿蛋白酶。
66.營養組合物
67.根據本發明的用途的組合物可以為營養組合物或藥物組合物，并且可以用于人類或獸醫用途。
68.因此，在優選的實施方案中，根據本發明的用途的組合物是營養組合物。
69.在本技術的上下文中，
″
營養組合物
″
意指作為個體營養來源的組合物。
70.本發明的營養產品或組合物可以是完全營養來源，或可以是不完全營養來源。
71.如本文所用，
″
完全營養
″
包括這樣的營養產品和組合物，所述營養產品和組合物包含種類全面、含量充足的大量營養素(蛋白質、脂肪和碳水化合物)和微量營養素，對于被施用該組合物的動物而言足以作為唯一營養源。患者能夠從這類完全營養組合物中得到他們100％的營養需求。
72.如本文所用，
″
不完全營養
″
包括這樣的營養產品或組合物，所述營養產品或組合物未包含含量充足的大量營養素(蛋白質、脂肪和碳水化合物)或微量營養素，對于被施用該組合物的動物而言不足以作為唯一營養源對于被施用該組合物的動物而言不足以作為唯一營養源。部分或不完全營養組合物可用作營養補充劑。
73.橄欖苦苷和槲皮素的組合可以以適用于人類和/或動物食用的任何組合物形式施用。在一個優選的實施方案中，將其以口服方式或經胃腸內(例如管飼)施用給個體。例如，可將其以飲料、食物產品、膠囊、片劑、粉末或混懸劑形式施用給個體。
74.合適的組合物的非限制性示例包括食物組合物、膳食補充劑、膳食補充劑(例如，液體ons)、完全營養組合物、飲料、藥品、口服營養補充劑、醫療食物、營養品、特殊醫學用途食品(fsmp)、在食用前用水或乳重構的粉末狀營養產品、食品添加劑、藥物、飲品、寵物食品、以及它們的組合。
75.營養組合物成分
76.蛋白質源
77.在一個實施方案中，根據本發明的用途的組合物包括蛋白質源。蛋白質源可以是膳食蛋白質，包括但不限于動物蛋白質(諸如，乳蛋白、肉蛋白或卵蛋白)、植物蛋白質(諸如，大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)或它們的組合。在一個實施方案中，該蛋白質選自乳清、雞肉、玉米、酪蛋白酸鹽、小麥、亞麻、大豆、角豆、豌豆、或它們的組合。
78.碳水化合物源
79.在一個實施方案中，組合物包含碳水化合物源。任何合適的碳水化合物都可用于本發明組合物中，包括但不限于淀粉、蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固形物、麥芽糖糊精、改性淀粉、直鏈淀粉、木薯淀粉、玉米淀粉、木糖醇、山梨糖醇或它們的組合。
80.脂肪源
81.在一個實施方案中，組合物包含脂肪源。脂肪源可包括任何合適的脂肪或脂肪混合物。例如，脂肪源可包括但不限于植物脂肪(諸如，橄欖油、玉米油、葵花油、高油酸葵花油、油菜籽油、低芥酸菜籽油、榛子油、大豆油、棕櫚油、椰子油、黑加侖籽油、琉璃苣油、卵磷脂等)、動物脂肪(諸如，乳脂肪)或它們的組合。脂肪源也可以是以上所列的脂肪的較少精
煉形式(例如，含有多酚的橄欖油)。
82.調味劑等
83.此外，根據本發明的用途的組合物還可包含天然或人工調味劑，例如水果調味劑如香蕉、橙、桃、菠蘿或樹莓或其它植物調味劑如香草、可可、咖啡等。
84.營養組合物形式
85.除主要的生物活性組分和任何另外的生物活性組分以及任選地蛋白質、碳水化合物和脂肪源中的一種或多種之外，該營養組合物還可包含任何數量的任選的附加食品成分，包括常規(合成的或天然的)食品添加劑，例如一種或多種酸化劑、附加的增稠劑、緩沖劑或用于ph調節的試劑、螯合劑、著色劑、乳化劑、賦形劑、調味劑、礦物質、滲透劑、藥學上可接受的載體、防腐劑、穩定劑、糖、甜味劑、質構劑和/或維生素。可以按任何合適的量添加任選的成分。
86.該營養組合物可以任何合適的形式提供。
87.可提供根據本發明的用途的組合物的營養組合物形式的示例包括溶液、即用型組合物(例如，即飲型組合物或速溶飲料)、液體食品、軟飲品、果汁、運動飲品、乳飲品、奶昔、酸奶飲料、湯等。
88.在其它實施方案中，該營養組合物可以濃縮物、粉末或顆粒(例如，泡騰顆粒)的形式提供，這些形式用水或其它液體(諸如，乳或果汁)稀釋以產生即用型的組合物。
89.其它的營養組合物形式包括烘焙產品、乳制品、甜品、糖果產品、谷物棒和早餐谷物。乳制品的示例包括乳和乳飲品、酸奶和其它發酵乳產品、冰淇淋和奶酪。烘焙產品的示例包括面包、餅干和蛋糕。
90.在一個實施方案中，根據本發明的用途的組合物還可以被設計成動物食品(具體地講用于狗或貓的動物食品)的多種形式，無論是濕形式、半濕形式還是干燥形式獲得，具體地講以餅干形式獲得。
91.施用途徑
92.本公開的營養組合物可以通過適用于人類施用的任何方式施用，并且具體地講在胃腸道的任何部分中施用。經腸施用、口服施用以及通過管或導管施用均被本發明涵蓋。該營養組合物還可通過選自口服、直腸、舌下、唇下、口腔內、局部等的方式施用。
93.該營養組合物可以任何已知的形式施用，包括例如方便劑型的片劑、膠囊劑、液體劑、咀嚼片、軟凝膠、藥囊、散劑、糖漿劑、液體懸浮劑、乳劑和溶液劑。在軟膠囊劑中，活性成分優選地溶解或懸浮在合適的液體中，諸如脂肪油、石蠟油或液體聚乙二醇。可任選地添加穩定劑。
94.如果該營養組合物通過管飼施用，則該營養組合物可用于短期或長期的管飼。
95.抑制或減少軟骨退行性變
96.軟骨退行性變可能是病狀(慢性或急性)、創傷或它們的組合的結果。
97.軟骨退行性變既在以炎癥為主的病狀(諸如類風濕性關節炎)中發生，也在炎癥不那么顯著的病狀(例如骨關節炎)中發生。
98.創傷還可導致軟骨退行性變過程被引發。例如，撕裂膝蓋中的韌帶導致膝關節的不穩定，并且將引發退行性變過程。
99.在本技術的上下文中，創傷是指由外部來源引起的生理損傷，諸如例如由跌倒或
被汽車等撞擊引起。創傷還可以是小損傷隨時間推移的累積，所謂的
″
磨損
″
。
100.盡管通常優選用外科手術治療創傷，但在一個實施方案中，本發明涉及一種治療方法，其中創傷通過外科手術并且還通過施用本發明的組合物來治療。
101.因此，根據本發明的用途的實施方案包括用于抑制或減少軟骨退行性變的用途，其中該軟骨退行性變是病狀或創傷的結果。
102.涉及軟骨退行性變并且本發明的組合物因此可能有用的病狀的示例包括：骨性關節炎、類風濕關節炎、痛風和偽痛風、膿毒性關節炎、強直性脊椎炎、青少年特發性關節炎、斯蒂爾病、牛皮癬(牛皮癬關節炎)、反應性關節炎、ehlers-danlos綜合征、血色素沉著病、肝炎、萊姆病、炎性腸病(包括克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)、過敏性紫癜(henoch-purpura)、高免疫球蛋白血癥d伴反復發熱、結節病、tnf受體相關周期性綜合征、韋格納肉芽腫病(和許多其它血管炎綜合征)、家族性地中海熱、系統性紅斑狼瘡。
103.在優選的實施方案中，本發明的組合物用于抑制或減少ra和/或oa中的軟骨退行性變。
104.在另一個優選的實施方案中，本發明的組合物用于抑制或減少oa中的軟骨退行性變。
105.另外，不希望受理論的束縛，已經觀察到雖然炎癥通常導致關節中的軟骨退行性變，但是軟骨退行性變也發生在炎癥成分較不明顯，并且可能甚至可忽略的情況中。
106.例如，關節創傷可能容易地引發軟骨退行性變，但不具有例如在ra中存在的顯著炎性成分。創傷可例如涉及撕裂韌帶，或對關節例如膝蓋、手指的沖擊創傷。
107.在另一個示例中，oa主要是關節退行性變疾病，具有較少的炎性成分。
108.因此，在一個實施方案中，本發明涉及根據本發明的用途用于抑制或減少軟骨退行性變的組合物，并且其中軟骨退行性變在具有很少或沒有炎性成分的病狀(諸如創傷或例如oa)環境中發生。
109.抵消早期退行性變事件的用途
110.肥大表明不是正常表型的軟骨細胞的分解代謝活動。
111.因此，在一個實施方案中，本發明涉及根據本發明的包含橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或衍生物的組合的組合物，其用于抑制或減少軟骨細胞肥大，該軟骨細胞肥大是指示軟骨退行性變的一個早期事件。
112.治療或預防隨年齡降低的運動性
113.根據本發明的用途的組合物已經示出抑制或降低蛋白水解活性。
114.衰老導致軟骨退行性變。
115.因此，本發明涉及本發明的組合物，其用于抑制或減少與衰老相關的軟骨退行性變。
116.在另一個實施方案中，本發明涉及本發明的組合物，其用于抑制或減少與衰老相關的軟骨退行性變中的膠原退行性變，例如用于抑制或預防與衰老相關的軟骨中的膠原ii退行性變。
117.軟骨退行性變可導致關節僵硬和關節疼痛，從而導致患者的運動性降低。
118.在其它實施方案中，根據本發明的用途的組合物可用于i)維持或改善衰老期間的關節功能，包括軟骨功能，ii)減少關節疼痛，包括炎性疼痛和/或傷害感受性疼痛。
119.在另一個實施方案中，本發明涉及根據本發明的用途的組合物，其用于改善受試者(例如成年或老年哺乳動物中)的運動性。
120.因此，在一個優選的實施方案中，根據本發明的組合物可用于改善個體的活動性和/或運動性，例如通過預防或治療骨關節炎，和/或通過抑制或減少軟骨退行性變。
121.其它優選的實施方案涉及根據本發明的用途的組合物，其中該用途是預防軟骨退行性變并因此維持健康關節，或維持或改善活動性、預防或減少關節疼痛(炎性和/或傷害感受性疼痛)。在另一個實施方案中，本發明的組合物可用于維持軟骨的狀態。
122.目標群體
123.根據本發明的用途的組合物的目標群體可以是顯示出軟骨退行性變的任何哺乳動物，例如因為它們患有一種或多種涉及本文提及的軟骨退行性變的病狀。軟骨退行性變可通過視覺方式檢測，諸如通過射線照相術。另選地，對軟骨退行性變產物的檢測可在體液中檢測到。例如，諸如一種或多種膠原ii表位(coll2-1、coll2-1 no2、ctx-ii)可在例如樣品(諸如血漿或尿液樣品)中檢測到。
124.另一個目標群體可以是尚未表現出軟骨退行性變、但處于軟骨退行性變風險中(例如處于oa、ra或本文提及的涉及軟骨退行性變的病狀中任一種的風險中)的任何哺乳動物。在一個優選的實施方案中，本發明涉及將根據本發明的組合物施用于該目標群體，該組合物包含橄欖苦苷或其代謝物與槲皮素或衍生物的組合，其用于抑制或減少軟骨的早期退行性變。
125.本發明的一個具體實施方案涉及用于改善個體的活動性和/或運動性的組合物，例如通過預防或治療骨關節炎，和/或通過抑制或減少老年或老齡化個體的軟骨退行性變。
126.在另外的實施方案中，根據本發明的用途的組合物可以用于哺乳動物，例如人類或寵物。寵物的示例包括貓、狗和馬。
127.雖然本發明可用于許多不同的年齡組，但在一個優選的實施方案中，根據本發明用于增加運動性的組合物針對老齡化群體，具體地講健康的老齡化和/或老年哺乳動物。
128.制備本發明的營養組合物的方法
129.在另一個方面，本發明涉及用于制備根據本發明的用途的營養組合物的方法，所述方法包括以下步驟：
[0130]-提供用于營養組合物的成分，該營養組合物包含橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合，以及混合，使得營養組合物包含橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或其衍生物的組合。
[0131]
供使用的藥物組合物。
[0132]
在另一個實施方案中，本發明涉及根據本發明用于抑制或預防軟骨退行性變的組合物，其中該組合物是藥物組合物。
[0133]
藥物組合物意指不是營養組合物的組合物，其中物質用于身體上或體內以在醫學上預防、診斷、緩解、治療或治愈人類或動物的疾病。根據本發明，該藥物可用于抑制或減少軟骨退行性變。
[0134]
該藥物可供人使用。另選地，其可以是獸醫用組合物，例如適用于狗、貓或馬，具體地講純種馬。
[0135]
在一個優選的實施方案中，本發明的藥物組合物包含橄欖苦苷或其代謝物與槲皮
素或衍生物的組合。
[0136]
在另一個優選的實施方案中，本發明的藥物組合物包含橄欖苦苷或其代謝物與槲皮素或其衍生物和姜黃素。
[0137]
本發明還涉及根據本發明的藥物的用途，如本文所述的本發明組合物的用途。
[0138]
根據本發明的用途的藥物組合物包含橄欖苦苷或其代謝物與槲皮素或其衍生物和/或姜黃素與至少一種賦形劑結合的組合，該賦形劑選自由藥學上可接受的賦形劑構成的組。用于制備根據本發明的藥物組合物的程序可以容易地由本領域技術人員例如在《雷明頓制藥科學手冊》，美國賓夕法尼亞州伊斯頓市，麥克米蘭出版公司(the handbook remington
′
s pharmaceutical sciences，mid.publishing co，easton，pa.，usa)中找到。生理學上可接受的賦形劑、載體和佐劑也描述于名稱為
″
藥用賦形劑手冊(handbook of pharmaceutical excipients)
″
(第二版，美國制藥協會，1994年)的手冊中。為了配制根據本發明的藥物組合物，本領域技術人員將有利地能夠參考歐洲藥典或美國藥典(usp)的最新版。具體地講，本領域技術人員能夠有利地參考歐洲藥典的第四版
″
2002
″
或還參考美國藥典的usp 25-nf 20版。
[0139]
有利地，如上定義的藥物組合物適用于口服、腸胃外或靜脈內施用。當根據本發明的用途的藥物組合物包含至少一種藥學上或生理學上可接受的賦形劑時，其具體地講是適用于通過口服途徑施用該組合物的賦形劑或適用于通過腸胃外途徑施用該組合物的賦形劑。
[0140]
根據本發明的用途的藥物組合物可以無區別地以固體或液體形式獲得。對于口服施用，將優選呈片劑、膠囊劑或明膠膠囊形式的固體藥物組合物。
[0141]
在液體形式中，將優選呈水性或非水性的懸浮劑形式，或者還優選呈油包水或水包油的乳劑形式的藥物組合物。
[0142]
固體藥物劑型可包含作為載體、佐劑或賦形劑的至少一種稀釋劑、一種調味劑、一種增溶劑、一種潤滑劑、一種懸浮劑、一種粘合劑、一種崩解劑和一種包封劑。此類化合物例如為碳酸鎂、硬脂酸鎂、滑石粉、乳糖、果膠、糊精、淀粉、明膠、纖維素材料、可可油等。液體形式的組合物還可以包含水，可能作為與丙二醇或聚乙二醇的混合物，并且還可能包含著色劑、調味劑、穩定劑和增稠劑。
[0143]
與已知治療的組合
[0144]
在缺乏改善骨關節炎疾病的藥物(disease-modifying oa drugs，dmoad)的情況下，可用營養物質替代藥物來治療和預防骨關節炎。
[0145]
從組織學數據可以看出，與主要影響退行性變的化合物相比，橄欖苦苷對oa評分具有更大的影響。因此，橄欖苦苷的功效可能是由于對炎性和退行性變的組合效應。因此，在優選的實施方案中，已經示出抑制或減少退行性變的本發明組合物可與用于抑制或減少炎癥的治療組合。
[0146]
治療方法
[0147]
本發明還涉及預防或治療軟骨退行性變的方法，例如發生軟骨退行性變的病狀或與軟骨退行性變相關的創傷，所述方法包括向有需要的個體施用有效量的根據本發明的組合物。例如，該方法包括施用有效量的包含橄欖苦苷或其代謝物與槲皮素或衍生物的組合的組合物。
[0148]
如本文所用，
″
有效量
″
是在個體中預防缺陷、治療疾病或醫學病癥的量，或更一般地說，是減少癥狀、管理其疾病進展或向個體提供營養、生理或醫學益處的量。
[0149]
實現治療效果所需的根據本發明的組合物的有效量當然將隨著特定組合物、施用途徑、接受者的年齡和狀況以及受治的特定障礙或疾病而變化。
[0150]
本發明還提供了下列方法：預防或治療涉及軟骨退行性變的病狀，諸如例如oa或ra；抑制或減少軟骨退行性變；抑制或減少軟骨中的膠原退行性變；抑制或減少軟骨中的膠原ii退行性變；該方法包括向個體施用有效量的根據本發明的用途的組合物。
[0151]
在一個實施方案中，根據本發明的治療方法涉及預防或治療骨關節炎。
[0152]
根據本發明的治療方法可以在哺乳動物(諸如人或寵物(例如狗、貓和/或馬))中進行。
[0153]
在某些實施方案中，待在治療方法中施用的本發明的組合物可以是一種或多種本發明的營養組合物和/或本發明的藥物組合物。
[0154]
套件
[0155]
本公開還提供了套件，該套件包括在一個或多個容器中的橄欖苦苷和/或其代謝物與槲皮素和/或衍生物的組合。在套件的一個實施方案中，一個或多個容器包括至少一個第一容器，該第一容器儲存與槲皮素和/或衍生物分開的橄欖苦苷和/或代謝物，該槲皮素和/或衍生物儲存在至少一個第二容器中，并且該套件還包括有關將橄欖苦苷與槲皮素混合成單位劑型的說明書。
[0156]
在套件的一個實施方案中，該組合可以與一種或多種預包裝的單位劑型一起提供，例如在各自包含干粉的單獨容器中提供，使得每個容器包含一種預包裝的單位劑型。
[0157]
在另一個實施方案中，產品盒可包含多種用于混合在一起以形成一種或多種本文所公開的組合物的組合物。例如，產品盒可在相對于彼此的單獨容器中包含兩種或更多種干燥粉末，單獨的粉末各自包含最終單位劑型的一部分。作為此類實施方案的非限制性示例，套件可包含容納橄欖苦苷的一個或多個第一容器，并且還可包含容納槲皮素的一個或多個第二容器。可將第一容器中的一個第一容器的內容物與第二容器中的一個第二容器的內容物混合以形成組合物的單位劑型的至少一部分。
[0158]
上述施用示例不需要無中斷的連續每日施用。相反，在施用中可以存在一些短暫的中斷，例如在施用期間中斷兩至四天。施用組合物的理想持續時間可以由本領域的技術人員確定。
[0159]
公開內容的組合
[0160]
應當注意，在本發明的其中一個方面的上下文中描述的實施方案和特征也適用于本發明的其它方面。
[0161]
根據本發明的用途的組合物在本文中以不同參數描述，諸如成分、營養組合物形式、用途、目標群體等。應當注意，除非另外明確說明，否則在根據本發明的用途的組合物的參數之一的上下文中描述的實施方案和特征也可以與在另一參數的上下文中描述的其它實施方案和特征組合。
[0162]
本技術所引用的所有專利和非專利參考文獻均據此全文以引用方式并入。
[0163]
現將在下面的非限制性實施例中進一步詳細描述本發明。
[0164]
實施例
[0165]
以下非限制性實施例提供了支持本文所公開的組合物和方法的實驗數據。
[0166]
實施例1
[0167]
為了測試橄欖苦苷(或橄欖苦苷苷元)、槲皮素及它們的組合在活細胞中的效果，本發明人測量了海拉細胞中線粒體鈣的升高。海拉細胞購自atcc。將海拉細胞以50000個細胞/孔的密度接種于96孔板的基本必需培養基(dmem，gibco)(高葡萄糖+10％胎牛血清)中。線粒體鈣測量使用感染有表達線粒體靶向鈣傳感器線粒體突變的水母發光蛋白的腺病毒(來自sirion biotech)的海拉細胞進行(monange等人，2004)。對于水母發光蛋白重構，在感染后24小時，將細胞在室溫(22
±
℃)下在具有1μm野生型腔腸素的標準培養基(145mm nacl、5mm kcl、1mm mgcl2、1mm mgcl2、10mm葡萄糖和10mm hepes，ph7.4)中溫育2小時。對于處理而言，在測量前2小時將化合物直接添加到細胞培養物或肌管培養物中。在flipr tetra aequorin(molecular devices)上測量發光。通過用100μm組氨刺激細胞獲得線粒體鈣上升。使用如前所述的算法將發光數據校準為鈣濃度(alvarez&montero，2002)。基于excel(microsoft)和ghaphpad prism 7.02(graphpad)軟件的定制模塊分析用于定量。
[0168]
為了驗證促炎細胞因子白介素-1β作為軟骨細胞細胞模型中的骨關節炎模擬物的作用并測試線粒體鈣單向轉運體(mcu)消融對軟骨細胞功能的作用，本發明人測量了sw1353細胞中的軟骨細胞功能和線粒體功能。sw1353細胞購自atcc。將sw1353細胞在100mm皿中以每孔10000個細胞的密度(用于線粒體鈣測量)或以1000000個細胞的密度(用于蛋白質印跡)接種在96孔板中。細胞在具有10％胎牛血清和1％青霉素-鏈霉素的高葡萄糖基本必需培養基(dmem，gibco)中培養。
[0169]
為了評價軟骨細胞的功能，通過蛋白質印跡法分析膠原-iia1、聚集蛋白聚糖、金屬蛋白酶-3和-13(mmp3和mmp13)的表達。sw1353細胞用或不用10ng/ml白介素-1b處理24小時或48小時。在含有150mm nacl、1.0％igepal ca-630、0.5％脫氧膽酸鈉、0.1％sds、50mm tris(ph 8.0)、完全無edta蛋白酶抑制劑混合物(roche)、1mm pmsf、1mm navo3、5mm naf和3mmβ-甘油磷酸酯和磷酸酶抑制劑(roche)的適當緩沖液中制備蛋白質提取物。根據bca定量加載40μg的總蛋白質。在商業4％-12％丙烯酰胺凝膠(thermo fisher scientific)中通過sds-page電泳分離蛋白質，并且通過濕電泳轉移將蛋白質轉移到pvdf膜(thermo fisher scientific)上。將印跡在室溫下用5％牛血清白蛋白(sigma-aldrich)的tbs-tween(0.5m tris，1.5m nacl，0.01％tween)溶液封閉1小時，并在4℃下與一抗一起溫育過夜。將二抗在室溫下溫育1小時。使用以下抗體：抗膠原iiα1(1∶1000，abcam)、抗聚集蛋白聚糖(1∶1000，abcam)、抗mmp-3(1∶1000，abcam)、抗mmp-13(1∶1000，abcam)。hrp綴合的二抗購自cell signalling并且以1：5000稀釋度使用。然后用光密度法定量膠原-iiα1、聚集蛋白聚糖、mmp3和mmp13的含量，并對gapdh的含量進行歸一化(用抗-gapdh檢測，1∶5000，cell signaling)。
[0170]
為了消融線粒體鈣單向轉運體(mcu)的蛋白質表達，用由sirion biotech生產的用于mcu敲低的工程化載體轉染sw1353細胞。感染后三天，如前所述，通過蛋白質印跡和密度分析定量mcu的表達。mcu的含量對于線粒體蛋白tom20的含量進行歸一化。使用以下抗體：抗-mcu(1∶1000，sigma-aldrich)、抗-tom20(1∶5000，cell signaling)。
[0171]
為定量白介素-1β對于sw1353細胞的細胞死亡的作用，使用incucyte zoom儀器進行細胞凋亡的動力學實驗(essen bioscience，ann arbor，mi，usa)。將細胞以50％匯合度
以96孔板形式在dmem培養基中接種。24小時后，根據供應商的說明書，將細胞與incucyte膜聯蛋白-v green(4642)一起溫育，并用il-1β處理。使用10x物鏡和帶寬過濾器(ex：440/80nm；em：504/44nm)在指定時間處收集每孔四個圖像。將數據輸出為每孔被膜聯蛋白-v陽性對象覆蓋的面積(mm2)，并針對細胞覆蓋的總面積進行歸一化。
[0172]
為測量線粒體膜電位，將sw1353細胞以每孔8000個細胞的密度接種在96孔板中的具有10％胎牛血清的生長培養基(dmem高糖，gibco)中。24小時后，細胞用10ng/ml的il-1β進行處理并持續圖7中所示的天數。然后，用熒光線粒體膜電位傳感器jc-10裝載細胞。根據供應商的說明書，用metaxpress confocal(molecular devices)在以下發射波長下采集熒光：590nm(在540nm下激發)和525nm(在490nm下激發)。590nm/525nm處的熒光比與線粒體膜電位的變化成比例。
[0173]
利用與用于海拉細胞相同的程序，測量sw1353細胞中的線粒體鈣。槲皮素和橄欖苦苷在骨關節炎軟骨細胞模型中的協同效應如對海拉細胞所述的進行定量。
[0174]
結果：
[0175]
如圖1所示，在刺激期間，橄欖苦苷與槲皮素協同作用以通過增加海拉細胞中線粒體鈣升高來激活線粒體。如圖2所示，在刺激期間，橄欖苦苷苷元與槲皮素也協同作用以通過增加海拉細胞中線粒體鈣升高來激活線粒體。相反，如圖3所示，橄欖苦苷不與橄欖苦苷苷元協同作用以經由海拉細胞中線粒體鈣升高來激活線粒體。如圖4所示，橄欖苦苷和橄欖苦苷苷元與槲皮素組合促進了相同水平的協同作用。
[0176]
如圖5所示，考慮到與對照(非骨關節炎軟骨細胞，圖5a)相比，膠原-iiα1含量顯著降低，并且金屬蛋白酶mmp3(圖5b)和mmp13(圖5c)的表達增加，骨關節炎軟骨細胞的細胞模型揭示了軟骨細胞功能障礙。一致地，這些功能障礙的骨關節炎軟骨細胞的特征在于增加的細胞死亡(圖6)。如圖7所示，考慮到線粒體膜電位降低，在該骨關節炎軟骨細胞的細胞模型中，線粒體功能受損。可靠地，在該骨關節炎軟骨細胞的細胞模型中，在刺激期間線粒體鈣升高顯著降低(圖8)。如圖9所示，線粒體鈣攝取功能障礙的軟骨細胞的遺傳模型(mcu-敲低，kd，圖9a)揭示了軟骨細胞功能受損，從而模擬了骨關節炎的效果。因此mcu-kd細胞中的膠原-iiα1表達(圖9b)和聚集蛋白聚糖表達(圖9c)降低，而金屬蛋白酶mmp3的表達增加。最后，如圖10所示，在所述骨關節炎軟骨細胞(用il-1b處理的sw1353細胞)的細胞模型中，橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體。如圖11所示，在所述骨關節炎軟骨細胞的細胞模型中，橄欖苦苷苷元(oea)與槲皮素(q)的幾種組合協同作用以經由線粒體ca2+升高來激活線粒體。