與豬的神秘疾病有關的病毒劑的制作方法

專利名稱：與豬的神秘疾病有關的病毒劑的制作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及免疫學和病毒學領域，更具體地涉及得自致病性病毒分離株的疫苗。更具體地，按照產生抗摧毀性新豬病疫苗的方法將致病型病毒改良或減毒成無毒型。
2.現有技術的描述一種新的豬病，稱作“神秘豬病”、“豬不育和呼吸綜合征”、“藍耳病”或“豬生殖和呼吸綜合征”(PRRS)，正在引起美國和加拿大繁殖畜牧群嚴重損失。類似的疾病也出現在歐洲。該疾病被證明有兩種形式，一種引起生殖能力喪失，另一種引起幼豬呼吸窘迫。生殖型疾病的描述見Keffaber，K.K.，＂ReproductiveFailure of Unknown Etiology＂，American Association of Swine PractitionersNewsletter，1109，(1989)。
該病的生殖型最突出的臨床癥狀是晚期自發性流產、早產(可高達20-30％)和一胎木乃伊化胎豬，死產或多病小豬。這樣的臨床癥狀典型地可見于飼養4-16周，甚至更長時間。如皮膚深棕色著色和死后自身分解所證實的，受侵襲的一胎死產胎豬常處于木乃伊化早期。有時也見胎顱骨穹隆形畸形。母豬的感染可被忽視或表現為持續數日的全身狀況削弱。例如，母豬可不攝食、體溫高于或低于正常。在下小豬期，母豬可顯示抑郁、嗜睡、phyrexia，偶有嘔吐。在一些感染畜群中，可失去高達75％的小豬。因此，此病的經濟后果是摧毀性的。
該病的呼吸型在3-8周齡的小豬出現最明顯的臨床癥狀，但據報道可出現于感染的畜群中各齡小豬。患病小豬生長緩慢，皮毛粗糙、呼吸窘迫(“粗重(thumping)”)和死亡率增加(高達約80％斷奶前死亡率)。感染該病呼吸型的小豬的肉眼和顯微鏡損害的初步研究發現提示，顯微鏡下肺損害是該病的重要臨床特征。盡管該病有顯著的呼吸癥狀，但看來并未合并繼發性細菌感染的肺肉眼觀察正常，或僅有肺表面輕度彌漫性深灰色著色。然而，患PRRS病小豬的肺組織的顯微鏡檢查揭示特征型的間質性肺炎，per Collins，J.E.Et al.，＂RespiratoryDisease in a Swine Herd Experiencing a Reproductive Failure Syndrome＂，Proceedings，Minnesota Swine Conference for Veterinarians，P.254，St.Paul.MN(September 10-18，1990)。
因此，本領域確實需要尋求消除或至少改善PRRS影響的有效疫苗。
發明概述本發明提供疫苗，有效地減少或預防PRRS病毒在豬中引起的疾病，而克服上述問題。
廣義地說，本發明包括PRRS病毒的生物純或病毒純培養物及其所有突變體和制備及使用這些病毒體的方法。野生型病毒能在豬中引起PRRS，但其經改良的病毒株或非致病性突變體產生抗這些疾病的有效的疫苗。疫苗較佳地包含活的改良或減毒病毒和藥學上有效的載體物質。經改良的病毒株以在猿猴腎細胞系繁殖和保存為宜，該細胞系最佳為經20或20次以上傳代的非洲綠猴(African GreenMonkey)腎細胞MA-104。
從受感染豬的組織勻漿回收致病性病毒劑，在大量小豬和懷孕母豬上引起PRRS疾病而加以證實。這種分離的病毒劑于1991年7月18日保藏于馬里蘭州Rockville的美國典型培養物保藏中心，保藏號為ACTT-VR2332。此病毒劑為需要復雜營養的非血凝性包膜RNA病毒。
野生型病毒最好是改良成基本無毒型的將病毒接種于在合適的培養基中、有血清存在的猿猴細胞的完全或部分層上，在約35-37℃溫度下將接種的細胞層進行培養，直至觀察到細胞致病效應，在存在血清的維持培養基和合適的傳代條件下，將病毒經猿猴細胞系反復傳代。
疫苗包括載體劑，如蔗糖明膠穩定劑，它與如上所述制成的經改良的活病毒混合。該疫苗較佳為經局部(粘膜下)途徑或胃腸外途徑接種免疫豬來預防PRRS。被免疫的豬受野生型病毒攻擊后典型地無疾病癥狀出現。
通過包括以下步驟的方法可以商業規模生產疫苗制備猿猴細胞系的擴展培養物，用減毒的病毒感染此擴展培養物制備生產培養物，收取生產培養物，將病毒穩定化和冷凍干燥。
附圖的簡要說明

圖1是用于制備商業規模PRRS疫苗的方法流程圖。
最佳實施例的詳細說明下面的非限制性實施例闡述了用于實施本發明的最佳方法和物質。
實施例1PRRS病毒的分離、鑒定和減毒及經改良的活疫苗的制備A.分離和鑒定從感染PRRS畜群的小豬得到組織勻漿。此勻漿給無菌小豬和孕母豬鼻內接種始終可引起呼吸型和生殖型PRRS。用經過濾或未經過濾的接種物(0.45、0.22或0.1μm)這樣接種的無菌小豬變得厭食和發生類似于PRRS感染的畜群所見損害的顯微鏡下肺損害。相同的接種亦可引起在PRRS感染畜群中可見到的生殖能力喪失。
從中分離病毒的組織勻漿包括從PRRS感染畜群中的感染小豬得到的肺組織(第1組)和合并的腦-脾-肝-腎組織(第2組)。分離的勻漿組各于4000×g離心25分鐘。收集所得的上清液，用0.45μm滅菌注射器濾器過濾。濾得的上清液再合并。用1ml合并的濾得的上清液作接種物，如下所述感染每個細胞系。
將濾過的上清液加到包含如下所述細胞系的生長培養基，得自JRHBiociences的改良Eagle培養基(“MEM”)，和約100μg/ml慶大霉素中。
每個細胞系用75ml塑料瓶進行兩份試驗。在第1號試驗中，將濾過的上清液接種到兩個瓶中，每個瓶有下面所列的每個細胞系的完全層。再向這第1瓶中加入約2.5mg胰蛋白酶。所有其它的條件與每個培養瓶相同。
在第2號試驗中，將合并的組織勻漿物質接種到含有與第1號試驗所用相同的細胞系，但在接種時細胞層只有20-40％融合。培養基還含約10％胎牛血清，這在試驗1的培養基中是不存在的。再以1ml量進行接種，將培養物于約34℃培育約7天。
將所有的瓶子于約34℃培育約7天。在約7天末記錄結果。在凍融后，取一個樣品在同樣的細胞系中進行第二次傳代。剩下的材料凍在液氮中儲存于-60℃。試驗1和試驗2的結果均列于下面的表1中。
表1作為病毒宿主的試驗細胞系所用的細胞系 試驗1試驗2牛鼻甲(BT)--貓腎(CRFK)--猴(Vero)腎--猴(Vero)肺 --犬腎(MDCK)--豬(PK2A)腎 --水貂肺 --雪貂肺--牛肺 --水牛肺--牛腎(MDBK)--豬睪丸(ST)--猴腎(MA-104) -+人直腸瘤(HRT-18) -NT人肺 NT -+＝CPE效應-＝無CPE效應NT＝未試驗試驗1中任何受評價的細胞系均未見細胞致病效應(“CPE”)。但在試驗2中，MA-104細胞小團變得腫脹，并在沿瓶邊的單層中形成“弱孔”。從瓶中分離出液體，放入新的MA-104細胞的瓶中(仍是20-40％細胞層)，然后接著第3次傳代。每次傳代，明顯的CPE變得更強。第3代保留其毒力。將這一代保藏于馬里蘭州Rockville的美國典型培養物保藏中心，保藏號為ATCC-VR2332。
ATCC-VR2332病毒在無菌小豬上始終可引起臨床PRRS癥狀、肺損害和陽性ImF結果。因此，ATCC-VR2332病毒可代表囊膜病毒(Togaviridae)的未鑒定的屬。ATCC-VR2332病毒也不是豬的已知病原體，因為對一些豬的常見病毒病原體的特異抗血清既不能中和病毒也不能檢出感染細胞中的抗原。
ATCC-VR2332病毒是需要復雜營養的非血凝包膜RNA病毒。ATCC-VR2332病毒生長在連續細胞系中，特別是MA-104和其它猿猴細胞系。ATCC-VR2332病毒在商品化細胞系MA-104上生長成高滴度(107TCID50/1ml)。
ATCC-VR2332病毒含有脂質包膜，如表現為用氯仿處理后失去傳染性。脂質包膜也可作為空心顆粒周圍的半透明電子環而被看到。在直接電鏡(DEM)上PRRS的形態學并無獨特性，在含細胞碎片的制劑中極難鑒定。梯度純化的ATCC-VR2332顆粒的形態學和平均直徑62nm非常類似于馬動脈炎病毒粒子和乳酸脫氫酶病毒。
據報告，馬動脈炎(Arteritis)病毒顆粒大小范圍為50-73nm，與ATCC-VR2332病毒的48-84nm顆粒大小相似。在幾種ATCC-VR2332顆粒觀察到30-35nm的核心，這種核心與關于馬動脈炎病毒所描述的核殼體核心相似。因此，在形態學上，ATCC-VR2332最近似于動脈炎病毒組。
根據此病毒在5-溴-2-脫氧尿苷和絲裂霉素C(已知它們抑制DNA和一族RNA病毒(逆轉汞病毒Retroviridae)但不抑制其它RNA病毒的復制)存在下持續復制的能力證實ATCC-VR2332病毒中存在RNA基因組。然而，ATCC-VR2332病毒的暫定分類為RNA病毒，與用ImF檢出病毒抗原的存在所表明的此病毒在胞漿中復制的觀察相一致。而且，干擾DNA依賴性RNA轉換的放線菌素D對ATCC-VR2332病毒的復制無效。這些結果表明，ATCC-VR2332病毒復制不需要核功能。
簡言之，從顆粒大小、形態學、RNA基因組的存在和其它生物學特性推定ATCC-VR2332病毒在囊膜病毒(Togaviridae)族中。但是，不能確定ATCC-VR2332病毒在這組的某個已知的屬。雖然在形態學上ATCC-VR2332病毒與動脈炎病毒非常接近，但不應將此病毒歸于特定的屬，直至得到關于RNA和蛋白質結構的進一步信息。
B.減毒從VR2332第三次傳代所得物再按如下所述進行兩次傳代。第五次傳代所得物送達外邊的實驗室純化。具體地說，在以CsCl梯度(200,000×g離心)純化然后用1，1，2-三氯-三氟乙烷萃取后鑒定ATCC-VR2332病毒體。用采用抗ATCC-VR2332超免疫血清和金結合物的免疫-金試劑盒標記純化的病毒。在CsCl梯度中的ATCC-VR2332病毒體的浮力密度為1.18-1.19g/ml。蔗糖梯度始終導致病毒滴度的丟失，而被放棄作為純化的合適的梯度。
然后使純化的第5次傳代的所得物如下所述再進行65次傳代。第70次傳代所得物是減毒的，被定為主種子培養物(Master Seed Culture)。這種無毒力的主種子培養物保藏在美國典型培養物保藏中心，保藏號為ATCC VR-2495。最后，再進行5次傳代，得到ATCC VR-2332第75代(如果需要，還可再進行傳代)。
ATCC VR-2332病毒的第4-75次傳代在宿主組織培養物儲存，在市售MA-104綠猴腎細胞系中進行。組織培養儲存物制備如下制備生長培養基，包括購自JRHBiosciences的Eagles極限必需培養基(“MEM”)(編號#200-2041)和購自JRHBiosciences的10％胎牛血清的混合物。將約1ml ATCC-VR2332接種到含50ml這種生長培養基的75cm3瓶中。將此瓶在約35℃至約37℃的溫度下保持約7天，進行培養。組織培養儲存物瓶通過以如下方式作1∶4分割所得的經培養的培養物擴展而制成。將體積為約50ml的生長培養基傾析。加入10ml胰蛋白酶-依地酸1X除去細胞層，于37℃培養5-10分鐘。接著，將細胞從瓶中除去。于270×g離心5-10分鐘。傾析上清液，顆粒再懸浮于前述含10％胎牛血清的MEM培養基5-10ml。將細胞置于200ml生長培養基中，然后將其再分配于4個75ml瓶中，每瓶50ml，這樣就得到1∶4分割。
將所得培養物保持于35-37℃的溫度下直至使用。培養約3-4天后，瓶子發展成完全細胞層被覆，即可使用。
將PRRS病毒ATCC-2332在如上所述制得的MA-104連續細胞系培養基中增殖。將培養基的pH調至7.2，將培養物在約35-37℃溫度下進行培養。加入前述傳代物的冷凍培養物約1ml到液體生長培養基中，將病毒接種到MA-104細胞上。使病毒吸附到細胞上24小時。
在接種ATCC-2332病毒約24小時后傾析生長培養基，將燒瓶再充入50ml維持培養基，其中以4％胎牛血清取代生長培養基的10％含量胎牛血清。維持培養基的pH為7.6。此培養基更換后，將培養物于35-37℃溫度進行培養。使病毒生長直至培養物中約50-60％的MA-104細胞層被病毒破壞。然后將樣品冷凍于液氮中，準備傳代到另一個燒瓶的MA-104細胞上。
第3-70次傳代的交叉反應性也得到證明。用PRRS VR-2332第3次傳代病毒免疫豬、家兔和山羊以產生對PRRS的抗血清。用此血清中和從第3至第70代各自傳代水平的PRRS病毒。另外，用從以VR-2332 PRRS病毒免疫的小鼠所得的脾淋巴細胞制備兩個單克隆抗體(SDOW-12和SDOW-17)。這兩個單克隆抗體均顯示對如1992.12.的全部美國和歐洲的PRRS分離株起反應。這些單克隆抗體用于鑒定或檢出第3-70代PRRS病毒。
C.改良的活疫苗的制備通過分別攙入主種子培養物(從ATCC VR-2332第70代收獲)和從ATCCVR-2332第75代收獲物配制兩種疫苗制劑。主種子培養物病毒和第75代病毒基本上是無毒力的，即將疫苗施用于豬或易接觸PRRS的其它哺乳動物時不引起PRRS疾病的臨床癥狀，但能產生免疫反應，免疫動物抗致病型PRRS病毒。疫苗用常規方法進行制備。在冷凍干燥前加入常規穩定劑和載體。
實施例2病毒分離株的體內試驗用從實施例1得到的ATCC-VR2332病毒的第三代有毒力收獲物接種兩個3日齡無菌小豬。兩個小豬均鼻內接種，一個1ml，另一個2ml。將小豬臨床觀察7天，然后無痛苦處死并作尸檢。從每個小豬收集組織樣品用于組織病理和病毒劑回收。病理組織學報告確定，感染小豬的肺損害和已知有PRRS的小豬的肺損害相同。如實施例1所述，處理組織樣品，然后在20-40％和100％單層MA-104細胞系上用胎牛血清進行培養。再回收病毒劑。
為了證明該病的生殖效應可被復制和確認，還用第3代病毒收獲物接種母豬。將兩只妊娠約93天的經產母豬進行鼻內接種。這兩只母豬分別在妊娠112天和114天分娩，有50％死胎小豬(8/13和6/14死胎/存活)。死胎小豬中7只部分木乃伊化，活產小豬虛弱、不能養壯。按實施例1的方法從死胎小豬的組織回收病毒劑。
從3群已知有PRRS的小豬回收病毒劑。在這些同樣的畜群中鑒定對ATCC-VR2332的抗體滴度。
實施例3本研究的目的是確定選用作改良的活病毒疫苗的PRRS病毒(VR-2332第75代)的最低保護劑量。研究的進行是分析兩個選定的疫苗劑量(4.0±0.5對數/劑量和2.0±0.5對數/劑量)能控制以有毒PRRS病毒(VR-2332第3代，3.5±0.5對數/劑量)攻擊后異常狀況發生的程度及對疫苗攻擊、非疫苗攻擊豬和未攻擊(正常)豬進行比較。如前所述，用第75代病毒產生改良的活疫苗。
從農場選用62只血清陰性小豬，分成4個研究組，稱為第1、2、3和4組。第1組的21只小豬以2.0ml PRRS疫苗L-4肌肉注射(4.0對數/劑量)進行接種。第2組的21只小豬以20ml PRRS疫苗L-2(2.0對數/劑量)進行接種。第3組10只小豬和第4組10只小豬不進行接種。對照3組和4組小豬圈養在分開的設施中以確保對攻擊病毒的敏感性。在試驗第28天，第1、2和3組鼻內給予2.0ml PRRS病毒VR-2332第3代進行攻擊。第4組小豬不進行攻擊。在攻擊前31天和攻擊后21天中定期觀察和監測所有4個研究組的豬。用于評價這些研究的參數是臨床癥狀、體重、體(直腸)溫、白細胞計數、病毒分離和血清學檢查。疫苗的功效用減少接種豬病毒血癥的天數和防止白細胞減少和發熱及保持攻擊后的正常生長率加以證明。接種前后測量體(直腸)溫。第1組的組平均體溫在接種后第2天(2DPV)和第3天升高，而第2組在第3天升高。這兩組的升溫時間短，第1組2天，第2組1天。
接種組無一出現接種后白細胞降低。以前的研究表明，暴露于有毒PRRS病毒會在暴露后72小時內引起白細胞減少。
接種后測量體重增加的結果表明，該處理對接種豬的性能并無不良影響。接種后29天中，任一接種組的體重增加與第3組和第4組的體重增加差異均無顯著意義(可信限0.05)。
臨床觀察大多數項目(除了糞便和鼻之外)幾無差異。用雙尾t測驗比較接種組糞便評分和合并對照組(第3組和第4組)的評分，在0.05可信限水平未見顯著差異。第1組和合并對照組之間的p值為0.47，而第2組和合并對照組之間的p值為0.87。第1組和合并對照組之間鼻評分比較的p值為0.41。第2組21只豬中只有2只觀察到有臨床鼻評分。第1組和第2組全部個體臨床評分與合并對照組評分的t測驗分析p值分別為0.53和0.74。這些比較證明，接受任何劑量水平的接種動物和未接種的對照組之間沒有差異。
從血中分離病毒的結果表明，第1組100％(21/21)變陽性，而第2組90％(19/21)試驗陽性。接種后整個過程中，對照組3和4保持陰性。免疫過氧化酶試驗(IPT)結果提供了類似情況，其中第1組變成血清學陽性，第2組90％陽性。這兩組在接種后21天中血清中和抗體均保持陰性。兩組均在接種后第29天測定中和抗體(攻擊后0天-見攻擊后結果)。對照組直至攻擊時兩種試驗方法均保持血清學陰性。
接種后觀察分析表明，用試驗中的任一疫苗劑量處理均未見不良反應。然而，高劑量確實在血清學上轉化全部豬(21/21)，而低劑量轉變19/21即90％。
用有毒PRRS病毒攻擊后，在接種組和未接種組監測的臨床參數提供了兩種疫苗試驗劑量有保護作用的證據。測試病毒血癥的結果提供清楚的證據表明該疫苗的益處。攻擊后第3、5和7天，未接種組(第3組)100％病毒血癥，而在第1組(3.65對數/劑量)和第2組(1.85對數/劑量)同樣觀察天數的病毒血癥發生率分別為15、5和10％及30％、20％和15％。而且，第1組攻擊后第9天和第2組攻擊后第13天，從血樣中未回收到病毒，而第3組的30％在攻擊后第19天仍為陽性。
監測(直腸)體溫的結果也提供了疫苗功效的證據。在21天觀察時期中，第3組的平均體溫在第5天時超過104°F。第2組和第3組的平均體溫不超過104°F。此外，第3組在攻擊后第2天和攻擊后第6天兩天的平均體溫超過104.5°F。
攻擊后，白細胞計數的結果表明，第3組出現白細胞減少，攻擊后第5天降低16％。接種組在整個觀察期未見大于6％的降低。
攻擊后21天中監測各處理組的增重顯示兩種劑量水平的接種均保持正常的生長率。兩個接種組，第1組和第2組平均增重百分率分別為74和73。第4組，正常對照組動物組平均體重增加75％。相反，第3組，未接種-攻擊對照組的組平均體重增加為69％。用雙尾t測驗，在0.05可信限水平得出這與第1、2和4組有顯著差異(p＝0.009)。
盡管臨床試驗的結果在證明功效上可能不作界定的，但它們仍證實了疫苗的益處。在攻擊后，第1、2和3組顯示呼吸癥狀發生率的明顯增加。第1、2、3組各動物每天平均評分分別為0.39/0.64h和0.53。這證明，較高劑量(3.65/劑量)的益處高于較低劑量(1.85對數/劑量)和未接種組。盡管攻擊后糞便觀察是明顯的，但與接種后和攻擊前的觀察差異不顯著(用0.05可信限)。因此，本試驗中，有毒PRRS病毒的攻擊看來對下部胃腸道無影響。總之，其余的臨床觀察未顯示作為攻擊結果的明顯變化。第1組鼻和嘴的參數，一只豬有全組鼻評分的25％，另一只豬有嘴項目組內評分的94％。同樣地，第2組中，一只豬有全組鼻評分的22％，另一只豬有嘴項目組內評分的43％。總的說來，關于這兩個參數的攻擊后臨床觀察的發生率與接種后觀察無顯著差異。關于第3組的這兩個臨床參數可得出類似的結果。第4組保持全身相對正常。
在觀察時間末，將所有豬無痛苦處死，對于牽涉病理學的體征進行肺大體觀察。第3組60％(6/10)顯示可見的變化。相反，第1組10％和第2組19％看來有可見的變化。與第4組(正常對照組)比較時，第1組80％、第2組81％和第3組30％被描述為無可觀察到的差異。
從肺組織進行病毒分離。從第1組豬的肺組織未分離到病毒。第2組21只豬中一個樣品病毒陽性。從第3組10個樣品中的3個分離出病毒，而從第4組未分離出病毒。
從這些結果得到的結論是含VR-2332第75代的改良活PRRS病毒疫苗的兩個劑量水平(3.65對數/2.0ml劑量和1.85對數/2.0ml劑量)對于對抗在接種后29天以有毒PRRS病毒攻擊的3-5周齡豬的呼吸疾病上是有效的。本研究表明，較佳的最低限度保護劑量為3.65對數/2.0ml劑量。用幾種參數，如病毒血癥、臨床呼吸體征、肺病理學改變和從肺組織的病毒分離，評價疫苗劑量效應幾種高劑量的動物受到較好的保護。接種3.65對數/劑量的21只豬全部在接種后21天血清轉化。與之相比，接種低劑量的21只豬中只有19只在接種后29天(攻擊后0天)有血清轉化。
實施例4本實施例中，研究了用實施例1和3所述PRRS第75代改良的活疫苗的免疫時效。育肥豬通常在6月齡時達到屠宰體重。本實施例中，在約1月齡(4-5周齡)時將豬接種，然后在接種后110天進行攻擊。該免疫時期覆蓋正常育肥豬預期平均生命期的大部分。
購得62只PRRS血清陰性小豬，分成4個研究組，稱為第1、2、3和4組。第1組21只豬接種每劑含3.32對數的2.0ml PRRS-MLV第75代疫苗。第2組21只豬接種每劑含1.64對數的2.0ml這種疫苗。第3組和第4組10只豬不接種，圈養在分開的設施內以保持血清陰性狀態。在實施例3所述研究末，將用于本實施例的第2組豬從研究中取出，無痛苦處死，因為已有結論是最低限度保護劑量為每劑3.68對數而非1.87對數。第1組和第3組在接種后(DPV)110天用VR-2332第3代病毒(3.9對數/ml)進行鼻內攻擊。第4組豬不進行攻擊。攻擊后(DPC)21天監測豬的臨床癥狀、體重變化、(直腸)體溫、白細胞計數、病毒血癥和血清學。接種后110天的保護免疫通過與未接種的受攻擊豬相比，不發生病毒血癥、防止白細胞減少和發熱及改善體重增長而加以證實。
接種后，檢測受接種豬對疫苗的任何不良反應。檢測的參數包括(直腸)體溫、白細胞計數、體重增長、臨床癥狀、血清學和病毒血癥。
從-1DPV至+4DPV每天檢測(直腸)體溫。在作為疫苗結果的處理組的體溫上，組平均值分析未顯示明顯的增高。第1組接種組豬與接種前平均值比較，最多升高0.2°F。
在接種疫苗前后的各時間點檢測白細胞數。第1組與接種前相比，平均在4DPV降低14％。第1組計數上的其它所有降低小于9％。其余組(3和4)在接種后觀察期間WBC計數上沒有任何大于11％的降低。從0DPV至28DPV體重增加的結果在第1組體重變化顯著區別于第4組這一點上是相抵觸的(p＝0.02)。對此差異尚無解釋，因為檢測到的其它參數并未顯示第1組和第4組之間大的差異。
接種后臨床評分的統計學分析表明，在接種組和未接種對照組之間并無差異。雖然糞的評分有最高發生率，在第1組和第3組和第4組之間沒有顯著差異，分別為p＝0.75，p＝0.59。同樣，臨床鼻評分亦無顯著差異。第1組和第3組之間比較，p值大于0.8。第1組和第4組之間比較，p值為0.02，第4組有較高的發生率。其它臨床參數無一顯示明顯的發生率。
接種后血清學結果表明，疫苗劑量成功地免疫了受處理的動物。14DPV時，用IPT試驗得到第1組48％試驗陽性。在21DPV的7天后，100％處理組IPT試驗陽性。直至28DPV，第1組血清中和(SN)抗體保持陰性。第1組所有豬直至110DPV進行攻擊時兩種試驗均保持血清學陽性。第3組和第4組豬在接種后整個時期均保持血清學陰性。
接種后病毒分離結果表明，處理組100％被成功地接種。這支持前述血清學數據。第3和第4兩個對照組在接種后整個觀察期均保持陰性。
接種后觀察表明，處理對于受處理的動物并無任何不合需要的嚴重影響，對照組動物保持無PRRS病毒。
在用有毒PRRS病毒攻擊后，檢測各種臨床參數以評價免疫處理的益處。將接種組(第1組)與未接種-攻擊組(第3組)和未接種-未攻擊組(第4組)進行比較。
攻擊后血清學結果證明，攻擊水平在第3組成功地刺激了免疫反應。第1組在用有毒病毒攻擊后無回憶抗體應答。血清學結果表明，第4組在整個21天觀察期保持陰性。
最驚人的發現是病毒分離結果。在3、5和7DPC，第3組100％試驗陽性，遲至21DPC，該組20％試驗陽性。第1組在0DPC時為陰性，在整個21天觀察期保持如此。一個預料不到的結果是第4組血樣中PRRS病毒的陽性分離。從第4組的第一次病毒陽性分離出現于15DPC。這一觀察與后面將討論的其它參數相關。即使第4組接觸到PRRS病毒，收集到的數據應仍然被認為是有效的，因為在后1/3觀察期發生明顯的暴露及主要事件間隔從1DPC至11DPC。在這時間內進行了第1組和第3組之間的大部分比較。最重要的結果是感染的明顯制止，見于疫苗處理組未分離出病毒。
攻擊后臨床評分的重要性在評價疫苗處理的效應上看來是有限的。雖然在第1組和第3組觀察到臨床呼吸體征，但這些體征不是平均分布的。在第1組，2只豬占該組總分的88％，類似的，在第3組，2只豬占該組總分49的71％。第1組糞便總分與其它組比較是有統計學意義的。然而，21只豬中只有9只觀察到這一項目有任何臨床體征，9只豬中，3只豬占該組總分的55％以上。無糞便評分分布到第3組，第4組只有1只豬觀察到具有糞便的臨床體征。鼻和嘴的臨床評分不與其它參數如呼吸相聯系則可能其重要性有限。鼻觀察的發生率在第1組和第3組都是有限的，每組低于50％有評分。嘴觀察的評分發生率高，第3組為90％，第1組為76％。這兩組嘴臨床評分之間無統計學意義上的差異，p＝0.45。觀察到其它所有臨床參數都正常。
在攻擊后觀察期，第1組平均長42.62磅。第3組平均體重增長36.5磅，第4組增長平均37.1磅。第3組和第4組之間沒有顯著差異，p＝0.9，這可能是第4組偶然暴露于PRRS病毒之故。但是，這并不減弱第1組和第3組之間數據的比較，因為這兩組間有統計學意義的差異。在一個時期內評價豬的性能提供了評價這些豬整體健康的極好工具。這一數據與其它參數一起，表明受試疫苗面對實驗性攻擊的益處。
攻擊后體溫證明受試疫苗處理面對實驗性攻擊的益處。攻擊對照組，第3組，有8天組平均體溫比攻擊前平均值升高至少1°F。第1組任何時候都沒有組平均體溫升高1°F的。雖然第4組沾染了PRRS病毒，該組平均體溫并未升高1°F。這是因為病毒的組內播散是逐漸的，與實驗性攻擊相比并不完全被包圍。然而，從15DPC至21DPC各只豬體溫的分析表明，第4組豬在暴露于PRRS病毒后實驗性體溫升高。第1組和第3組各只豬體溫的分析使疫苗處理的益處顯得更為突出。第3組10只豬中10只連續兩天或更多天體溫升高1°F。相反，第1組并無可比的結果。
疫苗效應的進一步證據被攻擊后WBC計數結果所證實。在攻擊后，第1組平均WBC數降低。攻擊后，第1、3、5、7和9天，分別出現14％、19％、14％、21％和13％的降低。第3組平均降低15％、37％、43％。31％和28％。第4組，未攻擊對照組，在同一時期降低11％-17％。各豬評分的分析進一步證實疫苗處理所提供的保護。第3組10只豬中10只連續2個或更多試驗日WBC計數降低25％或更多。第1組連續2個試驗日21只中2只白細胞減少25％或更多。第4組受感染豬與第3組的結果相似。當病毒播撒發展到全組時，白細胞減少的發生率變得很明顯。在15DPC和21DPC之間，該組的50％在連續的試驗日WBC計數降低25％。這些結果表明，接種疫苗的豬并不發生未接種豬所發生的白細胞減少。
21DPC的肺肉眼(大體)觀察分析分為肺實質和肺胸膜評分，然后合并為總的肺評分。對于非攻擊對照組偶有PRRS病毒暴露的，此觀察的分析較難進行，因為不能顯現出陰性基線。因此必須限制第1組和第3組之間的比較，因為這兩組在同一時間暴露于同樣的病毒下。在嚴重程度上第3組的實質評分較大，10只豬中4只個體評分為200。第1組的最高評分為100。用疫苗處理后，該處理組受侵襲的百分率和實質損害的嚴重程度降低。同樣，疫苗處理降低了胸膜損害的發生率和嚴重程度。第1組24％(5/21)胸膜評分100；而第3組50％(5/10)胸膜評分100。第1組的大部分豬(9/21)偶然地胸膜評分為15或更少。肺評分與呼吸疾病之間不存在相關性。例如，第3組1只豬的臨床呼吸評分為23，肺總評分為287.5；而第3組另一只豬臨床呼吸評分為0，肺總評分為300。在肺評分和臨床呼吸評分之間缺乏相關性還有一些例子。無論大體觀察對分析疫苗的有益效應是否可靠，結論可以是處理組(第1組)較少豬有損害，且這些損害的嚴重程度降低。
總之，用于評價疫苗面對接種后110天的實驗性攻擊的效應的很多參數互相間相關性很好。在病毒血癥是主要證據的時期(3-9DPC)，出現明顯的白細胞降低和體溫升高。在攻擊時，豬約為20周齡或比實施例3中受攻擊的豬大12周。本研究中見到的很多臨床癥狀更為嚴重。例如，本研究中(直腸)體溫升高8天，而與免疫原性研究中為5天。本研究中未接種-受攻擊對照組(組3)白細胞減少的嚴重程度比免疫原性研究的攻擊對照組更令人注目。在前一個研究中，攻擊對照組WBC計數實驗性降低43％-27％(3-9DPC)。在免疫原性研究中，攻擊對照組WBC計數2-9DPC實驗性降低15-21％。免疫原性研究的接種-攻擊組在攻擊后期間(1-14DPC)檢出病毒血癥的天數在有可能的110天中為0，與其相比，本研究中攻擊對照組是110天中的45天。因此，臨床體征嚴重程度的增加不完全是由于病毒血癥時期的增加。
本研究的攻擊后結果證明，劑量水平為3.32對數/2.0ml的PRRS-MLV疫苗的接種對于在接種后110天以有毒PRRS病毒攻擊提供了保護。它們是(1)在攻擊后21天觀察期間，接種動物病毒血癥完全陰性；(2)除了呼吸、糞便、鼻和嘴臨床體征少量出現外，接種豬以臨床體征觀察是正常的，(3)接種豬的增重明顯大于未接種-受攻擊豬的增重量，(4)接種豬無顯著的體溫升高；(5)接種豬未出現明顯的WBC計數降低；(6)接種豬實質和胸膜損害的出現和嚴重程度較低。
實施例5在本實施例中，用檢測實施例1和3所述PRRS-MLV第75代疫苗以測定免疫的開始。在研究開始前7天，用免疫過氧化酶試驗(IPT)測試35只豬的PRRS抗體，用在MA-104細胞上進行病毒分離以確定血流中PRRS病毒的存在。在試驗0天，第1組10只豬肌肉接種2.0ml PRRS-MLV第75代疫苗。試驗第7天，第2組10只豬以同樣方式進行接種。第3組10只豬和第4組5只豬保持在分開圈養，但在同樣的環境條件下，作為非接種的同期對照組。在試驗第14天，第1、2和3組豬經受攻擊。由有毒PRRS病毒(VR-2332，第3代，3.7log10病毒/1.0ml)組成的攻擊接種物鼻內給予(2.0ml/豬)。第4組的豬保留不受攻擊。所有豬監測10天呼吸疾病的臨床體征，在研究結束時將所有豬無痛苦處死以評價肺損害。
在攻擊時，第1組的豬用免疫過氧化酶測得血清學陽性，但不是血清中和活性。相反，所有其它豬(包括第2組)兩種方法都是陰性。第2組豬50％在7DPC時IPT試驗陽性，100％在10DPC時試驗陽性。第3組豬在10DPC時IPT試驗陽性。第1和第2組各有一只豬分別在10DPC和7DPC時顯現SN活性。SN結果在p＝0.05水平無顯著性差異(p＝0.05)。本研究的結果證明，即使豬在攻擊時血清學陰性或無血清中和活性，作為處理的結果，仍可認為得到保護。保護可能并不直接與體液免疫相聯系。細胞介導的對以改良活疫苗接種的免疫應答在保護有毒株攻擊上可能起主要的作用。
實施例4中，攻擊后無病毒血癥是證明受接種后保護的重要證據。但是，在本研究中接種和攻擊之間的短時間內，接種動物沒有清除接種后病毒血癥。而且，由于攻擊是同源攻擊，因此不能區分攻擊病毒和疫苗病毒。第1組4只豬和第2組1只豬在從3DPC至9DPC的至少一個測試點上病毒血癥測試陰性。第3組在同樣的時間階段100％病毒血癥測試陽性。
與前面的實施例不同，本研究中見到明顯的臨床呼吸體征的表現。第3組有9/10動物一天或幾天呼吸困難(平均天數等于3.6)。第1組和第2組一天或幾天呼吸困難的動物數分別為1和0(p＜0.001)。鼻臨床體征的發生率與呼吸體征的發生率相似。第3組10只中8只在一天或幾天中有鼻臨床體征。臨床體征的平均持續時間為3.1天。相反，第1組和第2組平均持續時間分別為1.3天和0.1天，有顯著差異(p＜0.001)。其余臨床參數的出現是極平常的。
兩個接種組體重增加均大于攻擊對照組。第2組在10天觀察期中增加平均10.6磅，而第3組為7.8磅(p＝0.01)。第1組平均增重為9.6磅，與第3組相比無顯著差異。此組有兩只最小的豬，在試驗日0分別重7和12.5磅，在攻擊時分別重6和12磅。除去這兩只最小豬的該組平均增重為12.3磅，與第3組有顯著差異(p＜0.001)。這兩只豬的增重率低可能是因為它們不能與組中較大的豬競爭。這些豬在攻擊后觀察期還有腹瀉。10天期間第4組豬體重平均增加15.2磅。此年齡的豬預期每天平均增重在1.0至1.5磅之間。這些結果證明，攻擊前7和14天的接種處理提供保護，使豬達到預期的生長率。
攻擊后，第3組豬有持續平均4.6天的超過攻擊前1°F的體溫升高。第1組和第2組豬有可比的體溫升高的平均天數分別為0.5和1.1天(p＜0.001)。20只接種豬中只有一只連續2天升高1°F，相比之下第3組10只中有8只。接種組和對照組之間統計學差異為p＜0.001。這些結果證明，第1組和第2組豬的疫苗處理預防了因暴露于有毒PRRS病毒所致的發熱的發生。
第3組豬在3、5和7DPC白細胞計數顯著降低。這些結果與同一時期這些動物的體溫升高緊密平行。接種組的豬有持續1-2天的輕度白細胞減少，然后回升到攻擊前的值。接種豬的這些值與攻擊對照組有顯著差異(p＝＜0.001)。這些結果著重于攻擊前7或14天的疫苗處理通過降低白細胞減少的程度和縮短時間而提供的保護水平。
攻擊前14天或7天的疫苗處理降低肺損害的嚴重程度。兩個接種組均與攻擊對照組有顯著差異(p＝0.01)。接種的評分類似于第4組，正常對照組。第3組的平均肺評分為97.1，與之相比，第1組和第2組分別為9.3和7。后兩組所觀察到的損害被認為是正常的、在常規飼養在健康豬上預期會出現的。
本研究的結果證明，用改良的活病毒疫苗接種7天內刺激保護性免疫反應。接種組豬在實驗性攻擊后在體溫反應、體重增加、白細胞減少、肺損害和臨床體征上觀察到與未接種-受攻擊豬的顯著差異。
實施例6在本實施例中，將兩組(A和B)100只來自PRRS陽性畜群的3周齡斷奶豬用實施例1中PRRS-MLV傳代70代的疫苗或安慰劑(無菌水)進行接種。監測體溫、增重和注射部位反應，對每種處理后外余的30只豬檢測其不良反應。這些豬和各個處理組的其余70只豬在處理后還觀察28天全身健康情況。本研究的結果證明，當疫苗恰當地用于PRRS陽性畜群時不引起副作用，是安全的。
接種前(-2DPV)直腸溫度表明，用于這一試驗的豬不是正常健康豬。在試驗日-2和-1時，A組的體溫明顯高于B組的體溫(p＜0.05)。在試驗的0、1、2和3日，兩組間不存在顯著差異(p＜0.05)。這些結果表明，用改良的活PRRS疫苗接種并不加重引起已存在的體溫升高的狀況。
任何一組都沒有一只豬在接種部位有任何處理后反應。這些結果進一步證明該疫苗以合適的方式接種時的安全性。
從試驗日-2至27的29天期間內，A組30只豬增重平均21.02磅，B組29只豬增重平均18.18磅。差異是顯著的(p＜0.05)。因為本試驗是面對PRRS活性感染而進行的，因此結果表示安全性及有效性。
臨床觀察的結果表明，疫苗顯著地降低一些臨床參數的發生率。降低的參數包括外觀從62到6、糞便從48到24、眼從162到89、鼻從30到0、嘴從30到0、食欲從91到13、治療從37到14、死亡從5到0。第1組接受處理數的降低與B組相比具有顯著意義(p＜0.05)。臨床體征的降低提供進一步的證據表明，改良活PRRS疫苗用于與PRRS病毒有關的臨床發作時是安全的。
總之，本疫苗合適地用于患有與PRRS病毒感染有關的實驗性活動性臨床疾病的畜群時被證明是安全的。本疫苗不加劇臨床癥狀，無論它們與PRRS病毒有關還是與人們所知的存在于這種豬的處理的繼發病原體有關。在此試驗部位存在的情況下，這些結果還顯示在接受疫苗的處理組上的有益效應。
實施例7在本實施例中，用低劑量ACTT-2332第75代疫苗(ACTT VR-2495)給20只無特別病原體的、雌雄兼用的Dutch landrace飼養的5周齡小豬接種，測定其對Lelystad病毒(LV)播散的作用。LV野生株據信在使豬易感染引起表現不良、死亡率高的繼發性呼吸感染上起重要作用。本實施例提供有關疫苗對歐洲抗原型LV病毒傳播的效應的資料。
將豬分成10只一組的兩組，一個試驗組，一個對照組。試驗組的每只豬肌內接種含約103TCID50的ATCC VR2332第75代疫苗的稀釋疫苗2ml。6周后，每組5個動物鼻內接種野生型LV歐洲株(編碼CDI-NL-2.91，Ter Huurne，在豬肺泡巨噬細胞上的第5傳代)進行攻擊，攻擊劑量采用105.3TCID50/20ml。1天后，將受攻擊豬放回它們的圈中。
本試驗檢測是否、什么時候、多少接種和未接種豬顯示臨床疾病或產生病毒血癥，及是否和多少接觸受攻擊豬的同圈豬被Lelystad病毒感染。然后將接種組和對照組的感染定量，并計算出接種組和對照組中Lelystad病毒的傳播率。為使接種成功，接種組中疾病和病毒血癥的嚴重程度和持續時間及傳播率必須小于對照組。
在低劑量和異源攻擊這樣的極端情況下進行試驗的本研究證明了疫苗的保護價值。
疫苗減輕攻擊后疾病的臨床體征。它明顯地降低攻擊后的平均直腸溫度；它明顯地減少受攻擊豬病毒血癥的天數；及明顯地降低受攻擊豬病毒血癥的高度。此外，雖然在接種豬和未接種組的所有豬中都出現從直接受攻擊和接觸受攻擊豬的傳播，但野生型LV在接種組和未接種組之間的傳播有顯著的差異。
因此，用低劑量美國抗原型PRRS疫苗ATCC VR-2332第75代在傳遞對歐洲抗原性野生型Lelystad病毒攻擊的保護作用上有效。
實施例8商業規模的疫苗生產圖1描繪用于從實施例1生產商業規模的改良的主種子培養物活病毒的流程圖。工序10開始于步驟P12，所有容器的滅菌。滅菌較佳為用放射法，但也可用熱或化學方法進行。容器的類型包括接種燒瓶，如75-150ml、5升燒瓶，培養滾瓶和鋼制空氣攪動生物反應瓶。
步驟P14包括制備宿主MA-104細胞的擴展培養物。將MA-104細胞系第58代儲備液儲存在液氮中，用于提供給宿主細胞至第78代病毒培養物。儲備MA-104培養物在約75ml至150ml體積的含50-150ml培養基的燒瓶中生長。培養基較佳包括與10％牛或胎牛血清和約30μg/ml新霉素混合的MEM。滅菌燒瓶和培養基較佳為接種1ml前代MA-104培養物，于約35-37℃培養3-7天。
儲備細胞培養物的擴展較佳是從150ml燒瓶到約400-600ml培養基作1∶5擴展(體積/體積)。于約35-37℃培養約4-7天后，可將此400-600ml培養基傳代培養到充填培養基的5升燒瓶中。或者，可將接種物以1∶3.4比例施加于有約670-850cm2生長面積和150ml培養基的滾瓶培養物中，然后將其以約1∶9至1∶11的比例傳代培養到其它滾瓶培養容器中。將傳代培養物于約35-37℃培養約4-7天。
步驟P16包括制備病毒感染的MA-104細胞的生產培養物。將步驟P14的擴展培養物典型地進一步以約1∶3至約1∶5(體積/體積)的比例擴展到較大體積的生物反應容器中。生產容器可包括如裝有氣升式攪拌器、溫度控制器和pH控制器的5升擴展培養瓶或40升不銹鋼培養器。將容器充填適當量的生長培養基，接種MA-104細胞，于約35℃培養4-7天，并以實施例1的主種子培養物病毒感染。此病毒以CPE測得滴度至少約106TCID50/ml為佳，可至少以0.1-10ml/100ml培養基的比例加到生產容器培養基中。生產培養物用此減毒病毒感染后即于約35℃至約37℃培養2-3天。
步驟18包括在感染后培養期后收獲步驟P16的生產培養物。批量收獲的合適時間應當根據CPE觀察來決定，以約10％肉眼變化(完整細胞和細胞層降解)或10％pH變化為指標。在層流罩下通過傾倒到滅菌容器中或在正壓下通過密閉的收獲系統收獲步驟P16的生產培養物。將批量收獲的病毒冷凍、儲存于約-40℃至約-70℃的溫度下。
如果需要，取等分樣品用于質量控制測定。每一批量收獲物的樣品在巰基乙酸鹽和大豆酪蛋白消化培養基中進行測試，將其在分別在約36℃和20℃各培養14天。如果用CPE測試表明滴度至少約為105TCID50/ml，則將此種子病毒用于給其后的培養物大量移種。不滿意的材料用5％次氯酸鈉滅菌24小時或用高壓滅菌器滅菌。
步驟P20包括使步驟P18中所得的批量冷凍病毒穩定化和冷凍干燥。將批量冷凍病毒融化，較佳為與藥理學上相容的穩定劑，如常規的蔗糖明膠穩定劑，以約3份融化的主種子培養物與約1份穩定劑的比例進行混合。可加生理鹽水以調整病毒終濃度。
然后將混合物分成每份約0.28ml液體的劑量分割物(subvolume)，每一劑量包括約0.20mlPRRS培養物，每劑最低限度滴度為104.9TCID50。此處注意到得自步驟P16、P18和P20的經穩定的生產培養物的優選量將足以得到150,000和500,000之間的穩定劑量。作為例子，25個劑量包括約7.0ml分割物。將這些分割物加塞冷凍，較佳為在液氮中冷凍。當溫度升高到最高約30℃時，將干燥室放在真空下，將分割物最大限度放置18小時，使樣品中的水分升華。
步驟P22包括連續監測從步驟P20得到的疫苗產物。將最終樣品的容器或一系列單批PRRS疫苗作斑點棋盤檢測以確保水分含量低于5％。水分含量大于4％或低于1％的樣品以6個月間隔作效應測試。作為安全性測試，用相當于10個劑量的疫苗量給豚鼠注射，觀察21天以上臨床反應的不良體征。
將VR-2332病毒還與實施例1所述的減毒相平行地進行冷適應。這是為了發展防止受感染動物病毒脫落的疫苗株。這樣的冷適應是在31-35℃溫度進行連續傳代而進行的。所得的病毒株也刺激免疫反應。
權利要求
1.豬生殖和呼吸綜合征病毒的病毒純培養物，所述培養物能感染豬罹患豬生殖和呼吸綜合征疾病。
2.如權利要求1所述的培養物，所述病毒包括ATCC-VR2332及其所有致病性突變體。
3.疫苗組合物，包括改良和基本無毒型豬生殖和呼吸綜合征活病毒。
4.如權利要求3所述的組合物，所述病毒包括ATCC-VR2495。
5.如權利要求4所述的組合物，進一步包括與藥理學上適合的載體劑混合的所述病毒。
6.如權利要求5所述的組合物，所述載體劑包括蔗糖明膠穩定劑。
7.抗豬生殖和呼吸綜合征的免疫豬的方法，所述方法包括對豬投與包括改良和基本無毒型豬生殖和呼吸綜合征活病毒ATCC-VR2332的疫苗組合物。
8.生長和分離豬生殖和呼吸綜合征病毒各型的方法，所述方法包括將所述病毒接種于有血清存在下的合適生長培養基中的猿猴細胞和培養接種的細胞的步驟。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述猿猴細胞為MA-104。
10.生產商品化量的PRRS疫苗的方法，包括以下步驟指標基本無毒型ATCC-VR2332病毒的生產培養物；收獲病毒培養物；添加穩定劑到病毒培養物中；和將病毒培養物冷凍干燥。
11.如權利要求10所述的方法，其中制備步驟包括用所述病毒感染猿猴細胞，將所得培養物在約35℃至約37℃的溫度下培養。
12.如權利要求10所述的方法，其中收獲步驟包括將病毒培養物冷凍。
13.如權利要求10所述的方法，其中添加步驟包括將約1份蔗糖明膠穩定劑和約3份病毒培養物混合。
14.如權利要求10所述的方法，其中冷凍干燥步驟包括所水分從病毒培養物的冷凍樣品中升華。
15.如權利要求10所述的方法，其中所述培養基包括每劑0.28Ml的150,000-500,000個劑量。
16.如權利要求15所述的方法，進一步包括在冷凍干燥步驟前再細分系列體積。
17.如權利要求10所述的方法，其中所述基本無毒型病毒為ATCC2495病毒。
18.按權利要求10的方法制備的疫苗。
全文摘要
本發明提供抗豬生殖和呼吸綜合征(PRRS)的基本無毒的疫苗,這種疫苗有效地免疫豬,使其抗該病的美國和歐洲型。本發明還提供體外生長該病毒劑的方法和將此病毒減毒用于制備疫苗的方法。
文檔編號A61K35/76GK1190349SQ96195440
公開日1998年8月12日 申請日期1996年5月14日 優先權日1995年5月15日
發明者D·W·克拉狄克, D·E·可希卡, L·L·哈里斯 申請人:伯林格·英厄爾海姆有限公司