實現增強信噪比的多光子光學成像的光纖光學裝置的制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種能改進多光子成像信噪比、含有單根雙包層光纖(DCF)的光纖裝置。該裝置還包括具有2毫米左右外徑的內窺顯微鏡內的用于聚焦、掃描和信號采集的所有組件。離體和在體實驗都證實了這種微型內窺顯微鏡的前所未有的成像能力。
【專利說明】實現増強信噪比的多光子光學成像的光纖光學裝置
[0001]相關申請
[0002]本申請要求以下專利申請的優先權:美國臨時專利申請號N0.62/169,712(標題為Fiber-Optic Methods and Devices Enabling Multiphoton Imaging with ImprovedSignal-to-Noise Rat1，2015年6月2日提交)上述專利申請的內容通過引用并入本次申請中并適用于所有目的。
技術領域
[0003]本發明與成像領域有關，尤其涉及用于實現增強信噪比的多光子光學成像的光纖光學方法與裝置。
【背景技術】
[0004]由于其固有的光學層析性能、更深的穿透能力和減弱的焦外區域光損傷，多光子顯微成像技術，尤其是基于雙光子焚光(TPF)和光學二次諧波產生(SHG)信號的顯微成像，已經被廣泛應用在基礎生物和生物醫學研究中。然而，由于傳統的臺式激光掃描顯微鏡(LSM)無法直接接觸和成像動物體內深處的組織，多光子成像技術對活體研究和臨床應用的益處還十分有限。為了擴展這一類具有高分辨率的強大成像模式的應用范圍，一種小型化的、易彎曲的、成像能力堪比標準激光掃描顯微鏡的內窺顯微裝置是非常必要的，并且近年來也有各種各樣的內窺顯微鏡設計問世。
[0005]不管采用何種光學和機械設計方案，開發一款適合實際臨床應用的內窺顯微鏡系統的核心挑戰是盡可能提高系統的檢測靈敏度。這里我們把檢測靈敏度定量地定義為在給定單位熒光團濃度和單位入射功率成像時系統可以達到的信噪比(SNR)。這是從根本上對系統獲取高信噪比雙光子圖像能力的一種綜合全面的度量。具備足夠高的檢測靈敏度對于臨床應用尤其關鍵，因為:I)在臨床應用中會被優先選用的內源性熒光團，比如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，和(或)結構蛋白，比如膠原蛋白纖維，通常存在豐度較低，并且其雙光子吸收截面相比外源性的熒光染料或熒光蛋白質要小得多；
2)出于安全考慮，臨床上可以使用的最大入射功率是有限的。以前的內窺顯微鏡原型，雖然表現出良好的應用潛力，整體上卻依然受困于其匱乏的靈敏度，所以只有在使用外源染色的樣品或者非常高的激發光功率(?70毫瓦)的情況下才能獲得足夠高的圖像質量。
[0006]實現小型化的要求加劇了在內窺顯微鏡上取得高檢測靈敏度的難度。以前有若干設計方案采用了兩根光纖:一根單模光纖用于傳輸激發光、另一根大孔徑的多模光纖用于信號收集。這種雙光纖設計方案，雖然有利于收集更多的非線性熒光信號，但通常會導致探頭尺寸過大，以至于沒法穿過市場上商品化的胃鏡或結腸鏡的介入通道(約2.8-4.0毫米直徑)。
[0007]因此開發一款既能提供高質量圖像又能適配市場上的商品化內窺鏡介入通道的、更小的顯微內窺探頭是大有裨益的。
【發明內容】
[0008]根據本發明的第一個實施例，該裝置包括一個外殼。該裝置還包括安置于外殼內的單根光波導，用于激發光的傳輸和出射光的收集。另外，該裝置還包括安置于外殼第一端的用作致動器的壓電晶體管(PZT)，以及安置于外殼第二端的消色差物鏡。
[0009]根據本發明的一個實施例，單根光波導采用了單根光纖的形式。單根光波導可能含有一個或多個單模纖芯和多個包層，其中纖芯(一個或多個)用于將激發光傳輸至樣品，而至少一個包層(和一個或多個纖芯)用于從樣品中收集出射(熒)光。單根光波導可以具有純二氧化硅纖芯、鉀摻雜的二氧化硅纖芯、或者一個中空芯。單根光波導也包括一根具有至少一個單模纖芯、一個包層、以及一層低折射系數的涂覆層的光纖。
[0010]根據本發明的另一個實施例，所述物鏡在相關的波長范圍表現出低色差或無色差，以便提高將出射光耦合回光纖的效率。消色差物鏡用于收集主要在長波長(例如750-1060納米)激發光的聚焦體積內產生的短波長(例如350-600納米)出射光。消色差物鏡還包括一個進一步含有多個具有不同折射率分布(包括漸變折射率透鏡/玻璃)和/或不同曲率的鏡片、以便校正色差和輸入掃描成像光束的場平整度的微型復合透鏡。消色差物鏡還可以采用一個包含衍射元件/掩模以補償色差和減少縱向焦點偏移、并同時保持高數值孔徑(因此高分辨率)和小尺寸的微型復合透鏡的形式。
[0011]本發明的另一個實施例，該裝置包含了內置的用于實施二維和三維光束掃描的機制。該內置機制可以采用的形式包括:一根壓電晶體管致動的二維光纖掃描器，一個微機電器件致動的二維或三維光纖掃描器，一個內置的深度掃描器，或一個包括壓縮彈簧和形狀記憶合金絲、用于將部分聚焦光學組件相對于探頭其余部分平移的機械掃描器。內置的機構會配備有相應的用于驅動和控制的電子設備。短脈沖光源可以用作激發光源。色散管理模塊被用于補償系統中的光纖和其他光學器件的帶來的色散，以便實現短脈沖和良好的信號生成效率。該色散管理模塊可以米取的形式包括:一根光子帶隙光纖，一對光柵，一對棱鏡，或一個光柵透鏡對。該裝置可以包括一種將出射光從激發光中分離出來的機制。這一從激發光中分離出出射光的機制可以采取分色鏡的形式。光探測器被配置成探測出射光，并包含用于預處理和獲取信號的電子設備和用于信號數字化和存儲數字化的信號的電子設備。光檢測器可以采用一個光電倍增管的形式。該裝置還可以包括控制裝置，成像光束掃描器驅動器，用于控制和同步驅動信號和數據采集、數字化數據、處理并存儲數據的數據獲取、顯示和存儲模塊。為了將光在自由空間與光纖之間來回耦合而配置的光學器件也包括在本裝置當中。
【附圖說明】
[0012]附圖提供了可視化表示，以用于更充分地描述本文所公開的代表性實施例，也可以用于幫助本領域的技術人員更好地理解該裝置及其固有的優點。在這些附圖中，相同的附圖標記標識了相應的元件:
[0013]圖1A展示了根據本發明研發的一款內窺顯微鏡實例的透視圖。
[0014]圖1B展示了三種不同雙包層光纖(DCF)的非線性背景光子出射率隨波長的變化譜圖。
[0015]圖1C展示了微物鏡的透視圖。
[0016]圖1D展示了微物鏡的后焦點偏移仿真圖。
[0017]圖2A顯示了本發明的一個實施例的系統框架圖。
[0018]圖2B展示了在單光纖(SF)和雙光纖(DF)補償方案下，激發光脈沖通過整個系統過程中的光譜演變(890納米中心波長)。在單光纖補償方案中通過比較輸出光譜(點線25)和激光光譜(實線26)、在雙光纖補償方案中通過比較DCF的輸出光譜(虛線24)和SMF的輸出光譜(點劃線23)，都可以觀測到負啁啾脈沖在自相位調制(SPM)效應下光譜被壓縮的現象。
[0019]圖2C比較了在兩種不同補償方案下，各個激發功率水平所能產生的雙光子信號的強度。
[0020]圖3A和3B顯示了從小鼠小腸黏膜同時采集的、對應于如下兩個譜段的內源性TPF圖像:417-477納米(偽綠色)和496-680納米(偽紅色)。
[0021 ]圖3C和3D顯示了從小鼠肝臟組織獲得的內源性TPF和SHG圖像的疊加，對應的光譜頻段范圍是:496-680納米(偽綠色)和435-455納米(SHG信號，偽紅色)。
[0022]圖3E和3F分別展示了由米非司酮誘導早產(PTB)的小鼠(圖3E)和正常妊娠15天的小鼠(圖3F)的宮頸組織切片的SHG圖像;每張圖都包括四張從不同的位置獲取的子圖，以更好地揭示膠原蛋白結構的形態學差異。用于獲取每張附圖的激發條件為:750納米中心波長30暈瓦(圖3A和3B)，890納米中心波長30暈瓦(圖3C和3D)，和890納米中心波長40暈瓦(圖3E和3F);圖3A和3B使用了4幀原始圖像的平均，圖3C和3D使用了5幀平均，圖3E和3F使用了 10幀平均。比例尺:10微米。
[0023]圖4A-4H展示了代表性的活體TPF顯微內鏡圖像。更具體地說，圖4A和4B展示了從小鼠小腸黏膜同時采集的、對應于兩個不同譜段的內源性TPF圖像(與離體情況相同)。獲取圖像時激發光的焦點相對于小腸絨毛尖端的深度分別為約3微米(A)和約16微米(B)。圖4C-4H分別展示了從小鼠尾靜脈注射熒光素綴合的葡聚糖示蹤劑后約4分鐘(圖4C)，約7分鐘(圖4D)，約10分鐘(圖4E)，約13分鐘(圖4F)，約16分鐘(圖4G)和約40分鐘(圖4H)后的來自腎小管細胞的雙光子自發熒光(417-477nm出射譜段，偽綠色)和雙光子熒光素熒光(496-680nm出射譜段，偽紅色)的疊加圖像。用于這里的所有子圖的激發條件為750納米中心波長30毫瓦和2幀原始圖像平均。比例尺:10微米。
[0024]其中:
[0025]01:雙包層光纖;02:壓電晶體管致動器;03:微物鏡;04:不銹鋼外套管;05:漸變折射率透鏡I; 06:漸變折射率透鏡2; 07:高折射率平凸透鏡;08:保護性玻璃片;09:相位衍射光柵；10: S麗900型號雙包層光纖；11 = NuFern 5/130型號雙包層光纖；12:定制的雙包層光纖；13:微物鏡焦點偏移曲線；14:光柵對；15:直角回射鏡對；16:來自摻鈦藍寶石激光器的飛秒脈沖；17:單模光纖；18:分色鏡；19:帶通濾光片；20:短通濾光片；21:光電倍增管;22:內窺顯微鏡探頭;23:雙光纖補償方案下單模光纖的輸出光譜;24:雙光纖補償方案下雙包層光纖的輸出光譜;25:單光纖補償方案下雙包層光纖的輸出光譜;26:摻鈦藍寶石激光器的輸出光譜;27:雙光纖補償方案;28:單光纖補償方案；
【具體實施方式】
[0026]下文中將參照附圖更充分地描述目前公開的主題，并展示本發明的一些、但不是全部的可能實施例。相同的數字指代相同的元件。目前公開的主題可以有許多不同的實現形式，而不應被理解為僅限于這里闡述的實施例;相反，提供這些實施例是指為了使得本公開滿足適用的法律要求。事實上，對于熟悉與本發明公開主題相關技術的相關領域的技術人員而言，由于前述描述和相關附圖的教學作用，他們很容易想到許多針對目前公開主題的修改方案和其它實施例。因此，目前公開的主題內容應被理解為不局限于所公開的特定實施例，而旨在將相關的修改和其他實施例也包括在所附的權利要求范圍之內。
[0027]目前的發明涉及一種能改進多光子成像信噪比、含有單根雙包層光纖(DCF)的光纖裝置。該裝置還包括包含在2毫米左右外徑的內窺顯微鏡內的所有用于聚焦、掃描和信號采集的組件。離體和在體實驗都證實了這種微型內窺顯微鏡的前所未有的成像能力。
[0028]為了將功能強大的多光子顯微鏡技術應用到活體的臨床實踐中，近年來可彎曲的光纖內窺鏡被探索用來實現對內部臟器的直接成像。為了真正適合和有助于臨床應用，應該首選只利用內源性熒光基團和/或結構蛋白的內窺顯微技術。因此，除了追求小型化，內窺顯微鏡必要的另一個屬性是足夠高的檢測靈敏度，而這恰恰是之前報告的內窺顯微鏡設計所缺乏的。本發明針對幾個關鍵的性能限制性難題一一包括用于脈沖傳輸的光纖中的非線性背景干擾和微物鏡的焦點偏移一一提供了相應的解決方案。在小巧的探頭直徑(?2毫米)內，本發明新研發的內窺顯微鏡達到了前所未有的檢測靈敏度，它可以在僅使用內源性雙光子信號和中等激發功率的情況下就清晰地呈現亞細胞結構。這些成像結果證實了該裝置在臨床環境實現活體光學活檢的光明前景。
[0029]圖1A展示了基于本發明的內窺顯微鏡探頭的機械組裝圖。該裝置包括了一根具有單模纖芯的雙包層光纖(DCF)02。該DCF是用來傳輸飛秒激光脈沖。該裝置還包括一個微物鏡03用于聚焦激發光和收集出射光子。微型物鏡被安置在支架的內部。DCF12的大直徑內包層可以把信號導回該裝置的近端以便被檢測。管狀壓電致動器02被用來把光纖懸臂共振地振動成螺旋掃描模式。所有部件都被容納在一根不銹鋼殼體管04中，其中該不銹鋼外殼管的直徑小到足以穿過典型的商業化內窺鏡。應該指出的是，這些部件都是示例性的，其他任何適當的、已知或相關領域的技術人員能夠想到的能達成相同目的部件也可被使用。
[0030]在關于本發明的該裝置中，第一個挑戰來自于DCF纖芯中的非線性背景出射光。市售的被動DCF—般使用二氧化鍺(Ge02)摻雜劑以提高纖芯的折射率。事實證明，該摻雜劑也使得纖芯具備了雙光子激發活性，當飛秒激光脈沖通過時，纖芯會產生可感知的TPF與SHG信號。先前的研究將SHG的來源歸因于通過鍺原子中心電荷轉移激子自組織而建立的二氧化硅反演對稱性的斷裂，將TPF的來源歸因于Ge02摻雜導致的氧不足型缺陷。我們研究了如下兩種常用的商業DCF的背景光譜:Nufern公司SM-GDF-5/130光纖和Fibercore公司的SMM900光纖；這兩種光纖都在以前的內窺顯微鏡設計中被采納過。通過將飛秒激光脈沖(890納米中心波長)耦合進DCF纖芯、并在同一端面上檢測后向傳播的非線性背景出射光，我們可以測量非線性背景出射光的光譜分布(圖1B，上兩條曲線，10和11)。通過曲線看出，這兩種商業DCF的背景出射光譜都包含一個相對窄而突出的SHG峰和延伸到600nm波段的寬譜熒光成分。這種非線性的背景出射光是很難消除的。首先，非線性背景光的寬光譜在很大程度上與典型的內源性TPF和SHG信號相重疊，從而無法使用濾光片將其剔除。其次，背景熒光光子以隨機方式出現(滿足泊松隨機過程)，所以噪聲水平在像素之間劇烈變化。即使將平均背景噪聲減去，噪聲的顯著波動仍然足以掩蓋典型水平的內源性TPF和SHG信號，進而降低整體的圖像信噪比和系統檢測靈敏度。
[0031 ]由于TPF與SHG背景的根源都來自鍺摻雜，定制的具有純二氧化硅纖芯的DCF 12可以很好地解決這個問題;純二氧化硅纖芯可以確保降低雙光子背景熒光的發光效率和產生SHG背景所需的準相位匹配條件的發生幾率。為形成波導結構，DCF包層區域被摻入了氟摻雜劑以降低折射率系數。我們用測量商業DCF背景時相同的實驗條件測量了定制DCF的背景出射光譜(圖1B，底部曲線12)。與前兩種商業DCF相比，定制DCF的背景噪聲具有相似的光譜形狀，但是光譜的絕對強度要相對低得多。通過數值積分光譜曲線，兩種商業DCF的總背景光子出射率比定制DCF分別高出約35倍和約15倍。基于泊松分布假設，定制DCF將背景噪聲的波動水平相比分別降低了約5.9和約3.9倍，從而降低了最小可檢測信號水平并相應地增強了系統的檢測靈敏度。
[0032]增加系統檢測靈敏度的第二種方法是提高信號收集能力。多光子內窺顯微鏡依賴于微物鏡將激發光聚焦到組織上，并且將出射光子收集回光纖端面。不幸的是，普通的微透鏡，比如漸變折射率(GRIN)透鏡，通常表現出相當大的正色差，這會導致出射光的聚焦位置顯著偏離光纖端面(即激發波長的聚焦位置)。特別地，由于雙光子熒光的出射波長(400-600納米)比激發波長(800-950納米)短很多，出射光的后焦點將落在光纖端面的前方，因此即便使用大口徑包層的DCF收集也難以避免顯著的出射光子收集損失率。為了減少這種焦點偏移，也曾有由2至3個非球面鏡片和/或雙合透鏡組成的微物鏡設計出現。然而，這些設計要么焦移仍高達I毫米(對400納米出射波長)，要么犧牲了聚焦的數值孔徑。更加復雜的、集成了更多鏡片的設計可能會有更好的性能，但這樣的鏡頭其整體長度可能會太長而不適合用在易彎曲、緊湊的內窺鏡探頭上。
[0033]為了有效地校正色差并保持物鏡的緊湊性，本發明的裝置將一個衍射光學器件(DOE)集成到了物鏡設計中，如圖1C所示)。該裝置包括兩個漸變折射率透鏡05，06和一個夾在二者之間的相位衍射光柵09。該裝置還包括一個平凸透鏡07和防護玻璃罩08。由于具有與常見的折射透鏡相補的色差屬性，衍射光學器件已在目鏡和相機鏡頭設計中得以廣泛應用。我們這里使用的衍射光學器件是一個多層相位衍射光柵，它具有同心的、由中心到邊緣逐漸加密的光柵結構。波長較長的光，有更大的衍射角度，從而聚焦位置更近(因此是互補的色差性質)；具體的波前形狀可以通過調諧光柵間隔而進一步優化。這一衍射光學器件被夾在兩個漸變折射率透鏡之間，第一個漸變折射率透鏡(約1/4節距)用來準直出自DCF纖芯的發散光束，第二個漸變折射率透鏡(〈1/4節距)用來預聚焦光束。再前面是一個高NA的平凸透鏡用來實現強聚焦，鏡頭的工作距離(WD)在水中約為200微米。通過優化這兩個漸變折射率透鏡的折射率分布和相位衍射光柵的間隔樣式，整個物鏡的球差和色差可以降到最低。所有的折射和衍射元件最終都被封裝和固定在一個用于保護的不銹鋼護套內(外徑1.4暈米X長度6.5暈米)。
[0034]最終鏡頭設計在一個很寬波長范圍內的焦點偏移可以通過仿真獲得，其結果如圖1D所示。從中可以看出，最大的焦點偏移也被很好的控制在150微米范圍內。給定微物鏡的設計NA(約0.16的像端NA和約0.80的物端NA)，通過幾何光學計算可以估計出，對于無散射的彈道出射光子，只要能被微物鏡收集，最終都會集中在光纖端面上一個直徑約49微米的圓形區域內；因此，這些光子將被具備185微米直徑、0.35NA的定制DCF的內包層完全收集。這里采用的超大號高NA的DCF內包層和良好控制的微物鏡焦移對于成像實際的強散射組織有更關鍵的作用，因為其中許多會以較大的傾斜角度進入微物鏡的非彈道信號光子相對更難收集。為了通過實驗驗證和評估收集效率的提高程度，我們將定制的鏡頭與一款復合透鏡做了比價。兩個鏡頭被安裝到相同的內窺顯微探頭上，并成像相同的鼠尾腱組織(或熒光體模)以比較SHG(或TPF)信號的收集效率。最終的比較結果表明前述的定制微物鏡可以把SHG和TPF的信號強度分別提高約2.5和約2.0倍。注意這兩個比率是用定制的大內包層DCF獲得的，所以如果和普通的DCF相比，通過定制DCF和微物鏡所取得整體收集效率的提升程度(倍數)應該更高。
[0035]結合到本發明的裝置中的最后一個增強系統檢測靈敏度的方法是保持短脈沖長度，從而使得在給定入射功率下能夠激發更多的非線性出射光子。眾所周知，飛秒激光脈沖在光纖纖芯中傳播時，會經受由線性色散和非線性效應共同引發的時域展寬。以前的研究表明主要的非線性效應是自相位調制(SPM)，而SPM效應會壓縮負啁啾飛秒脈沖的光譜；因此，由于時域帶寬積限制，在僅使用線性的預啁啾補償時，脈沖展寬是“不可避免”的。本發明在施加負的線性預啁啾補償的基礎之上又引入了光譜域的補償，從而可以保持短的脈沖長度。如圖2A的系統框圖所示，未啁啾的激光脈沖被首先射入一根單模光纖17中以便通過SPM效應達到光譜展寬的效果。然后脈沖在負啁啾調制后被耦合到DCF的纖芯中，在這里脈沖的時域長度和光譜帶寬都在傳播過程中被逐漸壓縮;圖2B展示了這種光譜演化的一個示例。數值模擬已經表明，當由光柵對施加的負群延遲剛好抵消兩段光纖中總的正群延遲時，脈沖的時域長度會達到最小，并且這一最佳條件對脈沖功率的變化并不敏感。我們用光學自相關器驗證表明，當DCF中傳輸的脈沖激光的平均功率從14毫瓦變至56毫瓦的過程中，輸出脈沖的強度自相關函數(ACF)的半高全寬(FffHM)會一直維持在約120飛秒。反之，當僅使用光柵對施加線性預啁啾補償時，隨著平均傳輸功率從14毫瓦提高到56毫瓦，輸出脈沖的強度ACF的FWHM會相應從約420飛秒增長到約720飛秒。如圖2C所示的定量的體模實驗表明，相比于僅使用光柵對的單光纖方案28，雙光纖方案27可以把TPF的信號強度提升約2-3倍。
[0036]圖3A-3F展示了具有代表性的、從未染色的離體小鼠組織中獲得的內源性TPF和SHG圖像。圖3A和3B是小鼠小腸黏膜在不同深度處的TPF圖像。在圖3A中，焦平面被調至剛好低于小腸絨毛的尖端，這時上皮細胞(主要是腸上皮細胞)呈現出一種馬賽克式的圖案和綠帶微黃的偽彩色，這與NADH和FAD的出射光譜相匹配。在圖中負責粘液分泌的杯狀細胞呈現為散布于明亮的腸上皮細胞之間的暗斑(如虛線框所示)。當焦平面向深處進一步移動約20微米時，我們能看到如圖3B所展示的由一個個腸上皮細胞排列而成的腸絨毛的橫截面圖；相對于富含線粒體的細胞質，上皮細胞的細胞核呈現為暗淡的圓形。在小腸絨毛的固有層中，含有許多溶酶體的抗原提呈細胞(APC)顯示為鮮亮的紅色顆粒(如三角所指)。溶酶體對腸上皮細胞的吸收功能也至關重要，并且它們會優先積聚在上皮細胞細胞質的頂部，如圖3A和3B中淡黃色的點狀顆粒(如箭頭所指)所示。
[0037]圖3C和圖3D展示了從離體小鼠肝臟的相同橫向位置(但對應于不同深度)同時獲得的內源性TPF和SHG信號的疊加圖像。隨著焦平面從圖3C的位置深入了約20微米到圖3D的位置，膠原蛋白纖維的SHG信號(紅色)減弱，而細胞質的TPF信號(綠色)變強，這反映了肝臟細胞(這里大部分是肝實質細胞)和胞外由網狀纖維組成的支撐網絡(主要是III型膠原蛋白)在空間位置的縱橫交錯。在這兩張圖中值得注意的是散落在細胞質中的多處明亮的顆粒狀物質;這些顆粒被認為是具有強烈自發熒光、并隨著細胞衰老不斷積累的脂褐質。
[0038]并置相比較的是分別來自于用米非司酮處理誘導的早產(PTB)小鼠模型(圖3E)和正常妊娠15天的小鼠(圖3F)的宮頸組織切片的膠原蛋白纖維的SHG圖像。從形態上看，PTB組的膠原蛋白結構更加疏松多孔，這反映了由米非司酮誘導的宮頸早熟。
[0039]在對活的動物進行活體成像的過程中，動物組織通常會有由呼吸導致的整體運動和/或胃腸的蠕動。因此，為了避免引入嚴重的運動偽影和圖像模糊，活體成像中可用的平均幀數是有限的。在這種情況下，由于具有優異的檢測靈敏度，本發明的內窺顯微鏡仍可拍攝到清晰的亞細胞結構。
[0040]使用與離體成像時相同的激發功率，我們實驗了在活體的小鼠小腸黏膜上進行內源性TPF成像，并相應使用了更少的平均幀數(圖4A和4B均只用了 2幀平均)。在所得的活體圖像中依然可以情況得看到與離體情況相似的亞細胞結構，例如呈現為紅色的位于固有層中的抗原提呈細胞和呈現為黃色的位于腸上皮細胞胞漿頂部的點狀顆粒。活體研究的一個最好的特征就是具備監測正在運轉的器官或組織的動態信息的潛力。為了證實這一點，我們對活體的小鼠腎臟實施了持續的TPF成像;為了呈現腎小管中的流體輸運，我們從小鼠尾靜脈注射了分子量約為3，000至5，000的熒光素綴合葡聚糖(Aldrich化學公司)作為示蹤劑。如圖4C到4H所示，腎小管的區段邊界可以通過上皮細胞的胞漿自發熒光(綠色)劃定出來，而熒光素的信號(紅色)可以用來示蹤管內的流體動力學信息。由圖可見，在注射葡聚糖后(約4分鐘)，熒光素信號迅速在近端腎小管中出現(圖4C)，然后隨時間逐漸衰減(圖4C至4G)。在注射后經過約40分鐘，大部分的熒光素信號都從近端小管中清除出來并濃縮到了遠端小管內(圖4H);—部分葡聚糖示蹤劑被近端小管細胞吸收，如圖中的微黃色點狀顆粒(如箭頭所指)所示。
[0041]總之，本發明的內窺顯微鏡具有顯著增強的檢測靈敏度，它可以僅利用內源性的TPF與SHG信號和適度的激發功率(30?40毫瓦)就清晰地呈現組織的亞細胞結構，從而表現出適用于廣泛臨床應用的強大潛力。如果在一些情況下引入適當的外源性熒光團，那么在自發熒光的背景上可以進一步捕捉到動態變化，從而產生有價值的功。
[0042]過去的研究表明，與共聚焦顯微成像術相比，雙光子激發能降低整體的光損傷。然而，焦點內的非線性光損傷仍然可能對組織帶來傷害。雖然本文中包括的示范實驗所使用的平均激發功率達到了 30毫瓦(除了離體宮頸組織切片使用了約40毫瓦平均功率)，這已經超過了以前細胞培養研究所建議的無光損傷激發閾值(〈10毫瓦)；但是在我們的實驗過程中沒有觀測到明顯的光損傷跡象。可能的解釋包括這里的內窺顯微鏡使用了更低的聚焦NA(約0.6)，實行了連續波束掃描，以及與細胞培養物相比實際組織可能具有更高的光損傷容限。
[0043]通過更好的機械設計，本發明目前的內窺顯微鏡的2毫米左右外徑尺寸可以進一步減小，因為該尺寸的下界根本上是由壓電晶體管(1.3毫米外徑)和微物鏡(1.4毫米外徑)所決定的。當前內窺顯微鏡的視場直徑約為100微米，超過此范圍則激發光的漸暈效應變得很明顯。有限的視場大小和工作距離主要都源自要在狹小的探頭外徑內實現強聚焦的需求，尋求更好的光學設計的研究正在進行當中。
[0044]限制內窺顯微鏡探頭的靈活性的另一個機械因素是其剛性部分的長度(這里約32毫米)；目前該長度受限于光纖懸臂和壓電晶體管(各約10毫米長)的總長度。這兩個長度與諧振掃描頻率和單位驅動電壓下能取得的掃描范圍息息相關。雖然縮短光纖懸臂可以提高掃描速度，從而有可能減少運動偽影，具體縮短的程度需要權衡由此引發的可實現掃描范圍的減小程度和每幀中可用的出射光子數量(假設相同的激發條件)。最佳的折衷方案依賴于具體的應用。
[0045]最后，有人可能已經注意到，與僅使用了光柵對的單光纖補償方案相比，雙光纖脈寬補償方案所實際取得的TPF信號增強程度(約2-3倍)要小于光脈沖的強度ACF的FWHM的減小程度(約4-6倍)。這種差異源自于兩種補償方案最終的輸出脈沖在時域形狀和光譜輪廓上的差別。特別的，在雙光纖補償方案中，大幅度展寬的脈沖光譜可能已經超出了熒光團的吸收光譜范圍，因此激發效率也會隨之降低。如何更好地控制光譜展寬是一個值得進一步研究和探討的課題。
[0046]—根表面劃分為四個象限電極的壓電晶體(PZT)管被用作致動器。簡而言之，我們將一根DCF穿過并固定到PZT管上，并將露出的自由端用作懸臂。通過在兩組電極對上施加適當的調幅正弦驅動信號，光纖末梢能夠共振地振動成開啟和關閉的螺旋掃描模式。當DCF懸臂設定為約11毫米長時，對應的機械共振頻率為約1380赫茲。在本文中，每一幀原始圖像含有512圈掃描軌跡，所以單幀圖像的采集時間是約0.37秒。所述內窺顯微鏡的空間分辨率(橫向約0.7微米，縱向約6.5微米)是通過成像和測量由機械平臺掃描的0.1微米直徑的熒光珠和I微米厚度的熒光薄膜、然后再高斯擬合所得的熒光信號隨距離的變化曲線而估計得到的。
[0047]從摻鈦藍寶石激光器(Chameleon Vis1n II ,Coherent)中產生的未啁啾的激光脈沖的FWHM是大約150飛秒。這里采用的SMF(PM780-HP，Thorlabs公司)同時也是保持偏振的。對890納米(780納米)中心波長的光脈沖，這里采用的光柵對(600線/毫米，WasatchPhotonics)每毫米間距可以產生約-1000飛秒平方(約-642飛秒平方)的群延遲色散。介于當前使用的單模光纖和雙包層光纖的長度(分別約25厘米和約75厘米)，中心波長為890納米(780納米)的激光脈沖的最佳脈沖寬度應該在光柵對間距等于約36毫米(約55毫米)的時候取得。由于光柵的有限傳輸效率(約80 % )和系統其它部分的耦合損耗，在DCF纖芯中傳輸的激光只有在SMF中功率的約20 %。于是DCF中的SPM效應相比SMF中要弱很多，因此導致光譜不能被充分壓縮，如圖2B所示。通過DCF傳回的出射熒光信號首先在分色鏡(FFF665-Di02-25x36，Semrock)上與激發光分離，然后在通過一個短通濾光片(FF01-680/SP-25，Semrock)和適當的(一個或多個)熒光濾光片之后進入光電倍增管(H10771P-40，Hamamatsu)中被探測。
[0048]為了實現用于比較的單光纖脈寬補償方案，我們首先旁路了系統中的單模光纖，然后將光柵對的間距調(長)到使DCF纖芯中的傳輸功率為56毫瓦時輸出脈沖的強度ACF最窄。用于比較TPF強度的熒光體模是通過將熒光素均勻分散(10微摩爾濃度)于稀釋的明膠溶液(約％10質量濃度)中制得的。體模被密封在一塊O號蓋玻片(約100微米厚)下面，以避免由于微物鏡需要水浸環境而使得明膠在成像過程中發生溶解。用于比較微物鏡的熒光素體模中也是用相同的方式制備而成的。在整個成像過程中沒有觀察到可見的光漂白跡象。
[0049]具有純二氧化硅纖芯的DCF是通過外部汽相沉積(OVD)技術制得的。通過調諧內包層的氟摻雜濃度，纖芯的NA可以被調到約0.12;纖芯的單模操作則是通過精確控制纖芯的尺寸(約5.5微米)來實現的。與之類似地，內包層的高NA(約0.35)則是通過進一步調節外包層中的氟摻雜濃度來實現的。
[0050]背景熒光的測量方法與系統框圖很類似，唯一不同的是出射信號首先通過了一款基于光柵的單色器(ActonSP2300i ,Princeton Instruments)當中，然后再被光電倍增管(H7422-P50,Hamamatsu)在光子計數模式下(SPC-150，Becker&Hickl GmbH)檢測。PMT需要冷卻以便確保一個低而穩定的暗計數率(〈200光子/秒)。出射光譜的波長測量間距是I納米，每個波長下的出射率強度則是通過將測得的12秒內的出射率進行平均并扣除背景得至IJ。為了比較，三根DCF的長度(約70厘米)和纖芯中的傳輸功率(890納米中心波長，40毫瓦)前后保持一致，并且遠側的DCF端面被直接暴露于空氣中。
[0051]對于離體成像，我們先將小鼠通過二氧化碳窒息安樂死，然后將感興趣的器官解剖出來。切出的肝葉首先用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)沖洗，然后被釘在一塊固定于培養皿中的自制蠟基上。為避免組織脫水和維持微物鏡的水浸環境，PBS被倒入培養皿中直至剛剛浸沒組織。解剖出來的小腸的一段(約I厘米長)被縱向切開、并用PBS輕輕沖洗，直至沒有明顯可見的腸道內容物。然后這一段小腸被展開放置在顯微鏡載玻片上，使得粘膜層(內側)朝上并輕微壓覆一片O號蓋玻片以盡量壓制運動偽影。PBS被擴散到載玻片與蓋玻片之間以在成像過程中保持小腸組織濕潤。
[0052]為了活體成像，小鼠被首先放在引導室中用約5%的異氟醚-氧氣混合氣體充分麻醉;然后小鼠被移到一個溫控的加熱墊(36°C)上，其頭部被放置于相應的嚙齒動物面罩中，從而使其持續吸入約2-3%濃度的異氟醚-氧氣混合氣體以便保持麻醉狀態。對于小腸成像，我們在小鼠的腹部做一個小的切口，并通過該切口辨別出小腸部分(空腸或者回腸)。然后，一段小腸被仔細地拖曳出來，并在不破壞腸系膜血管的前提下固定在自制的支架上。為了成像小腸內部粘膜，我們將一小段小腸(約I厘米長)沿著相對于腸系膜動脈弓的背側切開以盡量減少出血。然后用與離體情況相似的方法，我們把切開的部分進行了清洗和覆以蓋玻片以便于成像。對于腎功能成像，我們首先在小鼠背側做一個約10毫米長的橫向切口以暴露腎臟。一小滴PBS被擴散到微物鏡和腎臟表面之間以維持成像時微物鏡所需的水浸環境。
[0053]這里公開的技術是一種非侵入式的(或至多微創的)、高分辨率的光學成像技術。其中該技術的關鍵組成部分，即內窺顯微鏡，是可彎曲的、有潛力做成一次性的、并且能夠直接到達和成像除了易于接近的器官(如皮膚，口腔等)之外的其他內部器官(如胃腸道等)。該技術能夠可視化組織在細胞和亞細胞水平上的顯微解剖結構，進而在不需要組織切除的情況下實現活體的、原位的、實時的“光學組織學”。
[0054]所述技術的成像原理基于多光子非線性光學成像，即必須同時吸收兩個或更多的光子以激發能發熒光的、或具有特定結構的、或其它類型的可激發分子。傳統的非線性光學成像平臺是臺式顯微鏡。基礎研究已經證明了能提供亞細胞分辨率和實現免標記成像的非線性顯微技術的強大效能。然而，臺式顯微鏡的龐大體積一直是將非線性顯微技術轉化到臨床應用特別是內部器官成像的障礙。
[0055]本文公開的內窺顯微成像術可以實現將上述強大的非線性顯微成像技術向臨床應用的轉化。此外，內窺顯微成像術也可以被用作一種基礎研究工具，相比于臺式顯微鏡，該技術更加靈活并且便宜得多。
[0056]潛在的應用包括:組織病理學檢測:所述的內窺顯微鏡能夠以內窺的方式，在使用或者不使用外來染料的前提下，對活體組織實現原位的、實時的組織學和生理學(如細胞代謝或氧化還原率)評估。這可以免除組織切除、組織學組織制備和處理的需要，從而降低時間和成本。圖像引導的組織活檢:該技術可用于在革G向活檢中識別與疾病如癌癥相關聯的可疑區域。這有助于降低目前臨床實踐中常用的隨機活檢的假陰性率，從而提高診斷率。手術指導:通過實時劃分正常和異常組織的邊界，該技術可以用于外科手術指導。早產風險評估:該技術可以直接呈現宮頸的膠原蛋白纖維網絡及其跟早產有關的異變，從而提供了一種非侵入式的、評估早產風險的方法。美國的早產率大約為12.7%，而且早產是新生兒死亡的首要原因。相關的醫療保健費用約為每年260億美元。該技術還可以幫助開發用于治愈或預防早產的療法。骨關節炎的評估:通過將內窺顯微鏡經由插管遞送到關節空間，該技術可以靠直接可視化膠原蛋白纖維的結構來評估軟骨完整性，也可以用來監測軟骨治療的效果。
[0057]便攜小巧的光纖內窺顯微成像系統也可以用作一種價格合理的基礎研究工具，它比臺式顯微鏡要便宜得多(成本降低了至少100-200倍)。該技術可用于監測細胞或組織的生長，成像神經元的功能(通過將內窺顯微鏡直接安置于活的、甚至清醒的或自由行走的動物的頭上)，以及用于研究傳染病(使內窺顯微鏡直接接觸傳染性樣本，而其他昂貴的設備，如激光和電子，可以留在隔離墻之外)。
[0058]應當指出的是，計算機應用程序被編程到非暫時性的計算機可讀介質上，并可以通過任何在本申請中提及的計算裝置讀取和執行。這里非暫時性計算機可讀介質可以采取本領域技術人員已知的任何一個合適的形式。這里非暫時性計算機可讀介質應被理解為用計算機可讀的任何制品。這樣的非暫時性計算機可讀介質包括，但不限于:磁介質，如軟盤、柔性磁盤、硬盤、雙卷盤式磁帶、卡盒式磁帶、及盒式磁帶或磁卡，光學介質，如⑶_R0M、DVD、藍光DVD、可寫光盤、以及以光盤、磁帶或卡形式存在的磁光媒體，和紙質介質，如穿孔卡或紙帶。還有一種方式是，用于執行本發明的方法和算法的程序可以存在于遠程服務器或其他網絡設備上。與本發明相關聯的任何數據庫可以被存儲在中央計算設備、服務器、云端存儲、或任何其他已知的或所屬領域技術人員可以想到的合適的工具上。與本申請相關的所有信息可以采取有線或無線的方式通過局域網、互聯網、蜂窩式電話網絡、RFID或任何其它已知的或通過所屬領域技術人員可以想到的合適的數據傳輸工具進行傳輸。
[0059]至此，本領域技術人員應認識到，雖然本文已結合優選實施例描述了本發明，但是，在不脫離本發明精神和范圍的情況下，仍可根據本發明公開的內容直接確定或推導出這里未描述的其他增添、刪減、修改或替換。因此，本發明的范圍應被理解和認定為覆蓋了所有這些其他的變型或修改。
【主權項】
1.實現增強信噪比的多光子光學成像的光纖光學裝置，其特征在于，包括: 夕卜殼； 安置在外殼內用于激發光傳輸和出射光收集的單根光波導； 安置在外殼第一端用作致動器的壓電晶體管； 安置在外殼第二端的消色差物鏡。2.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，單根光波導可由一根光纖構成。3.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，單根光波導包括一個或多個單模纖芯和多個包層，其中纖芯被用來傳輸激發光，而至少一個包層(加上一個或多個纖芯)被用來收集從樣品中產生的出射光。4.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，單根光波導可從下組中任選一種構成:純二氧化硅纖芯、鉀摻雜的二氧化硅纖芯和中空纖芯。5.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，其中所述的單根光波導由一根包括至少一個單模纖芯、一個包層、和一層低折射率涂覆層的光纖構成。6.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述物鏡在所關注的波長范圍內表現出低色差或者無色差以提高將出射光耦合回光纖的效率。7.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述消色差物鏡被設定為用于收集在長波長(例如750-1060納米)激發光的聚焦體積內產生的短波長(例如350-600納米)出射光。8.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的消色差物鏡由一個進一步包含了多個具有不同的折射率分布(包括漸變折射率透鏡/玻璃)和/或曲率的元件、以便校正色差和掃描輸入成像光束的場平坦度的微型復合透鏡組成。9.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，所述的消色差物鏡由一個含有用于補償色差和降低縱向焦移的衍射元件/掩模、同時保持了高數值孔徑(因此高分辨率)和微小尺寸的微型復合透鏡構成。10.如權利要求1所述的裝置，其特征在于，還進一步包括一個內置的機構來執行二維和三維光束掃描。11.根據權利要求10所述的裝置，其特征在于，其中內置的二維和三維光束掃描裝置可從下組中任選一種構成:由壓電晶體管(PZT)致動的二維光纖掃描器，一個由微機電器件致動的二維或三維光纖掃描器，一個內置的深度掃描器，和一個由壓縮彈簧和記憶形狀合金線構建的、用來將部分聚焦元件相對于探頭的其余部分平移的機械掃描器。12.根據權利要求10所述的裝置，其特征在于，其中內置的掃描機構應配有相應的驅動和控制電子電路。13.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還包含用作激發光源的短脈沖光源。14.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還步包含用來補償光纖和系統中其他光學器件色散、以取得短脈沖和更好的激發效率的色散管理模塊。15.根據權利要求14所述的裝置，其特征在于，其中色散管理模塊由下組中任選一種構成:一根光子帶隙光纖、一對光柵、一對棱鏡、和一組光柵鏡頭對。16.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還包含用來把出射光從激發光中分離的機制。17.根據權利要求16所述的裝置，其特征在于，其中用來將出射光從激發光中分離的機制可以由一個分色鏡組成。18.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還包括用來探測出射光的光探測器、用來預處理和采集信號、以及用來數字化和存儲數字化信號的電子設備。19.根據權利要求18所述的裝置，其特征在于，其中的光探測器可以由一個光電倍增管構成。20.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還包含控制設備，成像光束掃描器的驅動設備，和用來控制和同步驅動信號與數據采集、以及用來數字化、處理和存儲數據的數據采集、顯不和存儲t旲塊。21.根據權利要求1所述的裝置，其特征在于，還包含用于將光在自由空間和光纖之間耦合的光學器件。
【文檔編號】A61B10/04GK106037831SQ201610389096
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】李興德, 吳聰, 吳一聰, 梁文軒
【申請人】李興德, 吳聰, 吳一聰, 梁文軒