Schiglautone A衍生物的組合物用于制備抗菌藥物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗菌藥物上的用途。本發明公開了一種組合物及其制備方法。藥理學實驗表明，本發明的組合物具有抗菌作用，具有開發抗菌藥物的價值。
【專利說明】
Sch i g I autone A衍生物的組合物用于制備抗菌藥物
技術領域
[0001] 本發明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 致病菌的擴散及其耐藥性的增強嚴重威脅著人類的健康和生命，抗菌藥物已作為 常規用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治 療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、 特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)對皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄 積毒性較強，常常引起肝腎損傷、消化道刺激、頭暈、過敏等，所以尋找作用機理獨特的新型 抗菌藥物成為當今藥物研發的熱點之一。
[0003] 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀細菌。研究顯 示，幽門螺桿菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指腸潰瘍的主要致病原因，并可能與胃癌和胃 粘膜相關性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤發病有關。最近，世界衛生組織將Hp歸為I類致癌 物，它在胃癌發展中起主導作用。目前流行的治療Hp感染的方案是同時服用質子栗抑制劑 (PPI)加兩種抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四環素、甲硝唑等選二種）的三聯療法。影響三聯 療法的最主要因素被認為是Hp對抗菌劑的耐藥性;另一嚴重問題是質子栗抑制劑會誘發消 化不良，大量抗菌劑則導致消化道內菌群的嚴重毀滅。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一 類新藥物成為一個重要和迫切的任務。
[0004] 近年來全球結核病的發病呈增高趨勢，據世界衛生組織(WHO)估計，目前全球受結 核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中 5~10%的感染者成為結核病患者。我國每年出現活動性肺結核病人130萬例，其中傳染性 肺結核約60萬例，其中傳染性肺結核約60萬例，是全球結核病高負擔國家之一。
[0005] 自抗結核藥物相繼問世，使結核病的治療起到劃時代的變化。然而由于結核病患 者的治療管理尚不十分規范，不規則化療，濫用抗結核藥物，使結核病耐藥情況日益嚴重， 且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時耐藥，這給結核病的防治工作造成極大困難。因此 尋找新的抗結核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結核藥物對保護人民身體健康，具有重要 意義。
[0006] 從天然產物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[0007] 本發明涉及的化合物I是一個201 1年發表（Fan-Yu Meng et al .， 2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011) 1502-1505)的化合物，我們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物 III和化合物IV，并用化合物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗菌活性進行了評 價，其具有抗菌活性。
【發明內容】
[0008] 本發明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質量百分數分別為75%和25%。
[0009]
[0010]
[0011] 本發明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0012] 藥效學實驗表明，本發明的組合物具有較好的抗菌作用。本發明的藥學上可接受 的鹽具有同樣的藥效。
[0013] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗人體真菌活性，因此本發 明的組合物有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。
[0014] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗幽門螺旋桿菌活性，說明 對于與幽門螺旋桿菌密切相關的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一 個極具開發潛力的化合物。它可直接用于相應疾病的治療以及相關藥物的制備。
[0015] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抑制大腸桿菌、熒光假單孢 菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌的作用，所以組合物可作為具有抗細菌作用的化 合物，并有望在制備抗細菌藥物中得到應用。
[0016]進一步的，根據初步試驗的結果，本發明用固體培養基稀釋法測定了組合物對卡 介苗、結核分枝桿菌標準株H37Rv株和耐多藥結核分枝桿菌(MDR MTB)三種結核菌的最小抑 菌濃度，實驗結果證實組合物具有很強的抗結核菌和抗耐藥性結核菌活性，可作為治療結 核菌感染疾病的先導化合物，也可用于制備治療結核病藥物。
[0017]以下通過實施例對本發明作進一步詳細的說明，但本發明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0018] 實施例1化合物Schiglautone A的制備
[0019] 化合物Schiglautone A(I)的制備方法參照Fan-Yu Meng等人發表的文獻(Fan-Yu Meng et al.,2011.Schiglautone A,a New Tricyclic Triterpenoid with a Unique 6/ 7/9-Fused Skeleton from the Stems of Schisandra glaucescens.Organic Letters 13(2011 )1502-1505)的方法。
[0020]
1234 實施例2 Schiglautone A的0-溴乙基衍生物（II)的合成 2 將化合物I (502mg，1. OOmmol)溶于15mL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙烷(7.52(^，40.00111111〇1)和61^的50%氫氧化鈉溶液。混合物在35攝氏 度攪拌Shdh之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然后 對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌3次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除溶 劑得到產物粗品。產物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:1. 〇，v/V)，收 集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(508mg，71 % )。 3 ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5l3.40(s,lH),6.10(s,lH),5.63(s,lH),5.53(s,lH), 3.85(d,J = 11.2Hz,4H) ,3.52(d,J=10.8Hz,4H) ,2.96(s,lH) ,2.20(s,lH) ,2.16(s,2H), 2.00(s,lH),1.84(d,J=13.9Hz,4H),1.69(s,lH),1.58(dd,J = 22.2,8.5Hz,4H) ,1.51(s, lH),1.47(s,lH),1.26(dd,J=9.1,4.4Hz,4H),1.21(s,lH),1.08-0.98(m,4H),0.96-0.94 (m,9H),0.94-0.85(m,6H). 4 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S211.46(s),209.14(s),170.06(s),161.12(s),143.51 (s) ,132.01(s) ,127.77(s) ,85.96(s),82.40(s),70.19(s),69.10(s),57.14(s),52.73 (s),51.90(s),45.77(s),40.67(s),38.57(s),38.32(s),35.04(s),33.55(s),33.27(s), 29.85(s),28.98(s),26.71(s),25.50(s),24.05(s),22.31(s),21.06(s),20.56(s),20.00 (s),18.69(s),18.11(s),15.07(s).
[0025] HRMS(ESI)m/z[M-H]_calcd for C34H5iBr2〇6:715.2032；found 715.2027.
[0026]
[0027] 實施例3 Schiglautone A的0-(lH-四氮唑基）乙基衍生物（III)的合成 [0028] 將化合物II(358mg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmo 1)，碘化鉀（84mg，0 · 5mmo 1)和1H-四氮唑（140 lmg，20mmo 1)，混合物加熱回流5h。反應 結束后將反應液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。因 為互變異構作用，在反應條件下會生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑基兩種取代產物。產物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:1，v/v)，收集淡黃色集中洗脫帶，再將 淡黃色洗脫帶濃縮，用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100:0.5，v/v)，依次收集 兩個淡黃色的洗脫帶，濃縮前1個洗脫帶即得到化合物III的淡黃色固體(79.8mg，23%)。
[0029] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5l6.29(s,lH),9.99(s,lH),9.93(s,lH),6.25(s,lH), 5.76(s,lH),5.40(s,lH),4.57(s,1H),4.38(s,1H),4.32(s,1H),4.21(s,1H),3.96(d,J= 11.9Hz,4H) ,3.33(s,lH),2.55(s,lH),2.51(s,2H),2.39(s,lH),l.98(s,3H),1.82-1.76 (m,3H),1.73(s,lH),1.65(d,J=6.5Hz,2H),1.60(s,lH),1.53(s, 1H),1.47-1,37(m,4H), 1.30(s,lH),1.19(s,lH),1.10(t,J=12.5Hz,3H),1.08(t,J=12.5Hz,9H),1.03(s,3H), 0.86(s,3H).
[0030] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)δ211·72(s),209·42(s),170·36(s),161·38(s),145·37 (s),143.80(s),132.29(s),128.04(s),86.25(s),82.68(s),66.14(s),65.60(s),57.33 (s),52.91(s),52.08(s),46.81(s),45.95(s),40.84(s),38.76(s),38.50(s),35.21(s), 33.74(s),30.01(s),29.16(s),26.91(s),25.66(s),24.23(s),22.51(s),21.22(s),20.74 (s),20.20(s),18.85(s),18.29(s),15.27(s).
[0031] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C36H55N8〇6:695.4245;found:695.4248〇
[0032]
[0033] 實施例4 Schiglautone A的0-(苯并咪唑基）乙基衍生物的合成
[0034] 將化合物II(358mg，0.5mmo 1)溶于15mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmol)，鵬化鉀(84mg，0 · 5mmol)和苯并咪唑（1180mg，lOmmol)，混合物加熱回流6h。反應 結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取三次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產物粗品。產物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:1.5，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物IV的棕色固體（169.9mg，43 % )。
[0035] ΧΗ NMR(500MHz,DMS0-d6)5l3.32(s,lH) ,8.38(s,2H) ,7.66(d,J = 25.0Hz,4H), 7.39(s,2H),7.32(s,2H),6.25(s,1H),5.64(d,J=18.7Hz,2H),4.34(s,1H),4.28(s,lH), 4.18(d,J=13.7Hz,2H),4.04(s,2H),3.99(s,2H),3.13(s,1H),2.65(s,2H),2.26(s,1H), 2.17(s,lH) ,2.06(s,lH),l.98(s,3H) ,1.87(d,J= 16.4Hz,2H) ,1.66(dd,J = 8.0,6.6Hz, 4H),1.62(s,lH),1.49(s,lH),1.41(dd J=19.6,10.4Hz,2H),1.37(d,2H),1.20-l.ll(m, 4H) ,1.07(d,J = 20.0Hz,6H),103(d,J = 20.0Hz,3H),1.01(d,J = 20.0Hz,3H) ,0.95(d,J = 20.0Hz,3H).
[0036] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)δ211·30(s),208·98(s),169·90(s),160·96(s),146·28 (s),143.34(s),139.64(s),133.48(s),131.85(s),127.61(s),123.92(s),123.35(s), 118.55(s),110.85(s),85.79(s),82.26(s),67.74(s),67.20(s),57.00(s), 52.56(s), 51.73(s),45.63(s),44.94(s),40.49(s),38.42(s),38.17(s),34.86(s),33.40(s),29.68 (s),28.81(s),26.57(s),25.33(s),23.88(s),22.17(s),20.89(s),20.39(s),19.86(s), 18.52(s),17.87(s),14.93(s).
[0037] HRMS(ESI):m/z[M+H]+calcd for C48H63N4〇6:791.4748;found:791.4744。
[0038]
[0039] 實施例5組合物抗人體真菌活性
[0040] 組合物的制備：將研磨之后過200目網的75mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網的25mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到100mg組合物， 使用時用水溶解這l〇〇mg的組合物即得到組合物的溶液。
[0041]抗人體真菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復三次，測試的病原菌 有紅色毛癬菌、羊毛狀小孢子菌和斷發癬菌，菌液濃度為1〇5個/mL。藥物的起始濃度為 50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMS0)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測試樣品混 合培養在96孔板中（形成的最終濃度有：25·00、12·50、6·25、3·13、1·56、0·78、0·39、0·20、 0.10和0.05yg/mL)，人體真菌培養溫度分別為28°C，培養時間24h后觀察，若發現沒有菌落 形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實驗陽性對照為酮康 唑，組合物抗人體真菌結果見表1。
[0042]表1組合物抗人體真菌MIC值(yg/mL)
[0043]
[0044] 1234 結論:組合物具有很強的抗人體真菌活性，因此本發明的組合物有望被用于制備 新型抗人體真菌藥物。化合物III和化合物IV無抗人體真菌活性，因此不能用于制備新型抗 人體真菌藥物。 2 實施例6組合物抗幽門螺桿菌活性 3
[0047] 1)供試菌株 4 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)標準菌株ATCC 43504購于美國菌種保存 中心(American Type Culture Collectior^ATCC)。]^株Hp臨床菌株采自南京市鼓樓醫院 胃鏡室接受胃鏡檢查的患者;在連續胃鏡檢查中對消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎 的患者，先經快速尿素酶實驗確定為Hp陽性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8%馬 血清、三甲氧節氨啼啶（1：1'；[11161:111'(^;[11，110 3)1.258凡、多粘菌素(。0150115^;[11)1325001]凡、萬古 霉素(vancomycin) 10mg/L的Columbia選擇性瓊脂培養基中，于37°C在微氧環境下（5%〇2， 10%〇)2和85%他)培養72小時。收集細菌，經涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為 陽性后，傳代純培養，所得菌株作為實驗菌株。
[0049] 2)菌株培養
[0050] 我們采用微需氧袋(購自上海醫科大學)進行HP的菌株培養，它可通過化學反應產 生Hp所需要的微需氧環境。
[0051 ] 3)生物活性測定
[0052] 采用紙片法(Microbiological paper method)測定藥物對幽門螺桿菌的抑制作 用，用瓊脂稀釋法來測定供試樣品的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC) 〇
[0053] I.紙片法實驗
[0054] (A)準備培養基將配制好的Columbia培養基經高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60°C， 加8 %馬血清或綿羊血，混勾傾注于已經滅菌的培養皿中，每皿7-10ml，培養基厚度為1.5mm (無菌操作）。
[0055] (B)轉接實驗菌(涂菌)用微量取樣器取稀釋好的108CFU/ml (10D66Q = 108CFU/ml) Hp 的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養皿表面。倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目的 使瓊脂表面干燥，備用。
[0056] (C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μ1待測樣品（質量濃度2mg/ml)注入已經滅菌的 圓濾紙片上。用無菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對照空白紙片，按無菌操作分別紙片緊貼于 含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結果求其平均值。
[0057] (D)培養將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開氣體發生器，再置于37°C培養箱中 培養72h。
[0058] (E)測抑菌圈直徑取出平板后，分別測量各紙片周圍抑菌圈直徑的大小。參照對照 組的結果，可得出待測樣品敏感實驗的結果。重復三次。
[0059] II.瓊脂稀釋法測定MIC
[0060] (A)藥物平板的制備首先將測試的藥物用二甲基亞砜(DMS0)溶液配制成0.5mg/ml 的母液，再用無菌水稀釋，最終配成 100·0,80·0,60·0,45·0,40·0,35·0,30·0,25·0,20·0， 15.0，10.0,5.0和2.5μg/ml的濃度系列，DMS0在介質中的濃度小于1 %。將lml配制好的測試 藥物溶液與保溫于50°C的8ml哥倫比亞培養基，另加 lml保溫于50°C的馬血清充分混勻，澆 制入培養皿中冷卻即成(培養皿中藥物的終濃度為10.0,8.0,6.0,4.5,4.0,3.5,3.0,2.5， 2.0，1.5，1.0,0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，則MIC值即這些值當中的一個）。
[0061 ] (B)轉接實驗菌（涂菌）用微量取樣器吸取稀釋好的lX108CFU/ml Hp的菌懸液 0.1ml均勻地涂抹在培養皿表面，倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥， 備用。
[0062] (C)確定MIC將待測培養皿在微需氧袋(含:85%N2，10%C〇2和5%02)中，保溫37°C 培養72小時，觀察Hp生長情況，與空白組相對照，以完全沒有菌生長的樣品最低濃度為最低 抑菌濃度（minimal inhibitory concentration,MIC)值。陽性對照為氨節西林 (Ampicillin)〇
[0063] 實驗結果
[0064] 體外實驗表明，組合物具有很強的抗幽門螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直 徑為21mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個隨機的臨床菌株和1個標準菌 株(ATCC43504)的生長，最小抑菌濃度(MIC)均為2.5μg/ml。用氨芐西林作陽性對照，其對6 株測試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為1. Oμg/ml。化合物III和化合物IV無抗幽門螺旋桿菌 活性。
[0065] 結論:組合物具有較強的抑制幽門螺旋桿菌活性，說明對于與幽門螺旋桿菌密切 相關的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來講，組合物是一個極具開發潛力的藥物。它 可直接用于相應疾病的治療以及相關藥物的制備。化合物III和化合物IV無抗幽門螺旋桿 菌活性，不可以用于相應疾病的治療以及相關藥物的制備。
[0066]實施例7組合物抗細菌活性
[0067]抗菌活性實驗是采用濃度稀釋的方法，每次測定重復三次，測試病原菌有大腸桿 菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌，菌液濃度為1 〇5個/mL。藥物起始 濃度為50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMS0)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測試 樣品混合培養在96孔板中（形成的最終濃度有:25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、 0.20、0.10和0.05yg/mL)，細菌培養溫度分別為37°C，培養時間24h后觀察，若發現沒有菌落 形成的處理孔中最低的那個濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。組合物抗菌結果見表2。 [0068] 表2組合物抗細菌MIC值(yg/mL)
[0069]
123 結論:組合物具有很強的抗細菌活性，因此本發明的組合物有望被用于制備新型 抗細菌藥物。化合物III和化合物IV無抗細菌活性，不能被用于制備新型抗細菌藥物。 2
[0071 ]實施例7組合物抗結核菌活性 3 (1)固體培養基稀釋法測定組合物抗卡介苗(BCG)絕對濃度
[0073] 從斜面上刮取卡介苗培養物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養基中，加入少 量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。
[0074] 將藥物用DMS0配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至所需 濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養基(該培養基已經 121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C )，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ml， 4.0ug/ml，3 ·0ug/ml，2·0ug/ml，1 · 5ug/ml，1 .Oug/ml，0· 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜面培 養基。
[0075] 將濃度為lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種于含各個藥 物系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置于37°C培養4~8周，觀察實驗結果，結果 如表3所示。
[0076] 本實施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養基和Middlebrook7Hll瓊脂培養基為本 領域技術人員進行結核菌培養時的常用培養基，其配方采用常規配方即可。
[0077] (2)固體培養基稀釋法測定組合物抗結核分枝桿菌標準株H37Rv株絕對濃度 [0078] 從斜面上刮取結核分枝桿菌標準株H37Rv株培養物，加入到3ml Middlebrook7H9 肉湯培養基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏 比池管(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的H37Rv株菌懸液。
[0079] 將藥物分別用DMS0配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養基(該培養基 已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0 · 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜 面培養基。
[0080]將濃度為lmg/ml的H37RV株菌懸液用接種環蘸取數環，分別接種于含藥物系列濃 度的培養基和空白對照培養基斜面上，置于37°C培養4~8周，觀察實驗結果，結果如表3所 不。
[0081 ] (3)固體培養基稀釋法測定藥物抗結核分支桿菌臨床分離耐ISRE MTB株絕對濃度 [0082]從斜面上刮取結核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、 乙胺丁醇結核分枝桿菌臨床分離柱)培養物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養基中，加 入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動研磨，與標準麥氏比濁管 (MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的菌懸液。
[0083] 將藥物分別用DMS0配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養基(該培養基 已經121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.0ug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0· 75ug/ml，0· 5ug/ml等濃度的斜 面培養基。
[0084] 將濃度為lmg/ml的結核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株菌懸液用接種環蘸取數 環，分別接種于含各個藥物系列濃度的培養基和空白對照培養基斜面上，置于37°C培養4~ 8周，觀察實驗結果，結果如表3所示。
[0085] 表3固體培養基稀釋法測定組合物抗結核菌絕對濃度結果
[0086]
[0087]表4固體培養基稀釋法測定化合物III抗結核菌絕對濃度結果
[0088]
[0089] 表3固體培養基稀釋法測定化合物IV抗結核菌絕對濃度結果
[0090]
[0091]結論:組合物具有很強的抗結核菌和抗耐藥性結核菌活性，可作為治療結核菌感 染疾病的先導化合物，也可用于制備治療結核病藥物。化合物III和化合物IV無抗結核菌和 抗耐藥性結核菌活性，不能作為治療結核菌感染疾病的先導化合物，也不能用于制備治療 結核病藥物。
[0092] 實施例8本發明所涉及組合物片劑的制備
[0093] 取2克組合物，加入制備片劑的常規輔料18克，混勻，常規壓片機制成100片。
[0094] 實施例9本發明所涉及組合物膠囊的制備
[0095] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數分別為75%和25%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數分別為75 %和25 %充分混合。3. -種如權利要求1所述的組合物在抗菌藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述菌為細菌。5. 如權利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述菌為真菌。6. 如權利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述菌為幽門螺桿菌。7. 如權利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述菌為結核菌。8. 如權利要求5所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為：所述真菌為紅色毛癬 菌、羊毛狀小孢子菌或者斷發癬菌。9. 如權利要求4所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述細菌為大腸桿菌、 熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌或者新生隱球菌。10. 如權利要求7所述的組合物在抗菌藥物中的應用，其特征為:所述結核菌為卡介苗、 結核分枝桿菌標準株H37Rv株和耐多藥結核分枝桿菌。
【文檔編號】A61K31/4184GK106038555SQ201610420698
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月13日
【發明人】陸賢
【申請人】南京廣康協生物醫藥技術有限公司