以樹突狀細胞相關c型植物凝集素?1為靶點的抗抑郁癥藥物及其篩選方法
【專利摘要】本發明提供一種抗抑郁癥藥物，其特征在于，其藥效成分以樹突狀細胞相關C型植物凝集素?1為靶點，且通過結合、激活和/或上調表達樹突狀細胞相關C型植物凝集素?1起到抗抑郁作用。是一個新的治療性藥物設計靶點，將有望推動以激活Dectin?1受體的成分為基礎的抗抑郁藥物篩選。
【專利說明】
以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點的抗抑郁癥藥物及其篩選方法
技術領域
[0001]本發明屬于制藥技術領域，具體涉以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點的抗抑郁癥藥物及其篩選方法。
【背景技術】
[0002]抑郁癥已成為現代社會的常見病和多發病，其發病率還在不斷升高。病癥以情緒低落、興趣減退、思維遲緩、以及言語與動作減少為特征，重癥抑郁有厭世或自殺的念頭。這類疾病對患者及其家屬造成的痛苦，以及對社會造成的損失，是許多其他疾病所無法比擬的。根據世界衛生組織(WHO)發表的報告，情感障礙目前已成為世界第四大疾患，全球的抑郁癥患者已達3.4億人。目前抑郁癥在中國發病率大約為4% ο中國至少有2600萬人患有抑郁癥，抑郁癥在中國造成的總經濟負擔達到622億元人民幣。美國估計有1700萬人患有抑郁癥，300萬人患躁郁癥，每年治療情感障礙的費用高達440億美元(冠心病為430億美元)。在過去對情感障礙研究的40年中，特別引人注目的是其發病率和死亡率高，據報道自殺率高達10%以上，中國每年有25萬人自殺。
[0003]目前主要使用的藥物是五羥色胺再攝取抑制劑等，使用這類藥物起效慢，作用譜窄，副作用大，停藥后易復發。目前，抗抑郁治療領域急需起效快，副作用小，更為有效，作用靶點明確的治療藥物。
[0004]目前的抗抑郁藥物及其弱點:當前的抗抑郁藥大致可分為三類:即單胺氧化酶抑制劑、三環類抗抑郁劑及雜環類抗抑郁劑。現有的抗抑郁藥物遠遠不能滿足病人的需求，其不足之處大主要集中表現為起效慢、抗抑郁譜窄、副作用大、易復發等。開發起效快、抗抑郁譜廣泛、毒副作用較小、作用靶點明確的新藥，在這個領域是非常迫切的需要，將帶來巨大的經濟回報。
[0005]Dectin-1是一種新的非Toll樣模式識別受體(PRR)。最初研究認為，Dectin-1是樹突狀細胞(DC)表面表達的特異性受體，故將其命名為樹突狀細胞相關C型植物凝集素。但后來發現除樹突狀細胞外，Dectin-1是作為β-葡聚糖的主要受體廣泛分布在小膠質細胞、單核細胞、巨噬細胞、NK細胞及中性粒細胞等，在機體抵御真菌感染中發揮著重要作用。
[0006]Dectin-1屬于Π型跨膜受體，是C型植物凝集素家族的一員，與其家族成員有著相似的結構特點，膜外通過短臂連接糖識別結構域(CRD)，但缺少典型C型植物凝集素樣結構域結合Ca離子的氨基酸殘基，因此Dectin-1結合配體時不依賴Ca離子。Kato等發現人和小鼠Dectin-1的mRNA可選擇性連接并產生不同的亞型，其中人和鼠的Α、Β亞型在結構上有很大的相似性，這些亞基之間不同點之一是N端連接的糖基化序列的數量和位置不同，該序列對Dectin-1識別真菌以及下游NF-kB的活化是非常重要的。
[0007]研究表明Dectin-1可識別的糖類配體是β-葡聚糖。β-葡聚糖占真菌細胞壁成分的50%左右，可誘導吞噬細胞的吞噬功能，介導炎癥介質、細胞因子及趨化因子的分泌、活性氧中間產物的合成，因而長期以來被人們作為抗感染及抗腫瘤藥物。運用特異性拮抗劑和阻斷性單克隆抗體(2ALL)的研究發現，Dectin-1是天然免疫細胞上的主要受體，介導β-葡聚糖生物學功能。Dectin-1通過胞膜上表達的糖識別結構域可結合β-l，3連接或β-l，6連接的葡聚糖，在抗真菌感染中，對白細胞的活化有協同刺激作用。根據目前研究，一些可溶性的葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖是Dectin-1結合β-葡聚糖的最佳拮抗劑，可有效封閉特定細胞Dectin-1的活性。此外，Dectin-1通過Syk依賴的信號傳導途徑誘導免疫效應細胞生成IL-2、IL-4、IL-1O等重要的抗炎癥因子，可以限制炎癥因子的作用并最終使炎癥反應終止，使機體內環境趨于穩定，此外對調節性T細胞的分化也可能發揮重要作用。
[0008]然而截至目前，Dectin-1作為抗抑郁癥藥物的作用靶點，并應用于篩選具有潛在抗抑郁癥功效的藥物的用途尚未見報道。
【發明內容】
[0009]本發明基于上述空白，提供一種以Dectin-1作為抗抑郁癥藥物靶點的藥物篩選方法。
[0010]本發明的技術方案如下:
[0011 ] 一種以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點的抗抑郁癥藥物，其特征在于，其藥效成分通過結合、激活和/或上調表達樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1起到抗抑郁作用，并且所述抗抑郁作用能夠被所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑所減弱或終止。
[0012]所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑選自可溶性葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖組成的組。
[0013]所述藥效成分為β-葡聚糖。
[0014]—種篩選以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點的抗抑郁癥藥物的方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0015]檢測待選物質是否對實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞起抗抑郁作用；
[0016]選出起抗抑郁作用的待選物質，并且通過檢測選出其抗抑郁作用能夠被所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑所減弱或終阻止的候選物質。
[0017]所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑選自可溶性葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖組成的組。
[0018]檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測指待選物質是否使實驗動物的抑郁癥行為減輕或消失;優選采用小鼠懸尾實驗和/或游泳實驗來檢測。
[0019]檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測所述待選物質是否結合和/或激活實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1。
[0020]檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測所述待選物質是否上調表達實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1。
[0021]本發明在研究實踐中發現對實驗小鼠施用Dectin-1受體可識別的配體β-葡聚糖類物質之后，在動物行為絕望抑郁癥模型實驗中動物抑郁癥行為明顯改善(減輕或消失)并且進一步檢測發現實驗動物前額葉Dectin-1表達顯著提高，見圖5和6。而在同時提供De c t i η-1受體可識別的配體β-葡聚糖類物質和De c t i η-1特異性措抗劑昆布多糖的動物實驗中，這種抗抗抑郁作用顯著減弱甚至消失(見圖3和4)。這些實驗數據說明Dectin-1是抗抑郁癥藥物的一種特異性作用靶點。
[0022]基于上述發現，本發明提供一種以Dectin-1為作用靶點的抗抑郁癥藥物及其篩選方法。本發明提供的以Dectin-1為作用靶點的抗抑郁癥藥物可以通過Dectin-1的特異性拮抗劑來驗證其抗抑郁癥作用是否是以Dectin-1為作用靶點，其特異性拮抗劑存在時能減弱或阻斷其抗抑郁作用。
[0023]Dectin-1的特異性拮抗劑目前已知的有可溶性葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖，但本發明不限于此。
[0024]本發明的另一方面，基于上述發現，提供一種篩選以Dectin-1為作用靶點的抗抑郁癥藥物的篩選方法。涉及到檢測待選物質是否起到抗抑郁癥作用，以及檢測這種抗抑郁作用是否能被Dectin-1特異性拮抗劑減弱或阻斷。其中檢測待選物質是否具有抗抑郁作用，可選地，是指檢測待選物質是否使動物的抑郁癥行為減輕或消失。現有技術中有成熟可靠的技術，如小鼠懸尾實驗、開野實驗和/或游泳實驗來檢測。
[0025]或可選地，指檢測所述待選物質是否結合和/或激活實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1。
[0026]或可選地，指檢測所述待選物質是否上調表達實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1 ο現有技術中有成熟的蛋白表達檢測方法，如本發明中采用的免疫印跡方法。但本發明不限于此。
【附圖說明】
[0027]圖1.灰樹花β-葡聚糖結構式；
[0028]圖2.香菇β_葡聚糖結構式；
[0029]圖3.Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖處理2小時后，懸尾實驗結果:
[0030]豎坐標:懸尾實驗小鼠不動時間(秒)；
[0031 ] 橫坐標:從左到右依次為:0.9%生理鹽水+0.9 %生理鹽水組；昆布多糖+0.9 %生理鹽水組；昆布多糖+灰樹花葡聚糖組;0.9 %生理鹽水+灰樹花β_葡聚糖組。
[0032]圖4.Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖處理2小時后，測試懸尾實驗結果:
[0033]豎坐標:懸尾實驗小鼠不動時間(秒)；
[0034]橫坐標:從左到右依次為:0.9%生理鹽水+0.9 %生理鹽水組；昆布多糖+0.9 %生理鹽水組；
[0035]昆布多糖+香菇β-葡聚糖組;0.9%生理鹽水+香菇β_葡聚糖組。
[0036]圖5.灰樹花β-葡聚糖處理5天后上調了前額葉Dectin-1表達:
[0037]豎坐標:Dectin_l蛋白表達(％對照)
[0038]橫坐標:從左到右依次為:0.9%生理鹽水;丙咪嗪；灰樹花β_葡聚糖(5mg/kg);灰樹
[0039]花β-葡聚糖(8mg/kg);灰樹花β_葡聚糖(12.5mg/kg)
[0040]圖6.香菇β-葡聚糖處理5天后上調了前額葉Dectin-1表達:
[0041 ] 豎坐標:Dectin_l蛋白表達(％對照)
[0042]橫坐標:從左到右依次為:0.9%生理鹽水;丙咪嗪；香菇β_葡聚糖(5mg/kg);香菇β-葡聚糖(12.5mg/kg);香燕0_葡聚糖(20mg/kg)具體實施方案
[0043]以下實施例僅用于詳細說明和證明本發明所發現的Dectin-1可作為抗抑郁癥藥物的靶點，不作為對本發明的范圍限制。如無特別說明，以下實施例中進行的實驗均采用的本領域的常規方法，所用試劑和耗材均可商購獲得。
[0044]實施例1
[0045]以Dectin-1激活成分:灰樹花β_葡聚糖和香菇β_葡聚糖，通過激活其受體Dectin-1的抗抑郁樣行為能被Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖所阻斷的實驗過程為例:
[0046]實驗材料與方法
[0047]一、實驗動物詳細信息
[0048]1.動物品種品系:小鼠，CD-1 (ICR)
[0049]2.等級:SPF 級
[0050]3.動物規格:購買初始周齡和體重(6周齡:22-25g)
[0051 ]正式試驗周齡和體重(7周齡:30_37g)
[0052]4.性別:雄性
[0053]5.質量檢測單位:北京維通利華實驗動物技術有限公司
[0054]6.用途:科學研究
[0055]7.出售單位:北京維通利華實驗動物技術有限公司
[0056]8.許可證號:SCXK(京)2012—0001
[0057]二、實驗動物準備
[0058]1.所有動物的飼養、使用和處理都得到了云南大學醫學院倫理委員會的批準。[0059 ]2.每籠4只小鼠飼養，飲水和取食自由。
[0060]3.小鼠飲用蒸餾水(實驗室設備自制)，小鼠食用的飼料來自于昆明醫科大學動物實驗部。
[0061 ]4.每天12小時的Light/dark循環，早上9:00開燈，晚上21:00關燈。
[0062]5.室溫22±1。(:飼養。
[0063]6.每隔兩天給小鼠更換墊料，讓小鼠有一個舒適的居住環境。
[0064]7.小鼠在新的飼養環境中適應一周后開始正式實驗。
[0065]三、灰樹花β-葡聚糖、香菇β-葡聚糖和昆布多糖詳細信息
[0066]1.灰樹花β-葡聚糖:購買于美國麥克健康食品公司
[0067]2.香菇β_葡聚糖:上海撫生實業有限公司
[0068]3.昆布多糖:美國Sigma公司
[0069]四、實驗不同處理組設置如下，每組有12只小鼠:
[0070]1.灰樹花β-葡聚糖
[0071](1)0.9%生理鹽水+0.9%生理鹽水組
[0072](2)昆布多糖+0.9%生理鹽水組
[0073](3)昆布多糖+灰樹花β-葡聚糖組
[0074](4)0.9%生理鹽水+灰樹花β-葡聚糖組
[0075]2.香菇β_葡聚糖
[0076](I )0.9%生理鹽水+0.9%生理鹽水組
[0077](2)昆布多糖+0.9%生理鹽水組
[0078](3)昆布多糖+香菇β-葡聚糖組
[0079](4)0.9%生理鹽水+香菇β-葡聚糖組
[0080]五、行為學實驗和蛋白實驗操作:
[0081 ] 1.小鼠在動物房適應飼養環境一周后開始實驗；
[0082]2.每天都在上午10:00時開始小鼠稱重和注射；
[0083]3.藥物處理I小時或2小時后進行行為學實驗，連續注射5天后，檢測小鼠前額葉中Dectin-1的表達水平。
[0084]4.實驗設計
[0085](I)灰樹花β-葡聚糖
[0086]0.9%生理鹽水+0.9 %生理鹽水組:第一個60分鐘前腹腔注射0.9 %生理鹽水，第二個60分鐘前再次腹腔注射0.9 %生理鹽水。
[0087]昆布多糖+0.9%生理鹽水組:第一個60分鐘前腹腔注射昆布多糖(10mg/kg)，第二個60分鐘前再次腹腔注射0.9 %生理鹽水
[0088]昆布多糖+灰樹花β-葡聚糖組:第一個60分鐘前腹腔注射昆布多糖(10mg/kg)，第二個60分鐘前再次腹腔注射灰樹花β-葡聚糖(12.5mg/kg)。
[0089]0.9%生理鹽水+灰樹花β_葡聚糖組:第一個60分鐘前腹腔注射0.9 %生理鹽水，第二個60分鐘前再次腹腔注射灰樹花β-葡聚糖(12.5mg/kg)。
[0090](2)香菇β-葡聚糖
[0091 ] 0.9%生理鹽水+0.9 %生理鹽水組:第一個60分鐘前腹腔注射0.9 %生理鹽水，第二個60分鐘前再次腹腔注射0.9 %生理鹽水。
[0092]昆布多糖+0.9%生理鹽水組:第一個60分鐘前腹腔注射昆布多糖(10mg/kg)，第二個60分鐘前再次腹腔注射0.9 %生理鹽水
[0093]昆布多糖+香菇β-葡聚糖組:第一個60分鐘前腹腔注射昆布多糖(10mg/kg)，第二個60分鐘前再次腹腔注射香菇β-葡聚糖(20mg/kg)。
[0094]0.9%生理鹽水+香菇β_葡聚糖組:第一個60分鐘前腹腔注射0.9 %生理鹽水，第二個60分鐘前再次腹腔注射香菇β-葡聚糖(20mg/kg)。
[0095]5.懸尾實驗條件:室溫:22 ± 1°C、濕度:55 ± 10 %。
[0096]小鼠懸尾試驗，它是常用的動物行為絕望抑郁癥模型實驗，能較好保證篩選結果的可靠性。小鼠懸尾實驗是小鼠在懸尾狀態下不再掙扎，呈現特有的安靜不動狀態，抗抑郁藥可明顯縮短不動狀態的持續時間。測試時，將小鼠尾部用夾子固定、倒懸。勿使小鼠尾部扭曲折疊。計錄不動時間。不動指標為:“動物除呼吸外所有肢體均不動”。懸尾試驗對各種抗抑郁藥均很敏感，而且避免了游泳試驗中溫度和動物運動功能障礙的干擾，因而在用一些鼠種篩選抗抑郁藥物時，可以有效地驗證和補充強迫游泳實驗的結果。
[0097]6.免疫印跡方法檢測前額葉中Dectin-1表達，過程如下:
[0098](I)在冰上用RIPA裂解液裂解研磨(緊件研磨12次，松件研磨12次)后的小鼠腦前額葉組織長達半小時；
[0099](2)在4°C離心機上12000轉/分鐘離心10分鐘；
[0100](3)通過BCA試劑盒測定蛋白濃度；
[0101](4)蛋白變性后進行電泳和轉膜；
[0102](5)通過Dectin-1抗體孵育后采用化學發光來成像。
[0103]六、實驗結果及分析
[0104](I)灰樹花β-葡聚糖通過激活其受體Dectin-1的抗抑郁行為學實驗結果:Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖能夠阻斷灰樹花葡聚糖的快速抗抑郁效果，如圖3所示。
[0105]灰樹花β-葡聚糖懸尾實驗結果分析:Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖預先處理60分鐘后，再用灰樹花β-葡聚糖處理60分鐘，懸尾實驗結果表明Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖幾乎完全阻斷了灰樹花葡聚糖的快速抗抑郁效果(0.9%生理鹽水:115.20±7.67秒；昆布多糖:108.10±9.37秒；昆布多糖+灰樹花β-葡聚糖:103.50± 13.65秒;灰樹花β-葡聚糖:59.06±9.16秒)(八從^，卩(3，44)=7.479，？〈0.001)。(如圖3所示)
[0106](2)香燕0_葡聚糖通過激活其受體Dectin-1的抗抑郁行為學實驗結果:Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖能夠阻斷香菇葡聚糖的快速抗抑郁效果，如圖4所示。
[0107]香菇β-葡聚糖懸尾實驗結果分析:Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖預先處理60分鐘后，再用香菇β-葡聚糖處理60分鐘，懸尾實驗結果表明Dectin-1受體的特異性拮抗劑昆布多糖幾乎完全阻斷了香菇葡聚糖的快速抗抑郁效果(0.9%生理鹽水:115.20土7.69秒；昆布多糖:108.10 ± 9.37秒；昆布多糖+香菇β_葡聚糖:108.70 ± 11.12秒;香菇β-葡聚糖:64.30±10.42秒)(八從^八，卩(3，44)=4.945，？〈0.01)。(如圖4所示)
[0?08] (3)灰樹花β-葡聚糖處理5天后，前額葉中Dect in-Ι蛋白表達實驗結果:灰樹花β-葡聚糖上調前額葉中Dectin-1表達，如圖5所示。
[0109]灰樹花β-葡聚糖處理5天后，前額葉Dectin-1表達結果分析:灰樹花β_葡聚糖連續處理小鼠5天后，采用免疫印跡方法來檢測前額葉中Dectin-1表達，蛋白結果表明灰樹花β-葡聚糖上調前額葉中Dectin-1表達(灰樹花β-葡聚糖(5mg/kg): 182.40 ± 14.10%，灰樹花葡聚糖(8mg/kg):202.40± 14.65%和灰樹花β_葡聚糖(12.5mg/kg): 171.60± 19.55% )(AN0VA，F(4，35)=8.670，p〈0.001)。(如圖5所示)
[OiM O] (4)香燕0_葡聚糖處理5天后前額葉中Dectin-1蛋白表達實驗結果:香燕0_葡聚糖上調前額葉中Dectin-1表達，如圖6所示。
[O111 ] 香燕0_葡聚糖處理5天后，前額葉中Dectin-1表達結果分析:香燕0_葡聚糖連續處理小鼠5天后，采用免疫印跡方法來檢測前額葉中Dectin-1表達，蛋白結果表明香菇β-葡聚糖上調前額葉中Dectin-1表達(香燕β-葡聚糖(12.5mg/kg): 153.9± 11.95%和香燕β-葡聚糖(2011^/1^):157.4±8.94%)(八從^八，卩(4，35)=5.339，？〈0.01)。(如圖6所示)。
【主權項】
1.一種抗抑郁癥藥物，其特征在于，其藥效成分以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點，且通過結合、激活和/或上調表達樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1起到抗抑郁作用。2.根據權利要求1所述的抗抑郁癥藥物，所述抗抑郁作用能夠被所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑所減弱或終止。3.根據權利要求1所述的抗抑郁癥藥物，其特征在于:所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑選自可溶性葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖組成的組。4.根據權利要求1-3所述的抗抑郁癥藥物，其特征在于，所述藥效成分為葡聚糖。5.根據權利要求4所述的抗抑郁癥藥物，其特征在于，所述藥效成分為灰樹花β-葡聚糖和/或香菇葡聚糖。6.—種篩選以樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1為靶點的抗抑郁癥藥物的方法，其特征在于，包括如下步驟: 檢測待選物質是否對實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞起抗抑郁作用； 選出起抗抑郁作用的待選物質，并且通過檢測選出其抗抑郁作用能夠被所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑所減弱或終阻止的候選物質。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1的拮抗劑選自可溶性葡聚糖、磷酸葡聚糖和昆布多糖組成的組。8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測指待選物質是否使實驗動物的抑郁癥行為減輕或消失;優選采用小鼠懸尾實驗和/或游泳實驗來檢測。9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測所述待選物質是否結合和/或激活實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素-1。10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，檢測待選物質是否起抗抑郁作用指檢測所述待選物質是否上調表達實驗動物或體外小鼠大腦皮層細胞的樹突狀細胞相關C型植物凝集素_1。
【文檔編號】A61K31/715GK106038582SQ201610329215
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】杜靜, 保紅坤, 肖春杰
【申請人】云南大學