Gps2用于制備軟組織腫瘤預后、診斷或防治的藥物的用圖
【專利摘要】本發明屬于生物醫藥領域，涉及GPS2用于制備軟組織腫瘤預后、診斷或防治的藥物的用途。GPS2在脂肪肉瘤等軟組織肉瘤中低表達，抑制該分子可以促進脂肪肉瘤的增殖。GPS2的表達和脂肪肉瘤病人的預后有明顯的相關性，提示可以用于該類病人的臨床病理診斷。GPS2基因能夠在脂肪肉瘤中作為一種腫瘤抑制基因，并且能作為該疾病的一種可能的預后標志物和治療分子。
【專利說明】
GPS2用于制備軟組織腫瘤預后、診斷或防治的藥物的用途
技術領域
[0001]本發明屬于生物醫藥領域，涉及GPS2用于制備軟組織腫瘤預后、診斷或防治的藥 物的用途。
【背景技術】
[0002] 脂肪肉瘤(LPS)是最常見的軟組織肉瘤類型，約占成人肉瘤類型的20%。然而，這 種惡性腫瘤致病的分子機制尚未完全闡明。在過去幾十年中，新的方法，包括基因表達譜、 DNA擴增譜、全基因組測序、miRNA譜和RNA測序等已經成功擴大了對脂肪肉瘤發病機制的理 解。12號染色體ql4_15的擴增是在脂肪肉瘤中研究最多的分子變異，它可以導致接近90% 的高分化/未分化脂肪肉瘤病例里MDM2 (位于12ql 5)和CDK4基因的擴增。這種擴增曾被報道 過能引起細胞凋亡速度減慢和增殖速度加快，該結果可能是由于P53通路和Rb-E2F細胞周 期檢關卡調節異常引起。除了基因擴增，其他機制也曾報道過和脂肪肉瘤的進展有關:包括 酪氨酸激酶受體(RTKs)的過度表達，染色體易位，PI3K/Akt通路調節異常，C/ΕΒΡ-α和PPAR-γ低表達，某些miRNAs和表觀遺傳學的異常所引起。
[0003] G蛋白通路抑制基因2(GPS2)定位于17pl3.1，最初是由于它可在酵母中抑制Ras基 因的激活而被發現。隨后它被證實參與了許多病理和生理過程，包括增殖、凋亡、DNA修復、 腦組織發育和新陳代謝。GPS2基因的調節異常曾被報道和膠質細胞瘤、未分化的梭形細胞 肉瘤(UDS)的腫瘤形成有關，然而GPS2基因在促進腫瘤形成方面的機制仍有許多是未知的。 另外，GPS2基因在最常見的軟組織肉瘤即脂肪肉瘤當中所起的作用。
[0004] 腹膜后脂肪肉瘤確診的金標準是術后病理診斷。術前主要依靠癥狀、體征及輔助 檢查來診斷。影像學檢查是腹膜后脂肪肉瘤診斷的重要方法。B超能夠顯示腫瘤的部位、數 目、大小、呈囊性或實性，且具有無創、價廉的優點，廣泛應用于術前檢查和術后復查。但B超 有時不易判斷周圍臟器是否受侵，定性診斷率較低。B超引導下細針穿刺活檢可以提高定性 診斷準確率，但也增加了腫瘤沿針道播散、種植轉移的風險，不為多數人采用。CT、MRI圖像 分辨率高，能清晰顯示腫瘤及周圍轉移淋巴結或遠隔轉移。經過圖像重建，CT與MRI-樣，可 以顯示冠狀面、額狀面和矢狀面圖像，有助于判斷腫瘤與周圍臟器、血管的毗鄰關系。對懷 疑血管受侵者，磁共振血管造影(MRA)或數字減影血管造影(DSA)均能顯示血管受侵的部 位、范圍。MRA三維血管成像直觀、清晰，創傷小。DSA可以顯示腫瘤血管來源及分布，如同時 進行血管栓塞，有助于減少術中出血，利于腫瘤切除。此外，消化道鋇餐、鋇灌腸、靜脈腎盂 造影等檢查有助于了解消化系統、泌尿系統有無受壓、移位或梗阻，了解雙腎功能，評估切 除單側受累腎臟可能。
[0005] 上述技術和病理學檢查是臨床確診腹膜后脂肪肉瘤的臨床常用技術。但對于病人 治療效果的預后尚無有效手段。利用重要分子標志對病人進行分子檢測可以指導臨床精準 治療和療效預后。
【發明內容】
[0006] 本發明人經過深入的研究和創造性的勞動，驚奇地發現，GPS2基因在脂肪肉瘤中 表達下降并和這種疾病的預后相關，敲除脂肪肉瘤GPS2基因能夠促進細胞增殖和迀移， GPS2基因在脂肪肉瘤中具有腫瘤抑制基因的作用。GPS2基因或GPS2蛋白能夠作為軟組織肉 瘤特別是脂肪肉瘤的預后或診斷的標志物，具有應用于制備軟組織肉瘤特別是脂肪肉瘤的 預后、診斷、治療和/或預防的藥物或者試劑的潛力。由此提供了下述發明：
[0007] 本發明的一個方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預后的藥物中的用途。
[0008] 在本發明的一個實施方案中，所述預后是指預測患者的存活期。
[0009] 在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，
[0010]檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下 組織中的表達量B:
[0011]如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預后較差;和/或 [0012] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則該基因對該對象的預后無顯著意義；
[0013 ] 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。
[0014] 在本發明的一個實施方案中，所述的用途，其中，
[0015] 通過實時定量PCR檢測所述表達量A和表達量B，并按照如下公式計算：
[0016] 表達量 A 或表達量 B = 2-(GPS 鄉aGtinWACT)〇
[0017]本發明利用實時定量PCR、抗體免疫組化等方法證明了GPS2基因在脂肪肉瘤中低 表達(請參見實施例1)。并且與病人的預后有明確的相關性(請參見實施例5)。
[0018] 本發明的再一方面涉及一種判斷軟組織肉瘤患者預后的方法，包括下述步驟：
[0019] 檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下 組織中的表達量B:
[0020] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預后較差;和/或
[0021] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則腫瘤分化程度高，預后較好；
[0022] 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。
[0023] 在本發明的一個實施方案中，所述的方法，其中，
[0024] 通過實時定量PCR檢測所述表達量A和表達量B，并按照如下公式計算：
[0025] 表達量 A 或表達量 B = 2-(GPS 鄉aGtinWACT)〇
[0026]本發明的另一方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。
[0027]本發明中依據本靶點設計的基因檢測引物，抗體等，針對GPS2這一新的診斷和治 療靶點，可能成為腫瘤的診斷試劑。
[0028]在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，
[0029]檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下 組織中的表達量B:
[0030] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽性;和/或
[0031] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性；
[0032] 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。
[0033]在本發明的一個實施方案中，所述的用途，其中，通過實時定量PCR檢測所述表達 量A和表達量B，并按照如下公式計算：
[0034] 表達量 A 或表達量 B = 2-(GPS 鄉actinWACT) 〇
[0035] 本發明的再一方面涉及一種診斷軟組織肉瘤的方法，包括下述步驟：
[0036]檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下 組織中的表達量B:
[0037] 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽性;和/或
[0038] 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性；
[0039] 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。
[0040]在本發明的一個實施方案中，所述的診斷方法，其中，通過實時定量PCR檢測所述 表達量A和表達量B，并按照如下公式計算：
[0041 ]表達量 A 或表達量 B = 2-(GPS 鄉actinWACT) 〇
[0042]本發明的再一方面涉及GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌 肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤）的治療和/或預防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細胞增 殖和/或迀移的藥物中的用途。
[0043]實施例2 - 4的數據表明，降低或者減少GPS2基因的表達能夠促進脂肪肉瘤細胞增 殖和/或迀移，表明GPS2基因是一個抑制脂肪肉瘤侵襲和/或轉移的基因。可以理解，提高或 者增加 GPS基因的表達水平或者GPS蛋白的水平，則能夠抑制脂肪肉瘤細胞增殖和/或迀移， 能夠應用于軟組織肉瘤的治療和/或預防。
[0044]在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2基因的表達 水平的藥物。
[0045]根據本發明上面任一方面所述的用途，其中，所述GPS2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0046] GPS2基因的序列：（984nt):
[0047] ATGCCCGCACTCCTGGAGCGCCCCAAGCTTTCCAACGCCATGGCCAGGGCGCTGCACCGGCACATTATGATGGAGCG GGAGCGCAAGCGGCAGGAGGAAGAAGAGGTGGATAAGATGATGGAACAGAAGATGAAGGAAGAACAGGAGAGAAGGA AGAAAAAGGAGATGGAAGAGAGAATGTCATTAGAGGAGACCAAGGAACAAATTCTGAAGTTGGAGGAGAAGCTTTTG GCTCTACAGGAAGAGAAGCACCAGCTTTTCCTGCAGCTCAAGAAAGTTTTACATGAGGAAGAAAAACGGAGGCGAAA GGAACAGAGTGACCTGACCACCCTAACATCAGCTGCATACCAGCAGAGCCTGACTGTTCACACAGGAACTCATCTCC TCAGCATGCAGGGGAGCCCTGGAGGACACAATCGCCCAGGCACCCTCATGGCAGCTGACAGAGCCAAACAAATGTTT GGACCCCAAGTGCTTACGACCCGGCACTACGTGGGCTCAGCAGCTGCTTTTGCAGGGACACCAGAGCATGGACAATT CCAAGGCAGTCCTGGTGGTGCCTATGGGACTGCTCAGCCCCCACCTCACTATGGGCCCACACAGCCAGCTTATAGTC CTAGTCAGCAGCTCAGAGCTCCTTCGGCATTCCCTGCAGTGCAGTACCTATCTCAGCCACAGCCACAGCCCTATGCT GTGCATGGCCACTTTCAGCCCACTCAGACAGGTTTCCTCCAGCCTGGTGGTGCCCTGTCCTTGCAAAAGCAGATGGA ACATGCTAACCAGCAGACTGGCTTCTCCGACTCATCCTCTCTGCGCCCCATGCACCCCCAGGCTCTGCATCCAGCCC CTGGACTCCTTGCTTCCCCCCAGCTCCCTGTGCAGATGCAGCCAGCAGGAAAGTCGGGCTTTGCAGCTACCAGCCAA CCTGGCCCTCGGCTCCCCTTCATCCAACACAGCCAGAACCCGCGATTCTACCACAAGTGA(SEQ ID NO：I)
[0048] 本發明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預后的藥物中的用途。
[0049] 在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，
[0050] 以對象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達量為參照，判斷該對象的軟組織肉瘤 或疑似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對表達量；
[0051 ]優選地，GPS2蛋白的相對表達量根據免疫組化結果來判讀;優選地，根據FNCLCC (法國聯邦癌癥中心)標準進行分級：代表無陽性細胞；"+"代表1 % - 5 %的腫瘤細胞陽 性；"+"代表+5%-25%的腫瘤細胞陽性；"+++"代表>25%的腫瘤細胞陽性；
[0052] 優選地，結果為"+"者，生存期15 -20個月，優選為17 -18個月（例如17.9個月）；結 果為"++"者，生存期25 - 35個月，優選為30 - 35個月例如32 - 33個月（例如32.5個月）；和/ 或結果為"+++"者，生存期36 - 45個月，優選為40 - 45個月例如42 - 43個月（例如42.2個 月）。優選地，所述生存期為中位生存期。
[0053]本發明的再一方面涉及一種判斷軟組織肉瘤患者預后的方法，包括檢測其GPS2蛋 白相對表達量的步驟。GPS2蛋白相對表達量的檢測檢測或判斷方法如上所述。
[0054] 本發明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。
[0055] 在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，
[0056]以對象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達量為參照，判斷該對象的軟組織肉瘤 或疑似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對表達量；
[0057]優選地，GPS2蛋白的相對表達量根據免疫組化結果來判讀；優選地，根據FNCLCC (法國聯邦癌癥中心）標準進行分級：-無陽性細胞;+1%-5%的腫瘤細胞陽性;++5% - 25%的腫瘤細胞陽性;+++>25 %的腫瘤細胞陽性；
[0058]優選地，結果為"+"者為低表達;結果為"++"者為中表達;和/或結果為"+++"者為 高表達。
[0059]本發明的再一方面涉及一種診斷軟組織肉瘤的方法，包括檢測GPS2蛋白相對表達 量的步驟。GPS2蛋白相對表達量的檢測方法或判讀方法如上所述。
[0060]本發明的再一方面涉及GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤(例如脂肪 肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的治療和/或預防的藥物或者抑制脂肪 肉瘤細胞增殖和/或迀移的藥物中的用途。
[0061 ]在本發明的一些實施方式中，所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2蛋白表達水 平的藥物。
[0062]根據本發明上面任一方面所述的用途，其中，所述GPS2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0063] GPS2蛋白的氨基酸序列：（327aa):
[0064] MPALLERPKLSNAMARALHRHIMMERERKRQEEEEVDKMMEQKMKEEQERRKKKEMEERMSLEETKEQILKLEEKLL ALQEEKHQLFLQLKKVLHEEEKRRRKEQSDLTTLTSAAYQQSLTVHTGTHLLSMQGSPGGHNRPGTLMAADRAKQMF GPQVLTTRHYVGSAAAFAGTPEHGQFQGSPGGAYGTAQPPPHYGPTQPAYSPSQQLRAPSAFPAVQYLSQPQPQPYA VHGHFQPTQTGFLQPGGALSLQKQMEHANQQTGFSDSSSLRPMHPQALHPAPGLLASPQLPVQMQPAGKSGFAATSQ PGPRLPFIQHSQNPRFYHK(SEQ ID N0：2)
[0065] 本發明的再一方面涉及一種藥物組合物I，其包含作為活性成分的GPS2基因、含有 GPS2基因的重組表達載體或含有該重組表達載體的重組宿主細胞，或者包含作為活性成分 的GPS2蛋白或含有GPS2蛋白的融合蛋白；可選地，還包含藥學上可接受的輔料。
[0066] 本發明的再一方面涉及一種治療和/或預防軟組織肉瘤的方法，包括給受試者施 用有效量的GPS2基因、GPS2蛋白或者本發明的藥物組合物1的步驟。
[0067] 本發明的再一方面涉及在體內或體外一種抑制軟組織肉瘤細胞增殖和/或迀移的 方法，包括給細胞施用有效量的GPS2基因、GPS2蛋白或者本發明的藥物組合物1的步驟。
[0068] 在一個實施方案中，治療和/或預防有效量的本發明的藥物組合物以利于藥用的 方式配制和給藥，并需考慮到個體病人的臨床狀況、運送位點、給藥方法、給藥日程安排和 醫生已知的其它因素。因此用于本文目的的"有效量"由這些方面的考慮決定。
[0069] 含治療和/或預防有效量的本發明多肽的藥物組合物非腸道給藥、口服、腦池內給 藥、鞘內給藥等。"藥學可接受輔料"指無毒的固體、半固體或液體填充物、稀釋液、膠囊材料 或任何類型的配方輔助物。給藥方式包括靜脈內、肌肉內、腹膜內、胸骨內、皮下、鞘內和關 節內注射和輸注，還可通過緩釋系統恰當地給藥。
[0070] 發明藥物組合物的給藥劑量取決于許多因素，例如所要預防或治療疾病的性質和 嚴重程度，患者或動物的性別、年齡、體重及個體反應，所用的具體藥物，給藥途徑及給藥次 數等。上述劑量可以單一劑量形式或分成幾個，例如二、三或四個劑量形式給藥。
[0071 ]本文所用的術語"組合物"意指包括包含指定量的各指定成分的產品，以及直接或 間接從指定量的各指定成分的組合產生的任何產品。
[0072] 可改變本發明藥物組合物中各活性成分的實際劑量水平，以便使活性成分的量能 有效針對具體患者、組合物和給藥方式得到所需的治療反應。劑量水平須根據具體藥物組 合物或者活性成分的活性、給藥途徑、所治療病況的嚴重程度以及待治療患者的病況和既 往病史來選定。但是，本領域的做法是，組合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的 水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需的效果。但應認識到，本發明組合物的總日用量須 由主診醫師在可靠的醫學判斷范圍內作出決定。對于任何具體的患者，具體的治療有效劑 量水平須根據多種因素而定，所述因素包括所治療的障礙和該障礙的嚴重程度;所采用的 具體藥物的活性;所采用的具體組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別和飲食;所 采用的具體組合物的給藥時間、給藥途徑和排泄率;治療持續時間；與所采用的具體組合物 組合使用或同時使用的藥物;及醫療領域公知的類似因素。例如，本領域的做法是，藥物組 合物的劑量從低于為得到所需治療效果而要求的水平開始，逐漸增加劑量，直到得到所需 的效果。一般說來，本發明藥物組合物中的活性成分用于哺乳動物特別是人的劑量可以介 于0.001-1000mg/kg體重/天，例如介于0.01-100mg/kg體重/天，例如介于0.01-10mg/kg體 重/天。
[0073] 本發明的再一方面涉及一種藥物組合物2,其包含檢測GPS2基因或者檢測GPS2蛋 白的試劑，可選地，還包含藥學上可接受的輔料;優選地，所述檢測GPS2基因的試劑為能夠 特異擴增GPS2基因的PCR引物;優選地，所述GPS2蛋白的試劑為抗GPS2蛋白的抗體;優選地， 為單克隆抗體;優選地，所述抗體還連接有可檢測的標記，例如放射性同位素、熒光物質、發 光物質、有色物質或酶。
[0074] 在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術 人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的細胞培養、分子遺傳學、核酸化學、免疫學實驗 室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供 相關術語的定義和解釋。
[0075]如本文中所使用的，當提GPS2基因時，包括但不限于其全長(例如SEQ ID NO: 1)。 本領域技術人員能夠理解，在GPS2的核苷酸序列中，可天然產生或人工引入突變或變異(包 括但不限于置換，缺失和/或添加），而不影響其生物學功能。因此，在本發明中，術語"GPS2 基因"應包括所有此類序列。
[0076] 如本文中所使用的，當提GPS2蛋白時，包括但不限于其全長(例如SEQ ID NO: 2)。 本領域技術人員能夠理解，在GPS2的氨基酸序列中，可天然產生或人工引入突變或變異(包 括但不限于置換，缺失和/或添加），而不影響其生物學功能。因此，在本發明中，術語"GPS2 蛋白"應包括所有此類序列。
[0077] 本發明中，術語"預后"是指，根據經驗預測的疾病發展情況即可能的病程和結局， 它既包括判斷疾病的特定后果，也包括提供時間線索。
[0078] 術語"軟組織肉瘤"，包括但不限于，脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或橫 紋肌肉瘤，等。
[0079] 術語"重組表達載體"可以是任何便于進行重組DNA操作并表達核酸序列的載體 (例如質粒或病毒）。載體的選擇通常取決于載體與它將要導入的宿主細胞的相容性。載體 可以是線性或閉環質粒。載體可以是自主復制型載體(即存在于染色體外的完整結構，可獨 立于染色體進行復制），例如質粒、染色體外元件、微小染色體或人工染色體。載體可包含保 證自我復制的任何機制。或者，載體是一個當導入宿主細胞時，將整合到基因組中并與所整 合到的染色體一起復制的載體。此外，可應用單個載體或質粒，或總體包含將導入宿主細胞 基因組的全部DNA的兩個或多個載體或質粒，或轉座子。
[0080] 術語"重組宿主細胞"本發明是指包含可用來重組生產多肽或蛋白的本發明GPS2 核酸序列的重組宿主細胞。可將包含該核酸序列的載體導入宿主細胞，從而使該載體以上 述染色體整合體或自我復制的染色體外載體形式得以維持。術語"宿主細胞"涵蓋任何由于 復制期間發生的突變而與親本細胞不同的后代。宿主細胞可以是原核細胞或者真核細胞， 例如細菌或酵母細胞。可以通過本領域技術人員熟知的技術將載體導入宿主細胞。
[0081] 術語"單克隆抗體"或者"單抗"是指，來自一群高度同源的抗體分子中的一個抗體 或抗體的一個片斷，也即除可能自發出現的自然突變外，一群完全相同的抗體分子。單抗對 抗原上的單一表位具有高特異性。多克隆抗體是相對于單克隆抗體而言的，其通常包含至 少2種或更多種的不同抗體，這些不同的抗體通常識別抗原上的不同表位。單克隆抗體通常 可采用Kohler等首次報道的雜交瘤技術獲得(Nature，256:495，1975)，但也可采用重組DNA 技術獲得(如參見U.S.P4,816,567)。
[0082] 術語"有效量"是指可在受試者中實現治療、預防、減輕和/或緩解本發明所述疾病 或病癥的劑量。
[0083] 術語"疾病和/或病癥"是指所述受試者的一種身體狀態，該身體狀態與本發明所 述疾病和/或病癥有關。
[0084] 術語"受試者"可以指患者或者其它接受本發明藥物組合物以治療、預防、減輕和/ 或緩解本發明所述疾病或病癥的動物，特別是哺乳動物，例如人、狗、猴、牛、馬等。
[0085]發明的有益效果
[0086] 本發明的實驗數據證明，GPS2基因在脂肪肉瘤中低表達，在脂肪肉瘤中是一種腫 瘤抑制基因，并且能作為該疾病的一種可能的預后標志物，同時該基因或其蛋白能夠成為 新的治療藥物。
【附圖說明】
[0087] 圖1:GPS2在脂肪肉瘤病人標本的表達檢測。
[0088] 1A，14例原代標本中，脂肪肉瘤和自身正常皮下脂肪組織中GPS2基因相對表達量；
[0089] 1B，12例原代標本中（取自前面的所述的14例），高分化脂肪肉瘤和未分化脂肪肉 瘤中GPS2基因相對表達量；
[0090] IC 一 IF，原代脂肪肉瘤病理切片行HE染色后結果；
[0091] IG - IJ，原代脂肪肉瘤病理切片行GPS2免疫組化染色后結果;其中，每一列（1C和 1G、ID和1H、IE和11、IF和1J)均為同一病人病理切片染色結果，一共是4例病人的染色結果。
[0092] 圖2 :GPS2基因敲除對脂肪肉瘤細胞增殖的影響。
[0093] 2A，QPCR比較Sh-ctrl和Sh-GPS2對SW872細胞系干涉效率；
[0094] 2B，western blotting檢測Sh-ctrl和Sh_GPS2對SW872細胞系干涉效率；
[0095] 2C，分析Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細胞DYE670增殖指數；
[0096] 2D - 2K，DYE670染色分析Sh-GPS2對SW872細胞增殖的影響;細胞增殖越快，熒光強 度越弱，峰值越往左移；其中，圖2D代表感染對照病毒的細胞標記DYE670染料后的標記效 率，圖2E代表感染對照病毒染色后繼續增殖了 24小時，圖2F代表增殖48小時，圖2G代表增殖 72小時。圖2H代表感染GPS2病毒的細胞標記DYE670染料后的標記效率，圖21代表感染GPS2 病毒染色后繼續增殖了 24小時，圖2J代表增殖48小時，圖2K代表增殖72小時。
[0097] 2L - 2M，BrdU染色析Sh-ctr 1和Sh-GPS2兩組細胞增殖情況；其中，圖2L是Sh-ctr 1 細胞，圖2M是Sh-GPS2細胞。
[0098] 2N，測定Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細胞不同時間點培養基中葡萄糖濃度。
[0099] 圖3:GPS2基因敲除對脂肪肉瘤細胞周期及凋亡的影響。
[0100] 3A，Sh-ctrl 周期圖；
[0101] 3B，Sh-GPS2周期圖；
[0102] 3C，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 周期統計圖；
[0103] 3D，Sh-ctrl 24h凋亡圖；
[0104] 3E，Sh-GPS2 24h凋亡圖；
[0105] 3F，Sh-ctrl 48h凋亡圖；
[0106] 3G，Sh-GPS2 48h凋亡圖；
[0107] 3H，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 凋亡 24h 和 48h 統計圖。
[0108]圖4:GPS2基因敲除對脂肪肉瘤細胞迀移及分化的影響。
[0109] 4A，Sh-ctrl 劃痕 Oh 圖；
[0110] 4B，Sh-GPS2 劃痕 Oh 圖；
[0111] 4C，Sh-ctrl 劃痕 48h 圖；
[0112] 4D，Sh-GPS2 劃痕 48h 圖；
[0113] 4E，劃痕實驗細胞迀移率統計圖；
[0114] 4F，Sh-ctrl 迀移 5h 圖；
[0115] 4G，Sh-GPS2 迀移 5h 圖；
[0116] 4H，Sh-ctrl和Sh-GPS2迀移細胞數統計圖；
[0117] 41，Sh-ctrl 和 Sh-GPS2 脂基因表達圖。
[0118] 圖5:根據病理免疫組化結果分析不同GPS2表達量其預后生存差異。注:坐標點有 重疊，總例數為50例，其中32例陽性，18例陰性(已排除）。
【具體實施方式】
[0119] 下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述。本領域技術人員將會理 解，下面的實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體 技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃 培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社)或者按照產品說明書進行。所用試 劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0120] 實施例1:GPS2在脂肪肉瘤和正常組織中的表達水平研究
[0121]本發明人分別對14例脂肪肉瘤患者手術后腫瘤組織（術后經301醫院病理科確診 為脂肪肉瘤，并明確分化類型)及同一位病人自身的正常皮下脂肪組織的RNA進行了分離。 通過實時定量PCR檢測GPS2mRNA的表達，結果證明腫瘤組織中GPS2基因表達量顯著低于對 照正常組織(P〈〇.05)。本發明人還利用免疫組化的研究方法，分析了 GPS2蛋白在脂肪肉瘤 組織中低表達。
[0122] 具體操作如下：
[0123] 1.實驗材料、試劑和實驗對象
[0124] I.IqRT-PCR
[0125] 實驗材料、試劑：
[0126] 1)研缽，RNase free EP管，Trizol，乙醇，DEPC水，氯仿，異丙醇，逆轉錄試劑盒 (Thermo Scientific，威明頓，美國），.SYBH?Premix Ex Taq?II(Takara，日本），
[0127] 2)7500Fast Real-Time PCR System(ABI公司，美國）
[0128] 1.2HE 染色
[0129] 實驗材料、試劑:蘇木素染液，伊紅染液，1%鹽酸酒精分化液，系列濃度的乙醇、二 甲苯、中性樹膠，培養瓶，培養皿，眼科鑷，蓋玻片，載玻片，顯微鏡。
[0130] 1.3免疫組織化學染色
[0131] 實驗材料、試劑:GPS2鼠單克隆抗體由本實驗室自己制備，枸櫞酸緩沖液，PBS緩沖 液，0.5 %DAB溶液，3 % H2O2溶液，羊血清，辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，系列 濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠，培養瓶，培養皿，眼科鑷，蓋玻片，載玻片，顯微鏡。
[0132] 1.4實驗對象
[0133] 收集2003年1月至2014年12月在中國人民解放軍總醫院院收治50例腹膜后脂肪肉 瘤患者的臨床資料和腫瘤蠟塊，并對患者預后進行隨訪。納入標準：1)全部病理切片均有該 院病理科明確的診斷報告，且術后病理結果為高分化或未分化脂肪肉瘤(50例中有23例未 分化，27例高分化，由HE染色病理結果來判定），2)術前均未行放療或化療，3)有完備的臨床 病理資料及術后隨訪。排除標準：1)未接受手術者，2)圍手術期死亡者，3)失訪者。其中本研 究所用的14例患者的脂肪肉瘤腫瘤組織和對照的正常皮下組織是從在此期間在該院行脂 肪肉瘤切除術中獲得，術后組織-80°C凍存，并有該院病理科明確的診斷報告。
[0134] 2.實驗方法
[0135] 發明人分別對上述14例脂肪肉瘤患者手術后腫瘤組織及正常組織的RNA進行了分 離。通過實時定量PCR檢測GPS2mRNA的表達。利用免疫組化的研究方法，分析了 GPS2蛋白在 脂肪肉瘤組織中低表達。
[0136] 2.1 總 RNA 抽提
[0137] 1)組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol溶液，混勻，室溫放置5min使其充分 裂解；
[0138] 2)加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3-5min；
[0139] 3)4°C下，12000rpm離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的 RNase free EP管；
[0140] 4)沉淀RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次），室溫靜置IOmin;
[0141] 5)4°C 下，12000rpm 離心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；
[0142] 6)加入1ml 75%冰乙醇洗滌，4°C下1000 Orpm離心10min，超凈臺風干；
[0143] 7)加入DEPC水30μ1溶解沉淀。
[0144] 總RNA純度和完整性檢測：
[0145] 1)純度檢測：取ΙμL RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定OD值，0D260/ 0D280的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。
[0146] 2)總RNA完整性檢測：取RNA樣品ΙμL，1 %瓊脂糖凝膠電泳80V X 20min，EB染色 lOmin，用凝膠成像系統觀察并拍照，總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶 完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。
[0147] 2.2逆轉錄
[0148] 1)取Iyg RNA，加入DEPC水配成 11μ1，加入oligo(dT)primerlyl混勻，65°C水浴 5min〇
[0149] 2)加入4μ1 5xbuffer，2yl dNTPC，lyl RI，lyl RT，42°C水浴lh。
[0150] 2.3qPCR 檢測
[0151] 體系配制:20μ1體系
[0152] H2O 7μ1
[0153] SYBR Green PCR Premix ΙΟμΙ
[0154] 上游引物0·8μ1(10μΜ)
[0155] 下游引物0·8μ1(10μΜ)
[0156] ROX2 0.4μ1
[0157] cDNA 模板 ΙμL
[0158] 正式實驗前需進行qPCR測試溶解曲線以檢測引物特異性和擴增效率，每個樣本設 三個副孔，使用7500快速實時PCR系統對目標基因的mRNA表達進行定量，內參為β-actin， PCR引物的由AUGCT生物科技有限公司（北京，中國）設計與合成，引物序列如下。
[0159] β-actin：
[0160] 正義序列5，GACATGCCGCCTGGAGAAAC3，（SEQ ID N0:3)
[0161] 反義序列5'AGCCCAGGATGCCCTTTAGT3'（SEQ ID N0:4)
[0162] GPS2：
[0163] 正義序列5'ACATTATGATGGAGCGGGAG 3'（SEQ ID N0:5)
[0164] 反義序列5'GCTGGTGCTTCTCTTCCTGTAG 3'（SEQ ID NO:6)
[0165] 2.4HE 染色
[0166] 整個染色過程包括五個內容:脫蠟，染色，脫水，透明和封固。
[0167] 1)脫蠟：
[0168] 1 ·組織蠟塊進行連續切片，厚度3μπι;
[0169] 2.將切片在溫箱中烤干后，立即投入二甲苯中脫蠟IOmin;
[0170] 3.移入無水酒精中，約2minx2次；
[0171] 4.移入90%酒精中，約2minx2次；
[0172] 5.移入80%酒精中，約2minx2次；
[0173] 6.移入70%酒精中，約2min;
[0174] 7.移入水中，洗去酒精，約2~3min;
[0175] 8.移入蒸餾水中，約2min。
[0176] 2)染色：
[0177] 1.移入蘇木素中，浸染IOmin，以稍深染為宜；
[0178] 2.移入水中，洗去蘇木素和浮色，約1~2min;
[0179] 3.移入分化液（1 %鹽酸酒精）中，分化幾秒至30秒鐘，使切片褪色至淡藍紅色即 可；
[0180] 4.移入流水中，洗滌30~60min，使組織呈鮮藍色或天藍色；
[0181] 5.移入伊紅液中，浸染2~5min;
[0182] 6.移入水中，洗去伊紅浮液，并用紗布擦凈玻片上的多余染料。
[0183] 3)脫水：
[0184] 1.吸去玻片上的水分后多入80%酒精中脫水約2minx2次；
[0185] 2.移入90%酒精中脫水，約4minx2次；
[0186] 3.移入無水酒精（100 %酒精)徹底脫水，約5minx2次。
[0187] 4)透明
[0188] 1.移入二甲苯I中透明3 - 5min；
[0189] 2.移入二甲苯Π 中透明5 -IOmin;
[0190] 5)封固
[0191] 用樹膠封固，先從二甲苯Π 中取出切片，將組織外圍的二甲苯迅速擦去，在滴上一 滴樹膠于組織片上，然后取干凈的蓋玻片，仔細加在封固劑上，慢慢壓平，使蓋片位置適中。 切片封固后，放在溫箱中烤干后觀察。
[0192] 2.5免疫組化染色
[0193] 取常規石蠟切片(厚度3μπι)后烤片，68°C，20min，
[0194] 1)常規二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水:二甲苯I 20min-二甲苯II 20min-100%酒精I 10min-100% II 10min-95%5min-80%5min-70%5min；
[0195] 2)阻斷滅活內源性過氧化物酶:3%H202 37°C孵育10min，PBS沖洗5min x3次；
[0196] 3)抗原修復:置0 .OlM枸櫞酸緩沖液(PH 6.0)中用煮沸（95°C，15-20min)，自然冷 卻20min以上，再用冷水沖洗片子，加快冷卻至室溫，PBS沖洗5minx3次。
[0197] 4)正常羊血清工作液封閉，37 °C IOmin;
[0198] 5)滴加一抗4°C冰箱孵育過夜，PBS沖洗5minx3次（用I3BS緩沖液代替一抗作陰性對 照）；滴加生物素標記二抗，37°C孵育30min，PBS沖洗5minx3次；
[0199] 6)滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液，37 °C孵育30min，PBS沖洗 5minx3 次；
[0200] 7 )DAB/H202反應染色，自來水充分沖洗后，蘇木素復染，常規脫水，透明，干燥，封 片。
[0201] 3.實驗結果
[0202] GPS2 基因表達量=2-(GPS2 秘 actinlSACT) SP 2-z^ct 〇
[0203] 腫瘤細胞GPS2基因表達量與正常細胞GPS2表達量差別統計值>0.05時，為高表達 量，腫瘤分化程度高，腫瘤細胞GPS2基因表達量與正常細胞GPS2表達量差別統計值〈0.05 時，為低表達量，腫瘤分化程度低。
[0204] 免疫組化染色結果根據FNCLCC(法國聯邦癌癥中心)標準進行分級無陽性細胞； +1 % - 5%的腫瘤細胞陽性;++5% - 25%的腫瘤細胞陽性;+++>25%的腫瘤細胞陽性。 [0205] 患者脂肪肉瘤組織GPS2mRNA的相對表達明顯低于正常組織（圖lAhGPSSmRNA的相 對表達在DDLPS(dedifferentiated Iiposarcoma，是指未分化脂肪肉瘤）中明顯減低（圖 1B)。其中，圖 IB表明GPS2在WDLPS(well differentiated liposarcoma，是指高分化脂肪肉 瘤）中的表達高于未分化脂肪肉瘤，說明GPS2和患者預后相關(分化程度越低患者預后越 差)。
[0206] he染色的圖IC 一 IF確定分化類型。50例中有23例未分化，27例高分化。
[0207] 免疫組化的結果顯示，GPS2蛋白在脂肪肉瘤組織中低表達，分化程度越高表達量 越高(圖1G -1J)。
[0208] 實施例2:降低GPS2基因水平促進脂肪肉瘤細胞的增殖的研究
[0209] 1.實驗材料、試劑和實驗對象
[0210] 1 · IWestern Blotting檢測
[0211] 實驗材料:30%丙烯酰胺，硝酸纖維素膜，轉膜液，TBST，10%脫脂奶粉，一抗和二 抗(TBST稀釋），增強發光檢測試劑盒(ECL，Amersham Pharmacia)，Tanon 5200成像系統 (Tanon有限公司，上海，中國）。
[0212] 1.2DYE670染色
[0213] 實驗材料：Cell Proliferation Dyeeflu〇r?)670(eBioscience，美國），含 10% FBS的DMEM培養基，含5 %FBS的DMEM培養基，胰酶，FACS流式細胞儀(BD，Cal ibur，美國）。
[0214] 1.3BrdU 染色
[0215] BrdU試劑盒(凱基生物技術有限公司，南京，中國），倒置顯微鏡成像(奧林巴斯，漢 堡，德國），含1 〇 % FBS的DMEM培養基。
[0216] 1.4培養基上清葡萄糖的濃度采用葡萄糖氧化酶法測定，委托北京北方生物技術 有限公司進行。
[0217] I. 5實驗對象：
[0218] 轉染了Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細胞。Sh-ctrl代表感染空白病毒的細胞，Sh-GPS2代表感染GPS2干涉病毒的細胞）。
[0219] 本研究中用pSicoR-GFP質粒（購自addgene公司）攜帶有GPS2shRNA序列 GAGGAGACCAAGGAACAAA，通過與慢病毒載體psPAX2和pMD2.G(均購自addgene公司）共轉染至 293T細胞中來包裝慢病毒。流式細胞儀檢測GFP表達，評價慢病毒載體的基因轉染效率。將 SW872細胞以2 X IO5個/孔的密度接種至6孔板中，然后按感染復數(Μ0Ι ) = 10感染慢病毒載 體 48h。
[0220] 2.實驗方法
[0221] 2 · IWestern Blotting實驗方法 [0222] (1)收集蛋白樣品
[0223] 使用適量的蛋白裂解液(RIPA)在冰上裂解貼壁SW872細胞，收集裂解液后采用碧 云天蛋白定量試劑盒進行蛋白定量并用蛋白裂解液配平。
[0224] (2)電泳
[0225] ①根據《分子克隆實驗指南》第三版配制SDS-PAGE凝膠；
[0226] ②樣品處理
[0227] 在收集的蛋白樣品中加入5X SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，100°C水浴加熱3 - 5min， 以充分變性蛋白；
[0228] ③上樣與電泳
[0229] 冷卻到室溫后，在SDS-PAGE膠加樣孔內加入marker蛋白和蛋白樣品。采用Bio-Rad 的標準電泳裝置，低電壓設置在80V，高電壓設置在160V左右，根據預染蛋白質分子量 (GPS2:37KD)預計目的蛋白已經被適當分離后停止電泳。
[0230] (3)轉膜
[0231]選用硝酸纖維素膜，使用Bio-Rad的標準濕式轉膜裝置，設定轉膜電流為400mA，根 據目的蛋白分子量確認轉膜時間，在轉膜過程中，將轉膜槽放置在冰浴中進行轉膜。
[0232] (4)封閉
[0233]轉膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預先準備好的TBST中，漂洗l-2min，以洗去膜上 的轉膜液，注意膜的保濕，避免膜的干燥。加入10%脫脂奶粉，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉 3h〇
[0234] (5) -抗孵育
[0235] 參考一抗的說明書，按照適當比例用10%脫脂奶粉稀釋一抗。
[0236] 室溫在側擺搖床上緩慢搖動孵育2h后加入TBST，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌7min x4次。
[0237] (6)二抗孵育參考二抗的說明書，按照適當比例用TBST稀釋辣根過氧化物酶(HRP) 標記的二抗。室溫在側擺搖床上緩慢搖動孵育Ih。加入TBST，在側擺搖床上緩慢搖動洗滌 7min x4次(每次7分鐘，共洗4次）。
[0238] (7)蛋白檢測
[0239] 利用化學增強發光檢測試劑盒顯影。GAPDH作為內參。顯影儀器為Tanon 5200成像 系統成像。
[0240] 2.2DYE670染色實驗方法：
[0241] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細胞后用I3BS(預熱到室溫）制 成IOxlO 5A). 5ml的細胞懸液；
[0242] 2)499ylPBS加入ΙμL細胞增殖DYE 670染液并與細胞懸液混合，避光37°C孵育 IOmin;
[0243] 3)加4到5倍體積的低溫含10%FBS的DMEM培養基在冰上孵育5min終止標記；
[0244] 4)用含10 %FBS的DMEM培養基洗滌細胞3次；
[0245] 5)用含5 %血清的DMEM重懸細胞，按IxlO5/孔鋪入6孔板，在37 °C，5 %C02培養箱中 培養 0h，48h，72h，96h;
[0246] 6)每天同一時間點用胰酶收集細胞并在2%多聚甲醛中固定，4°C保存，所有樣本 收集完畢后用流式細胞儀收集、分析數據。
[0247] 2.3BrdU 染色
[0248] BrdU測定，細胞接種至6孔板，用含10 %胎牛血清的DMEM培養24h，然后加 ΙΟμΜ BrdlKBrdU試劑盒，南京，中國），7 - 8h后，清洗細胞兩次，然后在工作液中37°C孵育30分鐘。 最后，在4°C下，用200yL含5yL PE-BrdU抗體的染色緩沖液培制成細胞懸液，避光孵育30分 鐘，用1X70倒置顯微鏡成像(Olympus ,Hamburg,Germany)。實驗重復三次并從三個位置上對 至少10個細胞進行分析。
[0249] 3.實驗結果 [0250]結果如圖2所示。
[0251]圖2A-2B為敲低GPS2的效果。
[0252]圖2C為GPS2敲低后促進細胞增殖的結果。
[0253] 圖2D - 2K，DYE670染色分析Sh-GPS2對SW872細胞增殖的影響。圖2L-2M，BrdU染色 析Sh-ctrl和Sh-GPS2兩組細胞增殖情況。
[0254]圖2N，測定Si-Ctrl和Sh-GPS2兩組細胞不同時間點培養基中葡萄糖濃度。結果顯 示，GPS2敲低后，增加培養基糖耗量。
[0255]以上結果表明，利用干涉GPS2基因表達的慢病毒載體轉染細胞，敲低GPS2表達后 細胞增殖能力明顯增強。
[0256] 實施例3:降低GPS2基因后影響脂肪肉瘤細胞的細胞周期和凋亡的研究
[0257] 1.實驗材料、試劑
[0258] 1.1細胞凋亡實驗材料:細胞凋亡試劑盒(三箭生物技術有限公司，天津，中國），含 10 % FBS的DMEM培養基，無血清DMEM培養基。
[0259] 1.2細胞周期實驗材料:細胞周期檢測試劑盒(三箭生物技術有限公司，天津，中 國），PBS，含5 %FBS的PBS，無水乙醇，胰酶，FACS流式細胞儀(BD，Cal ibur，美國）。
[0260] 2.實驗方法
[0261] 2.1細胞凋亡實驗方法：
[0262] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細胞后按3父105個/孔用正常 培養基重懸后鋪入6孔板；
[0263] 2)待細胞貼壁后換成無血清DMEM培養基培養24h和48h;
[0264] 3)用凋亡緩沖液洗滌細胞兩次后用100μΙ凋亡緩沖液重懸細胞；
[0265] 4)加入AnnexinV 5μ1 避光染色 15min然后；
[0266] 5)加入PI避光染色5min;
[0267] 6)補充凋亡緩沖液300μ1，用流式細胞儀對細胞凋亡進行檢測和分析。凋亡細胞為 AnnexinV+/PI_〇
[0268] 2.2細胞周期實驗方法：
[0269] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細胞于EP管中，I X 106個/管； [0270] 2)冰PBS洗滌收集的細胞，1000 rpm離心沉淀細胞，棄上清。
[0271] 3)用300μ1含5%FBS的PBS重懸細胞后加入再700μ1冰無水乙醇吹打均勻，-20°C儲 存過夜。
[0272] 4)離心乙醇固定過的細胞，棄上清，PBS洗滌細胞3次以去除殘留的乙醇。
[0273] 5)加入0.5ml PI/Rnase 37Γ避光染色30min。
[0274] 6)用流式細胞儀檢測和分析細胞周期。
[0275] 3.實驗結果
[0276]結果如圖3A - 3H所示。利用干涉GPS2基因表達的慢病毒載體轉染細胞，敲低GPS2 表達后測定細胞周期，細胞周期Gl期明顯縮短，S期細胞明顯延長，說明了細胞增殖速度快， DNA拷貝數多。另外，結果還表明敲低GPS2表達后對細胞凋亡無明顯影響。
[0277] 實施例4:降低GPS2基因促進脂肪肉瘤細胞的迀移的研究
[0278] 1.實驗材料、試劑
[0279] 實驗材料:8 · Ομπι孔徑Transwell小室(Costar，紐約，美國），含10%FBS的DMEM培養 基，DMEM培養基，胰酶。
[0280] 2.實驗方法
[0281] 2.1細胞迀移能力檢測
[0282] 1)用胰酶消化收集感染Sh-ctrl和Sh-GPS2的SW872細胞，用無血清DMEM培養基重 懸至IX IOfVmL;
[0283] 2)在24孔板中置入Transwell小室，小室下方加入600μ1含10%FBS的DMEM培養基；
[0284] 3)向小室內加入100μΙ細胞懸液，將板置于含5%C02,37°C的培養箱中孵育5h;
[0285] 4)用600μ1 PBS沖洗上室下壁細胞兩次；
[0286] 5)用600μ1 2%多聚甲醛固定20min;
[0287] 6)棉簽擦拭上室上壁未迀徙的細胞，然后用600μ1結晶紫對迀移到上室下壁的細 胞染色IOmin;
[0288] 7)流水沖洗上室內部，洗凈多余的結晶紫燃料，用棉簽將上室上壁擦拭干凈；
[0289] 8)光學顯微鏡下拍照，每個孔隨機選擇6個區域（Χ100)并計數，取平均值和標準 差。用顯微鏡自帶標尺來計算劃痕寬度所占劃痕總寬度比率，作為迀移率。
[0290] 2.2成脂分化檢測
[0291 ] 總RNA抽提
[0292] 1)用胰酶消化細胞，計數，取I * IO6細胞加入1ml Tr i ZO1溶液，混勻，室溫放置5min 使其充分裂解；
[0293] 2)加入200μ1氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機相充分接觸，室溫靜置3 - 5min；
[0294] 3)4°C下，12000rpm離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的 RNase free EP管；
[0295] 4)沉淀RNA:加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻(顛倒6-8次），室溫靜置IOmin;
[0296] 5)4°C 下，12000rpm 離心 15min，收集 RNA 沉淀，去上清；
[0297] 6)加入1ml 75%冰乙醇洗滌，4°C下1000 Orpm離心10min，超凈臺風干；
[0298] 7)加入DEPC水30μ1溶解沉淀。
[0299] 總RNA純度和完整性檢測：
[0300] 1)純度檢測：取ΙμL RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定OD值，0D260/ 0D280的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質污染。
[0301] 2)總RNA完整性檢測：取RNA樣品ΙμL，1 %瓊脂糖凝膠電泳80V X 20min，EB染色 lOmin，用凝膠成像系統觀察并拍照，總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶 完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。
[0302] 逆轉錄
[0303] 1)取Iyg RNA，加入DEPC水配成 11μ1，加入oligo(dT)primerlyl混勻，65°C水浴 5min〇
[0304] 2)加入4μ1 5xbuffer，2yl dNTPC，lyl RI，lyl RT，42°C水浴lh。
[0305] qPCR 檢測
[0306] 體系配制：20μ1體系
[0307] H2O 7μ1
[0308] SYBR Green PCR Premix ΙΟμΙ
[0309] 上游引物0·8μ1(10μΜ)
[0310]下游引物〇·8μ1(10μΜ)
[0311] ROX2 0.4μ1
[0312] cDNA 模板 ΙμL
[0313]正式實驗前需進行qPCR測試溶解曲線以檢測引物特異性和擴增效率，每個樣本設 三個副孔，使用7500快速實時PCR系統對目標基因的mRNA表達進行定量，內參為β-actin， PCR引物的由AUGCT生物科技有限公司（北京，中國）設計與合成，引物序列如下。
[0314] β-actin：
[0315] 正義序列5'GACATGCCGCCTGGAGAAAC3'（SEQ ID N0:3)
[0316] 反義序列5'AGCCCAGGATGCCCTTTAGT3'（SEQ ID N0:4)
[0317] C/ΕΒΡα：
[0318] 正義序列5'GTCCAAACCAACCGCACAT3'（SEQ ID N0:5)
[0319] 反義序列5'GAAACAACCCCGTAGGAACAT3'（SEQ ID N0:6)
[0320] LPL：
[0321] 正義序列5，ACTGCCACTTCAACCACAGC3，（SEQ ID N0:7)
[0322] 反義序列5，AATACTTCGACCAGGCGACC3，（SEQ ID NO: 8)
[0323] Prefl：
[0324] 正義序列5，GCGCGGGACTCCAGCCCTAAGT3，（SEQ ID N0:9)
[0325] 反義序列5，GCGGTGCAGGGGCTGCTCCGGG3，（SEQ ID N0:10)
[0326] PPAR γI：
[0327] 正義序列5'GTTGATTTCTCCAGCATTTCCA3'（SEQ ID Ν0:11)
[0328] 反義序列5'GGCTCTTCGTGAGGTTTGTTG3'（SEQ ID N0:12)
[0329] PPAR γ 2
[0330] 正義序列5，GAACTTAACTGCAGGACCTGCG3，（SEQ ID N0:13)
[0331] 反義序列5，AACTGATGCTGACGAGTGCCT3，（SEQ ID N0:14)。
[0332] 3.實驗結果
[0333] 相同劃痕寬度下，細胞迀移能力越強，劃痕愈合越快。
[0334]結果如圖4A-41所示。結果表明，利用干涉GPS2基因表達的慢病毒載體轉染細胞， 敲低GPS2表達后進行細胞迀移能力檢測，細胞迀移能力明顯增強。還促進脂肪肉瘤細胞成 脂分化，意味著將GPS2敲除后細胞分化能力減弱，側面反映出GPS2表達量越低，細胞分化程 度越低，惡性程度越高。
[0335] 實施例5 :GPS2在脂肪肉瘤中低表達并與病人預后有關
[0336] 1.實驗對象
[0337] 本研究中所用的50例患者的腫瘤組織（脂肪肉瘤）和對照的自身正常皮下組織是 從2003年1月到2014年12月在中國人民解放軍總醫院普外科行脂肪肉瘤切除術術中獲得， 50例患者均得到告知和隨訪，術前均未行放療或化療，患者的臨床資料，包括:年齡、性別、 組織類型。
[0338] 2.實驗方法
[0339] 通過免疫組化方法檢測50例患者的腫瘤組織（脂肪肉瘤)和對照的自身正常皮下 組織中為GPS2蛋白的表達。免疫組化的具體操作步驟參照實施例1。病理切片后在顯微鏡下 計數陽性細胞所占比例。
[0340] 染色評分:-無陽性細胞;+1 % - 5 %的腫瘤細胞陽性;++5 % - 25 %的腫瘤細胞陽 性;+++>25 %的腫瘤細胞陽性。
[0341] 3.實驗結果
[0342] 患者的免疫組織化學染色結果見表1。
[0343] 表1:免疫組織化學染色結果
[0345] 將病人按照GPS2蛋白表達量分為高、中、低三組。免疫組化結果根據病理切片后在 顯微鏡下計數陽性細胞所占比例即可判斷表達強弱，排除18例陰性病人，+為低表達。++為 中表達，+++為高表達。
[0346] 表2:GPS2蛋白表達量、生存時間和生存狀態的實驗數據
[0349] 上面的表2中，生存狀態0代表生存，1代表死亡）。
[0350] GPS2蛋白表達量由免疫組化結果來判定，預后生存期來自對患者的長期隨訪。
[0351] 患者的預后生存曲線列在圖5(priSm5.0制作）。結果發現，不同組別預后與GPS2蛋 白表達呈明顯相關性。圖5顯示，GPS2表達量越高，患者術后生存時間越長，GPS2表達量越 低，患者術后生存時間越短。GPS2蛋白高表達組病例存活期明顯延長。
[0352] 低表達組中位生存期17.93月，中表達組中位生存期32.5月，高表達組中位生存期 42.15月。可看出GPS2表達越高，患者的中位生存期越長，預后越好。
[0353]盡管本發明的【具體實施方式】已經得到詳細的描述，本領域技術人員將會理解。根 據已經公開的所有教導，可以對那些細節進行各種修改和替換，這些改變均在本發明的保 護范圍之內。本發明的全部范圍由所附權利要求及其任何等同物給出。
【主權項】
1. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的預后的藥物中的用途。2. 根據權利要求1所述的用途，其中， 檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下組織 中的表達量B: 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則腫瘤分化程度低，預后較差;和/或 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則該基因對該對象的預后無顯著意義； 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。3. 根據權利要求1所述的用途，其中，通過實時定量PCR檢測所述表達量A和表達量B，并 按照如下公式計算： 表達量 A 或表達量 B = 。 4. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。5. 根據權利要求4所述的用途，其中， 檢測GPS2基因在軟組織肉瘤中的表達量A，以及GPS2基因在對象自身的正常皮下組織 中的表達量B: 如果A〈B并且A和B存在顯著性差異(p〈0.05)，則診斷為陽性;和/或 如果A和B不存在顯著性差異(p>0.05)，則診斷為陰性； 優選地，所述檢測至少重復1次，例如重復1、2、3或4次。6. 根據權利要求1所述的用途，其中，通過實時定量PCR檢測所述表達量A和表達量B，并 按照如下公式計算： 表達量 A 或表達量 B = 。 7. GPS2基因在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、維肉瘤或 橫紋肌肉瘤)的治療和/或預防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細胞增殖和/或迀移的藥物中的用 途。8. 根據權利要求7所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2基因的表達水平的藥物。9. 根據權利要求1至8中任一權利要求所述的用途，其中，所述GPS2基因的核苷酸序列 如SEQ ID ΝΟ:1 所示。 10. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的預后的藥物中的用途。11. 根據權利要求10所述的用途，其中， 以對象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達量為參照，判斷該對象的軟組織肉瘤或疑 似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對表達量； 優選地，GPS2蛋白的相對表達量根據免疫組化結果來判讀;優選地，根據FNCLCC(法國 聯邦癌癥中心)標準進行分級：代表無陽性細胞；"+"代表1% - 5%的腫瘤細胞陽性；"+ +"代表5%-25 %的腫瘤細胞陽性;+++>25 %的腫瘤細胞陽性； 優選地，結果為"+"者，生存期15 -20個月，優選為17 -18個月（例如17.9個月）；結果為 "++"者，生存期25 - 35個月，優選為30 - 35個月或32 - 33個月（例如32.5個月）；和/或結果 為"+++"者，生存期36 -45個月，優選為40 -45個月或42 -43個月（例如42.2個月）；優選地， 所述生存期為中位生存期。 12. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤)的診斷的藥物中的用途。13. 根據權利要求12所述的用途，其中， 以對象自身的正常皮下組織中GPS2蛋白表達量為參照，判斷該對象的軟組織肉瘤或疑 似軟組織肉瘤中GPS2蛋白的相對表達量； 優選地，GPS2蛋白的相對表達量根據免疫組化結果來判讀;優選地，根據FNCLCC(法國 聯邦癌癥中心)標準進行分級：代表無陽性細胞；"+"代表1% - 5%的腫瘤細胞陽性；"+ +"代表5%-25 %的腫瘤細胞陽性;+++>25 %的腫瘤細胞陽性。 14. GPS2蛋白或其融合蛋白在制備用于軟組織肉瘤（例如脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜 肉瘤、維肉瘤或橫紋肌肉瘤）的治療和/或預防的藥物或者抑制脂肪肉瘤細胞增殖和/或迀 移的藥物中的用途。15. 根據權利要求14所述的用途，其中，所述藥物為提高GPS2蛋白表達水平的藥物。16. 根據權利要求10至15中任一權利要求所述的用途，其中，所述GPS2蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示。17. -種藥物組合物，其包含GPS2基因、含有GPS2基因的重組表達載體或含有該重組表 達載體的重組宿主細胞，或者包含GPS2蛋白或含有GPS2蛋白的融合蛋白；可選地，還包含藥 學上可接受的輔料。18. -種藥物組合物，其包含檢測GPS2基因或者檢測GPS2蛋白的試劑，可選地，還包含 藥學上可接受的輔料;優選地，所述檢測GPS2基因的試劑為能夠特異擴增GPS2基因的PCR引 物;優選地，所述GPS2蛋白的試劑為抗GPS2蛋白的抗體;優選地，為單克隆抗體;優選地，所 述抗體還連接有可檢測的標記，例如放射性同位素、熒光物質、發光物質、有色物質或酶。
【文檔編號】A61P35/00GK106075468SQ201610402505
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】王立生, 肖鳳君, 吳祖澤, 楊曉明, 黃曉東, 尹榮華, 王 華, 楊月峰
【申請人】中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所