專利名稱：在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子的制作方法
技術領域：
本發明涉 及一種基因工程技術領域的基因啟動子，具體是一種在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯(Artemisinic Aldehyde Delta-Il (13)Reductase)基因啟動子。
背景技術：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素是從其地上部分分離出的一種含有過氧橋結構的倍半萜內酯化合物，是目前世界上公認的最有效的治療瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，世界衛生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯合療法(ACTs)。另外，隨著對青蒿素藥理研究的逐步深入， 科學家發現青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲、抗腫瘤以及免疫調節的功能，可見青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。目前青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，為0. 01 % -1 %，低含量使得青蒿素的大規模商業化生產受到了限制。由于青蒿素結構復雜，人工合成難度大、產量低、成本高，因此人工生產缺乏可行性。也有人嘗試用組織培養和細胞工程的方法來生產青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中的含量低于干重的0. 1%，在芽中含量最高也只有干重的0. 16%，大多數研究沒有檢測到青蒿素。因此，利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素的也不具備可行性。Dahua Chen等在《Plant Science))(植物科學)2000 年 155 期 179-185 頁發表了題為 “Expression of a chimeric farnesyl diphosphate synthase gene in Artemisia annua L. transgenic plants via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，，(通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因)的論文，文中評述，通過過量表達法尼基焦磷酸合酶 (farnesyl diphosphate synthase,FPS)可在原有基礎上提高青蒿素含量2倍_3倍，達到左右。紫穗槐二烯是從青蒿腺毛特異cDNA文庫中分離出的一個編碼紫穗槐二烯還原酶的基因。隨著青蒿素生物合成途徑的逐漸清晰，采用基因工程手段提高青蒿中青蒿素含量具有非常大的潛力，例如過量表達代謝途徑中的青蒿素合成途徑關鍵酶編碼基因被證實是一種提高青蒿素含量的有效方法。在青蒿基因工程研究中，目前所采用的啟動子大多數是組成性的啟動子，例如煙草花葉病毒35S啟動子(CaMV35)。這種啟動子能夠驅動外源基因在所有的組織和器官中表達，可能會對植物的正常生長造成一定的負擔和危害。由于腺毛不是植物生長所必需的，利用腺毛特異表達的啟動子對植物的腺毛系統進行遺傳操作不會對植物的生長發育造成危害。先前的研究表明紫穗槐二烯基因在青蒿腺毛中大量表達，而在其它組織中表達量很低，這暗示紫穗槐二烯的啟動子很可能是腺毛特異表達的啟動子。 因此，克隆紫穗槐二烯基因的啟動子對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。克隆其啟動子將為研究紫穗槐二烯基因的表達調控、分析啟動子上的順式作用元件奠定基礎。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子。本發明的基因啟動子能引導基因在轉基因植物腺毛中特異表達。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子，該啟動子具有序列表中SEQ IDN0. 1的2422bp的核苷酸序列。所述紫穗槐二烯基因啟動子能引導基因在植物腺毛中特異表達。所述紫穗槐二烯基因啟動子能在利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中應用。所述的在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子，其制備方法如下步驟一，培養青蒿無菌苗；步驟二，采用CTAB法提取青蒿總DNA ；步驟三，Genomic DNAffalking法克隆啟動子基因組序列；步驟四，分析啟動子上的順式作用元件；步驟五，紫穗槐二烯基因啟動子的載體構建；步驟六，根癌農桿菌介導紫穗槐二烯基因啟動子轉化青蒿；步驟七，啟動子所引導的gus報告基因在植株中的表達部位的確定。本發明的有益效果本發明克隆得到的紫穗槐二烯基因啟動子，可以特異性地在腺毛組織啟動并高效表達外源基因，能應用于利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中。本發明涉及的根癌農桿菌EHA105已在《黃亞麗，蔣細良，田云龍，郭萍，朱昌雄；根癌農桿菌介導的哈茨木霉菌遺傳轉化的研究，中國生物工程雜志，2008，觀(3) :38-43》文獻中公開。根癌農桿菌EHA105可通過公開市售的商業渠道取得，如可以從澳大利亞CAMBIA 公司購得，菌株編號為Gambarl。
圖1為5’端啟動子與gus基因融合的植物雙元表達載體示意圖。圖2為根癌農桿菌介導紫穗槐二烯基因啟動子轉化青蒿；圖中A為Kan抗性叢生芽，B為Kan抗性再生青蒿植株，C為可供檢測的植株。圖3為轉基因青蒿植株的PCR檢測結果。圖4為啟動子所引導的gus報告基因在植株中的表達部位的確定；圖中A為沒有進行GUS組織染色得青蒿葉片；B為利用紫穗槐二烯基因啟動子同gus基因融合的載體轉化青蒿后，PCR檢測為陽性的青蒿植株，所獲得的轉基因青蒿中的 ⑶S組織染色；C為非轉基因的青蒿植株的對照組，取其葉片進行⑶S組織染色。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如 Sambrook 等分子克隆實驗室手冊見 New York Co Id Spring Harbor LaboratoryPress的1989年版中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例步驟一，培養青蒿無菌苗青蒿種子用75% (ν/ν)乙醇浸泡lmin，再用20% (w/v)NaClO浸泡20min后，無菌水沖洗3次-4次，用無菌吸水紙吸干表面水分，接種于無激素的MS固體培養基上，250C、 16h/8h (light/dark)光照培養(14天)，即可獲得青蒿無菌苗。步驟二，CTAB法小量抽提青蒿葉片總DNA取約IOOmg 葉片于 1. 5mLEP 管中，加入預熱的 CTAB buffer 600 μ L, buffer 中含2% (ν/ν)的β-巰基乙醇，用研磨棒將葉片研磨至無明顯顆粒；將EP管置于65°C水浴 45min，使細胞充分裂解。待溶液冷卻后，加入等體積(600 μ L) 24 1 (ν/ν)的氯仿異戊醇，混勻，靜置5min，25°C、13000rpm離心IOmin ；吸取上清液約500 μ L于新的干凈的離心管中，加入等體積24 1 (ν/ν)的氯仿異戊醇，混勻，靜置5min，25°C、13000rpm離心IOmin; 吸取上清液約400 μ L于新的干凈的離心管中，加入一滴3Μ醋酸鈉溶液，然后加入等體積預冷的異丙醇混勻，_20°C靜置約30min后，25°C、13000rpm離心IOmin ；棄上清液，用75% (ν/ ν)乙醇沖洗沉淀所得DNA —次，離心后，吸干上清，通風櫥中晾干。將DNA溶解在40μ L水中，-20°C保存。步驟三，Genomic DNA Walking法克隆啟動子基因組序列由于TAIL-PCR只擴增出較小片段，本研究采用Genomic DNA Walking進一步分離紫穗槐二烯基因5，側翼序列。Genomic DNA Walking的方法參照基因組WalkerTM Universal Kit (Clontech，638904)的說明書。具體步驟如下①「基因組酶切采用3種平末端的限制性內切酶DraI、EcoRV和MuI分別對青蒿基因組DNA進行酶切。反應體系如表1:表1限制性內切酶體系
權利要求
1.一種在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子，其特征在于，該啟動子如SEQ ID NO. 1 所示。
2.根據權利要求1所述的在植物腺毛特異表達的紫穗槐二烯基因啟動子，其特征是， 該啟動子能引導基因在植物腺毛中特異表達。
3.一種根據權利要求1所述紫穗槐二烯基因啟動子的應用，其特征在于，該啟動子基因工程育種中應用。
4.根據權利要求3所述的紫穗槐二烯基因啟動子的應用，其特征是，所述的基因工程育種中應用是指利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物。
全文摘要
一種基因工程技術領域的紫穗槐二烯基因啟動子，該啟動子序列具有序列表中SEQ ID NO.1的2422bp的核苷酸序列；該啟動子能引導基因在植物腺毛中特異表達，能在利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種中應用。本發明得到的紫穗槐二烯基因啟動子能引導基因在植物腺毛中特異表達，對利用植物腺毛組織表達和生產代謝產物的基因工程育種具有重要意義。
文檔編號A01H5/00GK102154297SQ201110044609
公開日2011年8月17日 申請日期2011年2月22日 優先權日2011年2月22日
發明者唐克軒, 王玥月, 郭新波, 陳韻斐 申請人:上海交通大學