細胞捕獲系統和使用方法

細胞捕獲系統和使用方法
【專利摘要】一種細胞捕獲系統，包括陣列、入口歧管和出口歧管。陣列包括多個平行的孔，每個孔包括室和孔通道；流體地連接到孔的室的入口通道；流體地連接到孔的孔通道的出口通道。入口歧管被流體地連接到入口通道，且出口通道被流體地連接到出口通道。細胞除去工具也被公開，其中細胞除去工具被配置成從孔室除去捕獲的細胞。
【專利說明】細胞捕獲系統和使用方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求在2011年8月I日提交的美國臨時申請號61/513，785的益處，該美國臨時申請通過該引用以其整體并入。
【技術領域】
[0003]本發明一般涉及細胞分選領域，并且更具體地涉及細胞分選領域內的一種新的并且有用的細胞分選和分析系統。
[0004]背景
[0005]隨著對細胞特異性藥物測試、診斷和其它測定的興趣增加，允許單個細胞隔離、識別和取回的系統在細胞分析領域內變得更加期望。另外，隨著個體化醫療開始，低成本、高保真度細胞分選系統變得非常期望。然而，先前存在的細胞捕獲系統存在各種缺點，這些缺點限制其廣泛用于細胞特異性測試。例如，流式細胞儀要求細胞被同時識別和分選，并將細胞觀察限于單一情況。流式細胞儀不能允許同一細胞的多次分析，并且不允許任意的細胞亞種群分選。常規的微流體裝置依賴用于細胞選擇的細胞特異性抗體，其中被結合到微流體裝置基底的抗體選擇性地結合到表達想要的抗原的細胞。常規的微流體裝置不能允許隨后的細胞除去而沒有細胞損傷，并只捕獲表達特異性抗原的細胞；不表達的細胞也可能是想要的，沒有被這些系統捕獲。蜂窩狀過濾器可以基于尺寸分離樣品組分而沒有明顯的細胞損傷，但遭受堵塞，并且不允許具體的細胞識別、隔離和取回。
[0006]因此，在細胞分選領域需要建立新的和有用的細胞捕獲和分析系統。
[0007]附圖簡要說明
[0008]圖1是細胞捕獲系統的示意圖。
[0009]圖2是細胞捕獲系統的變化形式的透視圖。
[0010]圖3A、3B、3C、3D和3E分別是第一、第二、第三、第四和第五孔變化形式的示意圖。
[0011]圖4是細胞捕獲系統的變化形式的俯視圖。
[0012]圖5是細胞捕獲系統的第二變化形式的俯視圖。
[0013]圖6是細胞捕獲系統的第三變化形式的俯視圖。
[0014]圖7是細胞捕獲系統的第四變化形式的俯視圖。
[0015]圖8是細胞捕獲系統的第五變化形式的俯視圖。
[0016]圖9是包括隔離機構的細胞捕獲系統的變化形式的俯視圖。
[0017]圖10A、10B和IOC分別是引進隔離材料、產生獨特的光掩膜(photomask)和選擇感興趣的細胞的示意圖。
[0018]圖11A、11B、11C和IlD分別是第一、第二、第三和第四光學元件的側視圖。
[0019]圖12是細胞捕獲系統制造的方法的示意圖。
[0020]圖13是細胞捕獲系統制造的第二方法的示意圖。
[0021]圖14A和14B分別是細胞除去工具的第一變化形式的透視圖和側視圖。
[0022] 圖15A和15B是細胞除去工具的第一變化形式的制造方法的示意圖。[0023]圖16A、16B、16C和16D分別是細胞除去的第一變化形式的示意圖，包括感興趣的細胞識別、細胞除去工具校準、細胞除去工具穿過頂層和感興趣的細胞除去。
[0024]圖17A和17B分別是細胞除去的第二變化形式的示意圖，包括感興趣的細胞識別和細胞除去工具校準，且孔容納感興趣的細胞。
[0025]圖18是包括微球的變化形式的孔的俯視圖。
[0026]圖19是細胞捕獲系統使用的變化形式，包括樣品制備。
[0027]圖20是細胞捕獲系統可以與其一起被使用的集成平臺的示意圖。
[0028]圖21是流體歧管的示意圖。
[0029]圖22是樣品工作站的示意圖。
[0030]圖23A、23B和23C是自動對焦的方法的示意圖。
[0031]優選實施方式的描述
[0032]本發明的以下的優選實施方式的描述并不意圖將本發明限于這些優選實施方式，而是使本領域的技術人員能夠制造和使用本發明。
[0033]如圖1和圖2所示，細胞捕獲系統100包括陣列200、入口歧管300和出口歧管400。陣列200包括多個孔220，每個孔220包括流體地連接到孔通道224的室222 ;流體地連接到室222的入口通道240 ;以及流體地連接到孔通道224的出口通道260。入口歧管300優選被流體地耦合到入口通道240，且出口歧管400優選被流體地耦合到出口通道260。細胞捕獲系統100用來將細胞，更優選地單細胞隔離、捕獲和容納在已知的可尋址的位置。一旦細胞被捕獲在通過單細胞捕獲室確定的界定位置，流體網絡可用于同時或相繼地提供和輸送多種試劑以使各種細胞的、亞細胞的或分子的反應能夠在各個單細胞中進行。細胞捕獲系統100還可以允許以單細胞水平對各個捕獲的細胞的光學詢問和探測事件。細胞捕獲系統100可以另外用來選擇性地釋放或促進選擇地除去一個或多個被捕獲的細胞。細胞捕獲系統100可以在相同微流體芯片內或芯片外給予實時細胞跟蹤、活細胞取回和選擇性下游分子測試的益處。細胞捕獲系統100可以用于捕獲循環腫瘤細胞(CTC)，但可以可選地被用于捕獲任何其它可能感興趣的適當的細胞。細胞捕獲系統100優選界定在芯片上，更優選在微流體芯片上，但可以可選地位于任何合適的基底110上或通過任何合適的基底110界定。
[0034]細胞捕獲系統100優選地實現單個細胞捕獲和保留而不需使用抗體涂覆的室222，并且優選地在隔離、捕獲、保留和除去期間維持細胞生活力。細胞捕獲系統100另外優選地使堵塞減到最少。細胞捕獲系統100優選地通過利用合適尺寸的孔220和通過使整體平行的流杠桿化來實現這點，使得靠近樣品入口 320的細胞優選地經歷與遠離樣品入口320的細胞基本上相同的壓力，同時使液體以高速率流過細胞捕獲系統所需的總壓差減到最小。由細胞在陣列的相應末端感受到的壓力變化優選小于入口壓力的50%或75%，但可以可選地更多或更少。樣品流優選基本上為層流，但可以可選地具有任何其它合適的流動特性。樣品流動路徑優選基本上為單向的，但可以可選地為雙向的。細胞分選和活性維持可以另外通過控制通過系統或通過任何其它適合的裝置的樣品流速來實現。
[0035]在操作中，細胞捕獲系統100優選在經過入口歧管300的正壓力下接收樣品。樣品流過細胞捕獲系統100可以另外或可選地通過在出口歧管400處提供負壓來促進。可選地，驅動壓力可以以脈沖-寬度調制方式或正弦曲線方式被循環以提供凈驅動壓力，在入口處凈正壓力或在出口處凈負壓力。樣品優選通過入口歧管300流到入口通道240，通過室222和孔通道224流到出口通道260，并且通過出口歧管400排出細胞捕獲系統100。當樣品流過孔220時，預定大小的細胞優選被捕獲在室222中，其中孔通道224的尺寸優選防止某一細胞尺寸流過其。例如，在配置成捕獲CTC的細胞捕獲系統100的變化形式中，室222被優選按尺寸制造成大于CTC，并且孔通道224被優選按尺寸制造成小于CTC。
[0036]如圖1和2所 示，細胞捕獲系統100的陣列200用來將感興趣的細胞捕獲在可尋址的、已知的位置。陣列200包括多個孔220，每個孔220包括流體地連接到孔通道224的室222 ;流體地連接到室222的入口通道240 ;和流體地連接到孔通道224的出口孔通道260。陣列200優選為基本上線性的，具有基本恒定的寬度，但可以可選地為非線性的和/或具有可變的寬度。陣列200優選包括線性入口通道240、布置成平行于入口通道240的線性出口通道260、以及布置在它們之間垂直于入口 320和出口通道260的多個平行的孔220。然而，陣列200可以可選地為基本上線性的，具有發散或收縮的寬度，其中線性入口 320和出口通道260布置成一定角度，且連續的孔220具有增大或減小的長度。陣列200可以可選地是螺旋形的、左右交互的(boustrophedonic)或具有任何其它適合的幾何形狀。
[0037]細胞捕獲系統100優選包括一個或多個陣列200。更優選，細胞捕獲系統100包括多個平行排列的陣列200，使得第一陣列200的出口通道260優選被定向成平行于鄰近陣列200的入口通道240。多個陣列200優選基本上相同，其中多個陣列200的孔220優選具有相同或相似的室222尺寸和孔通道224尺寸，入口通道240優選具有相似的長度和寬度，且出口通道260優選具有相似的長度和寬度。然而，細胞捕獲系統100中的不同的陣列200可以具有不同的孔220特征、不同的入口通道240特征和/或不同的出口通道260特征。例如，細胞捕獲系統100可以包括多個陣列200，其中第一陣列200具有孔220，第一陣列200的孔220具有捕獲大細胞的大的孔通道224寬度，第二陣列200具有孔220，第二陣列200的孔220具有捕獲中等大小細胞的中等的孔通道224寬度，且第三陣列200具有孔220，第三陣列200的孔220具有捕獲小細胞的小的孔通道224寬度。
[0038]多個陣列200優選通過入口歧管300流體地并聯地耦合。可選地，如圖8所示，多個陣列200可以被流體地串聯地耦合，其中上游陣列200的出口通道260裝進鄰近的下游陣列200的入口通道240。
[0039]陣列200的孔220用來捕獲和保留細胞。更優選地，陣列200的孔220捕獲和保留單個細胞。孔220優選包括配置成容納細胞的室222，和流體地連接到室222的孔通道224。室222優選具有防止細胞由于在入口通道240中的橫流而排出的長度，和防止過度的細胞運動但允許細胞足夠的運動使得細胞不能阻塞孔通道接合處的寬度或深度。鄰近室222的孔通道224的末端優選具有防止感興趣的細胞10通過，而允許較小的樣品組分(如裂解細胞、細胞組分等)流過的寬度。鄰近室222的孔通道224的末端優選小于感興趣的細胞10的直徑，但可以具有任何其它合適的尺寸。
[0040]每個陣列200優選包括多個孔220。例如，陣列200可以包括100、1000、10，000、1，000, 000，或任何合適數量的孔220。孔220優選在陣列200中流體地并聯地耦合，但可以可選地在陣列200中流體地串聯地耦合。孔220優選被并聯地布置在陣列200中，其中鄰近孔220的縱軸優選地是平行的。然而，孔220在陣列200內可以與鄰近的孔220被布置成一定角度。給定的陣列200的孔220優選基本上相似或相同，具有基本上相同尺寸的室222和基本上相同尺寸的孔通道224。然而，單個陣列200可以具有如下的孔220:具有基本上不同尺寸的室222和孔通道224，具有不同的室222長度、室222寬度、室222深度、孔通道224長度、孔通道224寬度、孔通道224深度、每孔220孔通道224的數量、每孔220室222的數量，或者可以具有根據任何其他合適的參數變化的孔220。例如，陣列200可以具有串聯地布置的多個孔220，其中連續的孔220具有減小的孔通道寬度。
[0041]孔220的室222用來保留細胞。室222優選被流體地連接到入口通道240和孔通道224。室222優選具有配置成保留隔離的細胞的長度和寬度，其中室222被按尺寸制造成防止細胞由于入口通道橫流而從室222排出。在一個變化形式中，這通過控制室222的寬高比實現。室222的寬高比優選為1，但可以可選地是1.25、0.5，或任何其它合適的比率。室222優選被配置成保留單個細胞并且防止多個細胞滯留。在一個變化形式中，室222被按尺寸制造成使得室222的高度/寬度防止第二細胞下降到鄰近孔通道224的室222的末端(如，室222的底部)，且室222的長度防止單個細胞從室222排出(如，室222的長度比細胞直徑長)，但促進第二細胞從室222排出(如，室222的長度比細胞直徑長，但比兩個細胞直徑短)。然而，室222可以被配置成保留多個細胞。室222優選具有在5-200微米之間的長度、寬度和深度，但可以可選地具有任何合適的尺寸。在一個變化形式中，室具有50微米的長度、50微米的寬度和50微米的高度。在另一個變化形式中，室具有25微米的長度，25微米的寬度和30微米的高度。室222優選具有基本上恒定的橫截面，但可以可選地具有逐漸減小的橫截面，優選從入口通道240到孔通道224逐漸減小。可變的橫截面可以為平行于基底的寬面112的橫截面和/或垂直于室222的縱軸的橫截面。在一個變化形式中，如圖3B所示，室222具有矩形橫截面，其中孔通道224連接到室222的與連接到入口通道240相反的側面。在另一個變化形式中，室222具有拋物線橫截面，如圖3A和圖3C所示，其中孔通道224連接到拋物線輪廓的頂點。在另一個變化形式中，如圖3D所示，室橫截面從入口通道240到孔通道224線性地減小。在另一個變化形式中，如圖3E所示，室橫截面從入口通道240到孔通道22 4逐步減小。在這個變化形式中，室222界定多個子室，其中多個子室優選被流體地串聯地連接，其中第一子室被流體地連接到入口通道240，且最后的子室被流體地連接到孔通道224。第一子室優選具有最大的寬度和/或深度，且最后的子室優選具有最小的寬度和/或深度。在入口通道240和室222之間的過渡優選展示凸角(如，90度角)，但可以可選地是彎曲的，如圖3C所示的。在室222和孔通道224之間的過渡還優選展示凸角(如，90度角)，但可以可選地是彎曲的。
[0042]孔220的孔通道224用來濾出感興趣的細胞10并且用來允許較小的樣品組分流過。孔通道224優選被流體地連接到室222和出口通道260。更優選地，孔通道224被流體地連接到遠離入口通道240的室222的部分。孔通道224優選基本上是直的和線性的，但可以可選地為彎曲的。孔通道224優選具有比感興趣的細胞10的直徑小的寬度，使得孔通道224防止細胞從其通過。孔通道224優選具有在1-25微米之間的寬度和深度以及在5-500微米之間的長度，但可以具有任何其它合適的寬度、深度和長度。在一個變化形式中，孔通道224具有7-10微米的寬度、7-10微米的深度、和5_50微米的長度。孔通道224優選具有基本上恒定的橫截面，但可以可選地具有逐漸變小或可變的橫截面。孔通道224優選與其縱軸對齊，其縱軸平行于室222的縱軸。更優選地，孔通道224與室222同軸。然而，孔通道224可以與室222成一定角度被對齊。每個孔220優選包括單個孔通道224，但可以可選地包括多個孔通道224，其中多個孔通道224優選從鄰近出口通道260的相應室222的末端平行延伸。
[0043]陣列200的入口通道240用來接收一定體積的樣品并用來將樣品分配到孔220。入口通道240優選將入口歧管300流體地連接到陣列200的室222。入口通道240優選包括第一端、第二端和連接第一端和第二端的通道。入口通道240優選在第一端被流體地連接到入口歧管300，沿著入口通道240長度被流體地連接到陣列200的室222，并且優選在第二端被流體地密封。第二端可以被基底110密封或可以被密封劑例如自動密封層壓制品(self-sealing laminate)(例如，由橡膠、聚乙烯等制成)密封。然而,入口通道240可以包括布置在第一端和/或第二端中的第一閥和/或第二閥，其中閥可以在打開和關閉狀態之間操作。入口通道240的主體優選由基底110界定，但可以可選地由基底110部分地界定，其中另外的部分可以由自動密封層壓制品或任何其它合適的密封劑界定。入口通道240優選被布置成使得入口通道的縱軸垂直于室222的縱軸，但可以可選地以一定角度被布置。室222優選從入口通道240的單一側面延伸，但可以可選地從多個側面(如相對的側面)延伸。入口通道240優選基本上是直的，但可以可選地是彎曲的或彎的。入口通道240優選具有基本上恒定的橫截面，但可以可選地具有可變的橫截面。橫截面可以為平行于入口通道縱軸或垂直于入口通道縱軸的橫截面。在一個變化形式中，入口通道240隨著遠離入口歧管300的距離逐漸變小。入口通道240優選具有比感興趣的細胞10的直徑大的深度和寬度。入口通道240優選具有在5-200微米之間的深度和/或寬度，但可以可選地具有任何合適的深度和/或寬度。在一個變化形式中，入口通道具有50-100微米的寬度，和50-100微米的深度。入口通道240優選具有可以容納陣列200的所有孔220的長度。在一個變化形式中，入口通道240優選具有比室222的組合寬度長的長度。在另一個變化形式中，入口通道240延伸到基底110的邊緣。每個陣列200優選包括一個入口通道240，但可以可選地包括多個入口通道240。例如，陣列200可以包括通向從中心出口通道260的任一側面延伸的兩組孔220的兩個入口通道240，其中每個入口通道240通向一組孔220。然而，陣列200可以包括入口通道240的任何合適的構型。
[0044]陣列200的出口通道260用來接收一定體積的樣品并用來將樣品分配到孔220。出口通道260優選包括第一端、第二端、和連接第一端與第二端的通道。出口通道260優選在第二端流體地連接到出口歧管400，沿著出口通道260長度流體地連接到陣列200的室222，并優選在第一端被流體地密封。出口通道260的第一端可以被基底110密封或可以被密封劑例如自動密封層壓制品(如，由橡膠、聚乙烯等制成)密封。可選地，出口通道260可以包括布置在第一端和/或第二端中的第一閥和/或第二閥，其中閥可以在打開和關閉狀態之間操作。出口通道260的主體優選由基底110界定，但可以可選地由基底110部分地界定，其中另外的部分可以由自動密封層壓制品或任何其它合適的密封劑界定。出口通道260優選被布置成使得成出口通道縱軸垂直于室222的縱軸,但可以可選地以一定角度被布置。室222優選從出口通道260的單一側面延伸，但可以可選地從多個側面(如相對的側面)延伸。出口通道260 優選基本上是直的，但可以可選地是彎曲的或彎的。出口通道260優選具有基本上恒定的橫截面，但可以可選地具有可變的橫截面。出口通道260的橫截面可以為平行于出口通道縱軸或垂直于出口通道縱軸的橫截面。在一個變化形式中，出口通道260隨著遠離出口歧管400的距離逐漸變小。出口通道260優選具有與入口通道240的深度和寬度相似的深度和寬度，但可以可選地具有比入口通道240的深度和寬度小或大的深度和寬度。出口通道260優選具有在5-200微米之間的深度和/或寬度，但可以可選地具有任何合適的深度和/或寬度。在一個變化形式中，出口通道具有50-100微米之間的寬度，和50-100微米之間的深度。出口通道260優選具有可以容納陣列200的所有孔220的長度。在一個變化形式中，出口通道260優選具有比室222的組合寬度長的長度。在另一個變化形式中，出口通道260延伸到基底110的邊緣。每個陣列200優選包括一個出口通道260，但可以可選地包括多個出口通道260。例如，陣列200可以包括從中心入口通道240的任一側面延伸的兩組孔220通出的兩個出口通道260，其中每個出口通道260從一組孔220通出。
[0045]細胞捕獲系統100的入口歧管300用來接收樣品并用來將樣品分配到陣列200。更優選地，入口歧管300將樣品分配到陣列200的入口通道240。入口歧管300優選地另外包括入口 320，其中入口歧管300從入口 320接收樣品。入口歧管300優選提供從入口 320到入口通道240的基本上線性的流動路徑，同時基本上使系統內不同的陣列200經歷的壓力差最小。入口歧管300優選被界定在與陣列200相同的基底寬面中，但可以可選地通過部分或全部的基底厚度來界定。整個入口歧管300，除了入口 320，優選由頂層120流體地密封。
[0046]在一個變化形式中，如圖4所示，細胞捕獲系統100包括多個入口歧管300，一個入口歧管300用于每個入口通道240。在這種變化形式中，多個入口歧管300可以接收單個樣品或多個樣品。
[0047]在另一個變化形式中，如圖5、6和7所示，系統包括通向所有入口通道240的單個入口歧管300。入口歧管300優選并聯地流體地連接陣列200以促進并流遍及細胞捕獲系統100。然而，入口歧管300可以可選地串聯地或以串流和并流的任何合適的組合流體地連接陣列200。入口歧管300優選包括一層或多層入口子歧管302。每個入口子歧管302優選包括主通道204和多個支流通道(feeder channeI )206，其中支流通道206促進樣品流入隨后的子歧管或陣列200的入口通道240。直接地流體地連接到入口通道240的支流通道206優選與入口通道240對齊并且是共同擴張的，但可以可選地垂直于入口通道240或以任何合適的構型布置。主通道204優選并聯地流體地連接支流通道206。支流通道206優選被布置成平行于其它支流通道206，并優選全部從主通道204的一側垂直地延伸。然而，支流通道206可以被布置成相對于主通道204成銳角，從主通道204的相對側延伸，或者以其他方式被合適地布置。直接地流體地連接到入口通道240的子歧管優選各自耦合到陣列200的子集以最小化鄰近子歧管入口的陣列200和遠離子歧管入口 320的陣列200之間的壓力差。然而，單個子歧管可以直接通向細胞捕獲系統100的所有陣列200。
[0048]在一個變化形式中，細胞捕獲系統100包括具有一個入口子歧管層的入口歧管300，其中入口子歧管302包括多個支流通道206，每個支流通道獨立地流體地連接到陣列200的入口通道240。
[0049]在另一個變化形式中，細胞捕獲系統100包括包含兩層入口子歧管302的入口歧管300 (如圖5所示)，其中第一層的支流通道206被流體地連接到第二層的主通道204，且第二層的支流通道206被流體地連接到入口通道240。第一層優選包括一個具有一個主通道204和多個支流通道206的入口子歧管302。第二層優選包括多個入口子歧管302，其中每個第二層入口子歧管302被流體地連接到第一層支流通道和細胞捕獲系統100的陣列200的子集。例如，第二層入口子歧管302可以被流體地連接到細胞捕獲系統100的四十個陣列200的四個入口通道240，其中第二層入口子歧管302包括一個主通道204和四個支流通道206，每個支流通道獨立地流體地連接到入口通道240。在這種變化形式中，第一層主通道204優選具有比第二層主通道204大的寬度和/或高度，且第一層支流通道206優選具有比第二層支流通道206大的寬度和/或高度。第二層支流通道206優選具有與入口通道240基本上相同的寬度和/或高度，但可以可選地具有與入口通道240不同的尺寸。在另一個變化形式中，入口歧管300包括三層分支入口子歧管302。然而，入口歧管300可以包括任何合適數量的入口子歧管層。
[0050]入口歧管300的入口 320用來提供在細胞捕獲系統100的外部和內部之間的流體連接。更優選地，入口 320提供在細胞捕獲系統100的外部和入口歧管300之間的流體連接。細胞捕獲系統100優選包括一個入口 320，但可以可選地包括多個入口 320。每個入口320優選通過流體連接(例如，通道)流體地連接到一個入口歧管300，但可以可選地被連接到多個入口歧管300。每個入口歧管300優選被流體地連接到一個入口 320，但可以可選地被連接到多個入口 320。入口 320的縱軸優選垂直于入口歧管300的主通道204的縱軸，但可以可選地平行于入口歧管300的主通道204的縱軸。入口 320的縱軸優選垂直于基底的寬面112，但可以可選地平行于基底的寬面112，與基底的寬面112成一定角度，或以任何適當的方式被布置。在細胞捕獲系統100的一個變化形式中，入口 320是穿過基底厚度的一部分，從基底的寬面112延伸到界定入口歧管300的平面的洞或孔口。入口 320從其延伸的基底的寬面112可以是入口歧管300被界定在其上的寬面，其中連接入口 320和入口歧管300的流體連接也被界定在相同的寬面上，或者可以是入口歧管被界定114在其上的相對的寬面，其中入口 320基本上延伸穿過整個基底厚度以連接入口歧管300。在細胞捕獲系統100的另一個變化形式中，入口 320是通過基底110的側面的洞或孔口，其中入口 320與基底的寬面112平行地朝向入口歧管300延伸。在這種變化形式中，垂直于基底的寬面112的流體連接優選連接入口 320和入口歧管300。然而，可以使用任何合適的入口 320的構型。
[0051]細胞捕獲系統100的出口歧管400用來接收濾過的樣品以及用來從細胞捕獲系統100排出濾過的樣品。更優選地，出口歧管400從陣列200的出口通道260接收濾過的樣品。出口歧管400優選另外包括出口 420，其中出口歧管400從出口 420排出濾過的樣品。出口歧管400優選提供從出口通道260到出口 420的基本上線性的流動路徑，但可以可選地提供曲折的流動路徑。出口歧管400優選被界定在與陣列200相同的基底寬面中，但可以可選地通過部分或全部的基底厚度界定在基底的相對的寬面112上或界定在基底110的任何合適的部分上。整個出口歧管400，除了出口 420，優選由頂層120流體地密封。
[0052]在一個變化形式中，如圖4所示，細胞捕獲系統100包括多個出口歧管400，一個出口歧管400用于每個出口通道260。在這種變化形式中，多個出口歧管400可以接收單個濾過的樣品或多個濾過的樣品。
[0053] 單個出口歧管400。出口歧管400優選并聯地流體地連接陣列200，但可以可選地串聯地或以串流和并流的任何合適的組合流體地連接陣列200。出口歧管400優選包括一層或多層出口子歧管402。每個出口子歧管402優選包括主通道204和多個支流通道206，其中支流通道206促進濾過的樣品從上游子歧管或陣列200的出口通道260流到主通道204。直接地流體地連接到出口通道260的支流通道206優選與出口通道260平行并且是共同擴張的，但可以可選地垂直于出口通道260或以任何合適的構型布置。主通道204優選并聯地流體地連接支流通道206。支流通道206優選被布置成平行于其它支流通道206，并優選全部從主通道204的一側垂直地延伸。然而，支流通道206可以被布置成相對于主通道204成銳角，從主通道204的相對側延伸，或以其他方式被合適地布置。直接地流體地連接到出口通道260的出口子歧管402優選各自耦合到陣列200的子集。然而，單個出口子歧管402可以直接地從細胞捕獲系統100的所有陣列200接收濾過的樣品。
[0054]在一個變化形式中，細胞捕獲系統100包括具有一個出口子歧管層的出口歧管400，其中出口子歧管402包括多個支流通道206，每個支流通道獨立地流體地連接到陣列200的出口通道260。
[0055]在另一個變化形式中，細胞捕獲系統100包括包含兩層出口子歧管402的出口歧管400，其中第一層的支流通道206被流體地連接到第二層的主通道204，且第二層的支流通道206被流體地連接到出口通道260。第一層優選包括一個具有一個主通道204和多個支流通道206的出口子歧管402。第二層優選包括多個出口子歧管402，其中每個第二層出口子歧管402被流體地連接到第一層支流通道和細胞捕獲系統100的陣列200的子集。例如，第二層出口子歧管402可以被流體地連接到細胞捕獲系統100的四十個陣列200的4個出口通道260，其中第二層出口子歧管402包括一個主通道204和四個支流通道206，每個支流通道獨立地流體地連接到出口通道260。在這種變化形式中，第一層主通道204優選具有比第二層主通道204大的寬度和/或高度，且第一層支流通道206優選具有比第二層支流通道206大的寬度和/或高度。第二層支流通道206優選具有與出口通道260基本上相同的寬度和/或高 度，但可以可選地具有與出口通道260不同的尺寸。在另一個變化形式中，出口歧管400包括三層分支出口子歧管402。在另一個變化形式中，出口歧管400包括與入口歧管300相同數量的層。然而，出口歧管400可以包括任何適當數量的出口子歧管層。
[0056]出口歧管400的出口 420用來提供在細胞捕獲系統100的內部和細胞捕獲系統100的外部之間的流體連接。更優選地，出口 420提供在細胞捕獲系統100的外部和出口歧管400之間的流體連接。細胞捕獲系統100優選包括一個出口 420，但可以可選地包括多個出口 420。每個出口 420優選通過流體連接(例如，通道)流體地連接到一個出口歧管400，但可以可選地被連接到多個出口歧管400。每個出口歧管400優選被流體地連接到一個出口 420，但可以可選地被連接到多個出口 420。出口 420的縱軸優選垂直于出口歧管400的主通道204的縱軸，但可以可選地平行于出口歧管400的主通道204的縱軸。出口 420的縱軸優選垂直于基底的寬面112，但可以可選地平行于基底的寬面112，與基底的寬面112成一定角度，或以任何合適的方式被布置。在細胞捕獲系統100的一個變化形式中，出口 420是穿過基底厚度的一部分，從基底的寬面112延伸到界定出口歧管400的平面的洞或孔口。出口 420從其延伸的基底的寬面112可以是出口歧管400被界定在其上的寬面，其中連接出口 420和出口歧管400的流體連接也被界定在相同的寬面上，或者可以是出口歧管被界定114在其上的相對的寬面，其中出口 420延伸穿過基本上整個基底厚度以連接出口歧管400。當入口 320被界定在基底的寬面112上時，出口 420優選被界定在與入口 320相同的寬面上，但可以可選地被界定在相對的寬面上。在細胞捕獲系統100的另一個變化形式中，出口 420是穿過基底110的側面的洞或孔口，其中出口 420與基底的寬面112平行地朝向出口歧管400延伸。在這個變化形式中，垂直于基底的寬面112的流體連接優選連接出口420與出口歧管400。當入口 320也被界定在基底110的側面上時，出口 420優選被界定在基底的與界定入口 320的側面相對的側面上。然而，出口 420可以可選地被界定在相同的側面或鄰近的側面。然而，可以使用任何合適的出口 420的構型。
[0057]細胞捕獲系統100可以另外包括隔離機構500，隔離機構500用來將細胞隔離在單個孔220內。在一個變化形式中，隔離機構500包括分別流體地連接到陣列200，用來允許隔離材料 進入和排出的隔離入口 520和隔離出口 540。隔離入口 520和隔離出口 540兩者優選被流體地連接到入口通道240和出口通道260兩者。在一個變化形式中，如圖9所示，隔離入口 520可以被布置在入口通道240的第一端和陣列200的入口端的出口通道260之間，且隔離出口 540被布置在入口通道240的第二端和陣列200的出口端的出口通道260之間。陣列200的隔離入口 520或隔離出口 540可以分別通過一個或多個隔離入口歧管或隔離出口歧管被并聯地或串聯地流體地連接。在操作中，隔離材料優選流過隔離入口 520，進入入口通道240和出口通道260，到隔離出口 540，在室222和入口通道240之間形成第一隔離層，在孔通道224和出口通道260之間形成第二隔離層。隔離層優選為10到20微米厚，但可以可選地更厚。在隔離材料引進期間，緩沖劑被優選同時流過入口通道240和出口通道260，優選與隔離材料流相同的方向，其中緩沖劑流速優選控制隔離材料層的厚度。緩沖劑流優選在遠離孔220的入口 320和出口通道260的部分中建立。緩沖劑流速優選被保持為層流，但可以可選地具有任何其它合適的流速。可選地，隔離入口 520和隔離出口 540可以分別被流體地連接到位于入口通道240和出口通道260內的第一隔離通道和第二隔離通道，其中第一隔離通道和第二隔離通道引導隔離材料流。然而，可以建立第一隔離層和第二隔離層的任何其它合適的機構可以被使用。
[0058]隔離材料優選隔離陣列200內的孔220。隔離材料優選具有流動狀態和靜置狀態，其中光化學反應、熱化學反應、聚合反應或任何其它合適的反應把隔離材料從流動狀態轉換成靜置狀態。在流動狀態，隔離材料優選基本上是粘性的，使得隔離材料在引入細胞捕獲系統100期間不會流入孔220。在靜置狀態，隔離材料優選是固體或凝膠，防止細胞從孔220中排出，并優選是多孔的或選擇性滲透以允許緩沖劑和試劑通過其滲透。隔離材料優選為具有光引發劑的可光聚合的水凝膠，如PEG或聚丙烯酰胺，但可以可選地是具有任何其他合適的聚合劑的任何合適的材料。在一個變化形式中，隔離層可以是不能混合的液體如油。在另一個變化形式中，隔離材料的選定部分可以反應以密封特定的孔220。例如，如圖1OB所示，可以產生獨特的光掩膜504，其允許阻塞含有感興趣的細胞的孔220的隔離材料片段的準直照射。光掩膜504可以通過將防紫外線黑色油墨(UV-blocking black ink)高分辨率印刷在透明片上或通過在光致抗蝕劑涂覆的玻璃掩膜上使用標準光刻法來產生。微流體芯片的選擇區域的選擇性UV暴露還可以通過使用χ-y平臺(stage)將UV激光或準直和集中的UV點移動到選擇位置來實現。如圖1OC所示，不希望的細胞20和未反應的隔離材料然后可以通過使流體通過出口歧管400進入(例如，回流)而從細胞捕獲系統100被除去。可選地，光掩膜504可以允許阻塞含有不希望的細胞20的孔220的隔離材料片段的照射，其中希望的細胞10被從系統收回。然而，隔離材料的任何合適的部分可以被反應。
[0059]細胞捕獲系統100可以另外包括用來促進成像的光學元件130。光學元件130用來調整入射光，優選用來促進更好的成像。光學元件130可以用來彎曲、反射、準直、聚焦、抵制，或以其他方式調整入射光。光學元件130優選在與細胞捕獲系統100制造相同的過程中被制造，但可以可選地在細胞捕獲系統100制造后被包括。光學元件130優選被界定在基底110內，但可以可選地由頂層120或由單獨的部件界定。光學元件130可以包括設置在鄰近陣列200的基底厚度內(如圖1lA所示)，界定在基底的與界定細胞捕獲系統100相對的寬面112上(如圖1IB所示)的反光鏡，或界定在頂層120上(如圖1lC所示)的顯微透鏡、光準直器、光偏振器、干涉濾光片、使來自收集的熒光發射光的進入路徑的激發射線最小化的90°照明元件、衍射濾光片、光擴散器，或任何其他合適的光學元件。可選地，光學元件130可以由成像平臺(如圖1lD所示)或由任何外部部件界定。
[0060]細胞捕獲系統100可以另外包括用來吸引感興趣的細胞10朝向孔室222的孔親和性機構。孔親和性機構可以包括電場阱或任何其他合適的孔親和性機構，電場阱是在入口通道240內將流引入孔220，將負壓應用到出口通道260的部件。
[0061]細胞捕獲系統100優選被界定在基底110上。更優選地，細胞捕獲系統100被界定在基底的單個寬面112上，其中包括入口通道240、孔220和出口通道260的陣列200優選被界定在基底的單個寬面112上。更優選地，陣列200、入口歧管300和出口歧管400都被界定在相同的寬面上。因此，經過細胞捕獲系統100的樣品流優選基本上與基底的寬面112平行運行。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選都由在基底的寬面112中的凹處界定，但可以可選地是由被建立在基底110的頂部上的壁界定的通道，或者以任何其它合適的方式界定。基底110優選界定細胞捕獲系統100的一部分(例如，系統的三個壁)，其中剩余的部分(例如，一個壁)優選由頂層120界定。頂層120優選與基底110形成基本上流體不能滲透的密封以流體地密封細胞捕獲系統100。可選地，細胞捕獲系統100可以被界定穿過基底110的厚度，其中入口通道240被界定在基底的第一寬面112上，出口通道260被界定在基底的相對寬面112上，且孔220被界定穿過基底110的厚度。
[0062]基底110優選是光學透明的、生物相容的和基本惰性的。可以被用于基底110的材料的例子包括玻璃、高折射率聚合物，或任何其它合適的光學透明材料；硅；任何合適的聚合物例如聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、丙烯酸類或硅樹脂；石英、玻璃、金屬、陶瓷，或任何其它合適的材料。頂層120優選為被層壓、粘附、熱結合、激光結合、陽極結合或以另外方式結合到基底110的光學透明層。頂層120優選為聚合物層壓制品，但可以可選地為蓋玻片(glass cover slip)或任何其他合適的頂層120。
[0063]細胞捕獲系統100優選通過微型制造工藝來制造，但可以可選地通過注射成型、微型制造(例如，以產生母版(master))和注射成型(例如，用于批量制造)的組合、微型制造(例如，以產生母版)和熱壓印(例如，用于批量制造)的組合、激光蝕刻、CNC，或任何其它合適的制造工藝來制造。可以被使用的微型制造技術包括光刻法、DRIE、濕法刻蝕和陽極鍵合，但任何合適的微型制造技術可以被使用。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選在單個制造工藝中被形成，但可以可選地通過多個連續的或間斷的工藝形成。入口 320和出口420可以另外在與陣列200、入口歧管300和出口歧管400的工藝相同的工藝中被形成，但可以可選地在使用不同的工藝之前或之后被形成。[0064]在一個變化形式中，如圖12所示，細胞捕獲系統100使用注射成型工藝來制造。注射成型母版包括陣列界定部分102、底部界定部分104和一個或多個芯銷106。陣列界定部分優選包括陣列200的底片(negative)，并且可以另外包括入口歧管300和出口歧管400的底片。陣列界定部分優選使用微型制造技術形成，但可以可選地通過激光切割、CNC，或任何其他合適的方法形成。底部界定部分優選包括芯銷可以穿過其延伸的通道。芯銷優選具有插入底部界定部分通道的錐形端，并且用來界定入口 320和出口 420。基底材料優選從細胞捕獲系統100的邊緣或平行于未來的基底110的寬面被注入。然而，基底材料可以通過垂直于未來的基底110的寬面的底部界定部分，或通過任何其他合適的母版部分被注入。
[0065]在另一個變化形式中，如圖13所示，細胞捕獲系統100使用微型制造工藝來制造，并且利用一系列光刻法步驟以在基底110上產生細胞捕獲系統100的部件。然而，細胞捕獲系統100可以使用任何其它合適的方法來形成。
[0066]細胞捕獲系統的實施例
[0067]在第一實施例中，如圖4所示，細胞捕獲系統100包括并聯布置的多個基本上相同的陣列200 ;多個入口歧管300，每個獨立地流體地連接到入口通道240 ;多個入口 320，每個獨立地流體地連接到入口歧管300 ;多個出口歧管400，每個獨立地流體地連接到出口通道260 ;和多個出口 420，每個獨立地流體地連接到出口歧管400。每個陣列200優選包括多個基本上相同的孔220，孔220在室222處連接到入口通道240以及在孔通道224處連接到出口通道260。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選為界定在基底的一個寬面112上的凹處，并且優選共同地由將陣列200、入口歧管300和出口歧管400與細胞捕獲系統100外部流體地密封開的頂層120界定。入口 320和出口 420優選為界定穿過基底110的厚度的洞，并且優選源自與界定陣列200、入口歧管300和出口歧管400的面相對的基底寬面。可選地，入口 320和出口 420可以是從基底側面延伸穿過基底110的洞。
[0068]在第二實施例中，如圖5所示，細胞捕獲系統100包括并聯布置的多個基本上相同的陣列200 ;—個包括兩層或更多層的入口歧管300 ;流體地連接到入口歧管300的入口320 ;多個出口歧管400，每個獨立地流體地連接到出口通道260 ;和多個出口 420，每個獨立地流體地連接到出口歧管400。每個陣列200優選包括多個基本上相同的孔220，孔220在室222處連接到入口通道240以及在孔通道224處連接到出口通道260。入口子歧管302直接連接到入口通道240，優選每個獨立地連接到十個或更少的入口通道240。例如，當細胞捕獲系統100包括40個陣列200時，細胞捕獲系統100優選包括十個第二層入口子歧管302，每個連接到四個入口通道240。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選是界定在基底的一個寬面112上的凹處，并且優選共同地由將陣列200、入口歧管300和出口歧管400與細胞捕獲系統100外部流體地密封開的頂層120界定。入口 320和出口 420優選是界定穿過基底110的厚度的洞，并且優選源自與界定陣列200、入口歧管300和出口歧管400的面相對的基底寬面。可選地，入口 320和出口 420可以是從基底側面延伸穿過基底110的洞。可選地，入口 320可以是界定穿過基底110的厚度的洞，而出口 420是平行于基底寬面延伸穿過基底110的洞。
[0069]在第三實施例中，如圖7和8所示，細胞捕獲系統100包括并聯布置的多個基本上相同的陣列200 ;—個包括兩層或更多層的入口歧管300 ;流體地連接到入口歧管300的入口 320 ;—個包括兩層或更多層的出口歧管400，和流體地連接到出口歧管400的出口 420。每個陣列200優選包括多個基本上相同的孔220，孔220在室222處連接到入口通道240以及在孔通道224處連接到出口通道260。出口歧管400優選具有與入口歧管300相同數量的層，并且優選反映入口歧管300。例如，直接地連接到陣列200的出口子歧管402優選被連接到相應入口子歧管302被直接連接到的相同的陣列200。然而，出口歧管400可以包括不同數量的層，組成不同的陣列200，或具有任何其它合適的構型。直接連接到入口 320和出口通道260的入口 320和出口子歧管402優選每個分別獨立地連接到十個或更少的入口 320和出口通道260。例如，當細胞捕獲系統100包括四十個陣列200時，細胞捕獲系統100優選包括十個第二層入口 320和出口子歧管402，每個分別連接到四個入口 320和出口通道260。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選是界定在基底的一個寬面112上的凹處，并且優選共同地由將陣列200、入口歧管300和出口歧管400與細胞捕獲系統100外部流體地密封開的頂層120界定。入口 320和出口 420優選是界定穿過基底110的厚度的洞，并且優選源自與界定陣列200、入口歧管300和出口歧管400的面相對的基底寬面。可選地，入口 320和出口 420可以是從基底側面延伸穿過基底110的洞。可選地，入口 320可以是界定穿過基底110的厚度的洞，而出口 420是平行于基底寬面112延伸穿過基底110的洞。
[0070]在第四實施例中，如圖8所示，細胞捕獲系統100包括并聯布置但串聯地流體地連接的多個不同的陣列200 ;—個連接到上游入口通道240的入口歧管300 ;流體地連接到入口歧管300的入口 320 ;—個連接到下游出口通道260的出口歧管400 ;和流體地連接到出口歧管400的出口 420。陣列200的孔通道寬度優選隨著遠離入口 320的每個后續陣列200減小。另外，陣列200的室的大小可以隨著遠離入口 320的每個后續陣列200減小。陣列200的入口通道和出口通道的大小也可以隨著遠離入口 320的每個后續陣列200減小。每個陣列200優選包括在室222處連接到入口通道240和在孔通道224處連接到出口通道260的多個基本上一樣的孔220。上游陣列200的出口通道260優選被流體地連接到鄰近的下游陣列200的入 口通道240。在一個具體的實施例中，細胞捕獲系統100包括串聯地流體地連接的第一、第二、第三和第四陣列200。第一陣列200具有30微米的孔通道尺寸，第二陣列200具有25微米的孔通道尺寸，第三陣列200具有15微米的孔通道尺寸，且第四陣列200具有10微米的孔通道尺寸。陣列200、入口歧管300和出口歧管400優選被界定在基底的一個寬面112上的凹處，并且優選共同地由將陣列200、入口歧管300和出口歧管400與細胞捕獲系統100外部流體地密封開的頂層120界定。入口 320和出口 420可以是穿過基底Iio界定在基底110的相同側面上、在基底的相同寬面112上、在基底110的相對寬面上、在基底110的相鄰面上，或以任何合適的構型布置的洞。
[0071]在第五實施例中，如圖9所示，細胞捕獲系統100包括第一和第二陣列組202，每個陣列組202包括并聯布置的多個基本上一樣的陣列200，其中每個陣列200優選包括多個基本上一樣的孔220。細胞捕獲系統100優選包括流體地連接到兩個陣列組202的入口通道240的一個入口歧管300，但可以可選地包括兩個入口歧管300，每個獨立地連接到陣列組202，或任何其它合適數量的入口歧管300。在一個變化形式中，入口歧管300可以被設置在陣列組202之間，使得第二陣列組202是第一陣列組202的對映體。然而，入口歧管300可以被設置在任何合適的位置。細胞捕獲系統100優選包括一個入口 320，但可以可選地包括更多個入口 320。在一個變化形式中，入口 320在陣列組202之間被等距離布置。細胞捕獲系統100優選包括兩個出口歧管400，一個用于每個陣列組202，但可以可選地包括多個出口歧管400，一個歧管用于每個出口通道260，或包括任何其他合適數量的出口歧管400。在一個變化形式中，出口歧管400可以被設置成鄰近基底110的邊緣，使得用于第一陣列組202的出口歧管400被布置在遠離第二陣列組202的第一陣列組202側面，且出口歧管400被布置在遠離第一陣列組202的第二陣列組202側面。細胞捕獲系統100優選包括至少兩個出口 420，但可以可選地包括更多個出口 420。
[0072]在第六實施例中，如圖9所示，細胞捕獲系統100與第五實施例中的細胞捕獲系統100基本上是相似的，并且還可以包括第三陣列組202，第三陣列組202包括多個基本上相同的平行的孔220和流體地連接第一和第二陣列組202的入口歧管300和第三陣列組202的入口歧管300的取回通道502。在這個實施例中，第三陣列組202可以用作單細胞反應器，其中第三陣列組202內的每個陣列200還可以包括組中用于每個陣列200的隔離入口520和隔離出口 540，分別設置在入口通道240和出口通道260的第一和第二端之間的隔離入口 520和出口 420。在操作中，鄰近入口歧管300的取回通道502優選被密封，且感興趣的細胞通過使樣品運行通過入口 320,通過入口歧管300,并進入第一和第二陣列組202而被隔離在第一和第二陣列組202內。細胞隔離后，取回通道502可以被開封，入口 320被密封，并且通過使緩沖劑運行通過第一和第二陣列組202的出口歧管400，隔離的細胞通過入口歧管300，通過取回通道502并進入第三陣列200而被回流。如圖10所示，細胞然后可以通過同時將隔離材料例如水凝膠引入到隔離入口 520以及將緩沖劑引入到入口通道240和出口通道260的第一端而與鄰近的細胞隔離。然后，隔離材料優選起反應以把隔離材料從流動狀態轉換成靜置狀態。在一個變化形式中，僅密封含有感興趣的細胞的孔220的隔離材料的部分起反應。例如，隔離的細胞可以被染色，含有感興趣的細胞的孔220被識別(如，其中感興趣的細胞發射所需波長)，且產生光掩膜504，其中光掩膜504只允許密封感興趣的孔的隔離材料的部分起光反應(如，通過紫外照射)。未反應的隔離材料和不希望的細胞20可以通過使緩沖劑通過出口歧管400回流而被排出。然而，選擇性隔離材料反應的任何其它合適的方法可以被使用。試劑(如熒光抗體等)、分析物，或任何其它合適的物質可以在細胞隔離之前通過第三陣列入口 320被引入第三陣列200。可選地，試劑可以在細胞隔離之后被引入。在第一變化形式中，試劑可以通過第三陣列入口歧管被引入，其中試劑穿透靜置隔離材料以進入到孔220。在第二變化形式中，試劑、分析物或其他物質可以通過頂層120鄰近感興趣的孔的部分引入物質而被引入各個孔220。
[0073]細胞除去
[0074]細胞捕獲系統100被配置成促進從已知的可尋址的位置的選擇性細胞除去。盡管來自單個孔220的各個細胞被優選選擇性地除去，但系統可以促進從單個陣列200或陣列200的子集的同時多個細胞除去。細胞優選通過應用除去力到細胞而被除去。除去力優選通過泵送流體經過孔通道224進入到室222而被應用，但可以可選地通過把室222的容納物吸引出來而被應用。在一個變化形式中，由在細胞捕獲系統100的出口 420處的泵機構提供的泵壓小于10，000Pa。在一個具體的變化形式中，提供的泵壓為6，OOOPa。然而，任何其它合適的泵壓或抽吸壓力可以被使用。
[0075] 在細胞除去方法的第一變化形式中，一個或多個細胞可以通過使清洗流體通過出口歧管400進入和在入口 320收集沖洗出的細胞(使細胞回流)從細胞捕獲系統100被除去。當希望從多個流體地連接的地點收集細胞時，這可以是特別期望的。包括多個出口歧管400的細胞捕獲系統100 (如具有每陣列200 —個出口歧管400的系統)可以特別適合于這種細胞除去方法，因為在給定陣列200內的細胞可以通過僅使流體通過直接連接到選擇的陣列200的出口歧管400進入而被除去，而不影響鄰近的在其他陣列200內的捕獲細胞。可選地，具有多層子歧管的細胞捕獲系統100可以適合于這種細胞除去方法，其中保留在通過子歧管被流體地連接的陣列200的子集中的細胞可以被同時除去。然而，任何合適的細胞捕獲系統100的構型可以與這種細胞除去方法一起被利用。
[0076]在細胞除去方法的第二變化形式中，可以通過利用細胞除去工具600來實現細胞除去。細胞捕獲系統100的細胞除去工具600用來選擇性地從細胞捕獲系統100內的可尋址位置除去一個或多個隔離的細胞。細胞除去工具600優選地被配置成從單個室222除去細胞，但可以可選地被配置成同時從多個室222除去多個細胞。
[0077]在細胞除去工具的第一變化形式中，細胞除去工具600被配置成從垂直于基底的寬面112的方向穿過頂層120。細胞除去工具600優選從基底的寬面112以基本上垂直的方向除去細胞，但可以可選地在相對于基底的寬面112成角度的方向除去細胞。細胞除去工具600優選包括空心針，空心針穿過頂層120并界定與一個或多個孔220(例如，希望數量的孔220)流體連通的基本上流體地隔離的容積。如圖14A和14B所示，空心針在尖端620優選包括促進與頂層120的流體密封形成的一個或多個密封元件，例如聚合物涂層或適當的幾何形狀。空心針優選包括在空心尖端620處結束的套管。套管優選界定內腔，并且優選被流體地連接到細胞收集容積。在一個變化形式中，尖端620包括促進與頂層120的流體密封形成的幾何形狀。尖 端620優選包括第一和第二相對的壁，每個具有凹形輪廓，凹形輪廓在遠離套管的穿孔端逐漸變細。第一壁優選是第二壁的對映體，但可以可選地是基本上相同或不同的。每個壁的第一側面和第二側面(分別，622和624)優選顯示不同的曲率，使得穿孔端的中心優選從內腔的縱軸偏移。然而，第一和第二壁可以可選地是基本上相似的(如，具有相同的曲率)。第一和第二相對的壁優選用來穿過頂層120并用來與基底110形成第一和第二流體密封以界定流體地隔離的容積。然而，空心針可以包括任何其他合適的幾何形狀。在一個變化形式中，空心針具有200微米的高度和40微米的內腔直徑。
[0078]空心針優選被配置成在感興趣的孔室222內或鄰近感興趣的孔室222的入口通道240的片段形成基本上流體地隔離的容積。然后低壓發生器(如泵)優選被用于通過空心針從孔室222吸出保留的細胞并吸入細胞收集容積。
[0079]空心針優選使用微型制造技術來制造，但可以可選地被注射成型、激光切割、壓印或使用任何其它合適的制造技術來制造。在空心針制造的一個變化形式中，如圖15所示，內腔優選使用刻蝕技術例如深反應離子蝕刻(DRIE)、等離子刻蝕，或任何其它合適的刻蝕方法被刻蝕在基底110例如硅上。該步驟優選利用覆蓋要保護的基底110的部分的掩膜。然后優選利用腐蝕性液體或等離子體通過基底110的各向同性刻蝕制造壁和相關的輪廓，但任何其它合適的各向同性材料除去方法可以被使用。掩膜優選被用于保護穿孔端。多個空心針優選與陣列200同時被制造，但可以可選地被單獨制造。
[0080]在細胞除去工具的第二變化形式中，細胞除去工具600也被配置成從垂直于基底的寬面112的方向穿過頂層120。細胞除去工具600優選從基底的寬面112在基本上垂直的方向除去細胞，但可以可選地在相對于基底的寬面112成角度的方向除去細胞。如圖16所示，細胞除去工具600優選包括包含第一空心針640和第二空心針660的空心針對，其中兩個針優選與在細胞除去工具600的第一變化形式中描述的針基本上相似。第一針640的第一和第二壁優選被配置成與入口通道240和/或孔室222形成第一和第二流體不能滲透的密封。第二針660的第一和第二壁優選被配置成與出口通道260和/或孔通道224形成第一和第二流體不能滲透的密封。第一和第二針優選是平行對齊的，且第一和第二針的穿孔尖端鄰近細胞除去工具600并且在相同方向定向在細胞除去工具600內(例如，其中兩個尖端位于細胞除去工具600的相同側)。第一和第二針優選使用上述制造工藝制造，但可以可選地使用不同的工藝制造。第一和第二針優選同時被制造在相同的基底110上，但可以可選地被分別制造并在制造后結合。第一和第二針660之間的距離優選基本上等于孔220的長度(例如，室222和孔通道224的長度的總和)。然而，第一和第二針660之間的距離可以是室的長度、孔通道224的長度，或任何合適的距離。第一和第二針660優選共同地形成流體地隔離的容積，流體地隔離的容積包括一個或多個感興趣的孔、鄰近感興趣的孔的入口通道240的片段，和鄰近感興趣的孔的出口通道260的片段，使得感興趣的孔與鄰近的孔220流體地隔離。在操作中，流體優選通過第二針660進入出口通道260的流體地隔離的片段，通過孔通道224，通過室222，并進入第一針640。當流體移動通過室222，流體優選夾帶保留的細胞并移動細胞進入第一針640。第二針660可以被流體地耦合到泵和流體源。可選地/另外，第一針640可以被流體地耦合到低壓發生器(如，泵)。流體優選是緩沖劑，但可以可選地是細胞培養基或任何其它保持細胞生活力的合適的流體。
[0081]在細胞除去工具的第三變化形式中，細胞除去工具600被配置成在基本上平行于基底的寬面112的方向從細胞捕獲系統100除去一個或多個細胞。如圖17所示，細胞除去工具600優選包括界定內腔的套管680和孔口 684。套管680優選在第一端以密封的穿孔尖端682終止，并且優選在第二端被流體地連接到細胞收集容積。孔口 684優選是延伸穿過套管680壁的洞，其中洞優選具有基本上等于或大于孔室222的寬度的寬度，但足夠小以使得孔口 684沒 有跨過兩個孔室222。套管680優選包括一個孔口 684，但可以可選地包括多個孔口 684，其中多個孔口 684可以以平行于套管680的縱軸的線對齊，或可以圍繞套管680的表面被分布(例如，圍繞套管680的縱軸成螺旋狀)。孔口 684優選延伸穿過縱向套管680壁，但可以可選地延伸穿過穿孔尖端682的一部分。在一個實施例中，孔口 684延伸穿過鄰近穿孔尖端682的縱向套管壁的一部分。在另一個實施例中，孔口 684延伸穿過離穿孔尖端682預定距離的縱向套管壁的一部分，其中該距離可以被配置成使得套管壁阻塞一個或多個鄰近的孔220。在另一個實施例中，孔口 684可以延伸穿過穿孔尖端682，使得孔口 684的縱軸與套管680的縱軸平行地或同軸地延伸。在孔口 684和套管680外部和/或內部之間的過渡優選是凸面的和彎曲的以防止細胞損傷，但可以可選地是凹面的、成角度的、為直角的，或具有任何合適的構型。套管680優選具有圓形橫截面，但可以可選地具有矩形或正方形橫截面、卵形橫截面，或任何其它合適的橫截面。套管680優選是剛性的，但可以可選地是柔性的或包括柔性的部分。在一個可選方案中，套管680是柔性的并包括剛性的穿孔裝置686，其中剛性的穿孔裝置686可滑動地耦合在套管680上。剛性的穿孔裝置686形成和保持進入入口通道240的通路,并且套管680可以通過其前進。然而,套管680可以具有任何其它合適的構型。套管680可以另外包括可滑動地耦合在內腔中的穿孔器，其中穿孔器可以延伸穿過孔口 684以貫穿在套管680和孔220之間的任何中間層(例如，隔離層)。穿孔后的穿孔器位置可以被保留以幫助通過其進行細胞除去，或在細胞除去之前穿孔器可以被縮回。
[0082]在細胞取回工具操作的一個變化形式中，套管優選橫穿穿過具有感興趣的細胞10的陣列200的入口通道240，直到孔口與包含感興趣的細胞10的孔220對齊。然后，流體可以通過相關的出口歧管進入，其中進入的流體的壓力把感興趣的細胞10推出孔室222，通過孔口，并進入套管。隨后流體通過入口通道240進入可以重新捕獲從它們相應的孔220回流出的任何細胞。套管可以另外或可選地包括流體地耦合到內腔的將細胞吸出孔220的低壓產生機構。可選地或另外，套管可以促進細胞通過毛細管作用進入。細胞優選穿過內腔并被儲存在細胞收集 容積內。
[0083]在細胞取回工具操作的這個變化形式中，套管優選通過基底110的側面被插入入口通道240，如圖17B所示，其中入口通道240優選由自動密封壁部分地界定。套管優選延伸穿過這個自動密封壁。可選地，套管可以通過頂層120被插入入口通道240，其中套管可以是柔性的以適應進入的角度，或頂層120可以是彈性的以適應進入的角度。然而，任何其它合適的把套管引入入口通道240的方法可以被采用。
[0084]在細胞取回工具操作的另一個變化形式中，套管包括通過穿孔尖端的孔口。套管通過入口通道240前進，相繼地阻塞每個連續的孔室222，直到僅留下需要的孔220的子集未被覆蓋。然后流體可以通過與未被覆蓋的孔220直接地流體地連接的出口通道260來提供以同時從未被覆蓋的孔220釋放細胞，其中流體優選夾帶細胞并移動細胞進入套管。套管可以另外或可選地被流體地連接到低壓發生器以把細胞吸入到細胞收集容積。
[0085]從細胞捕獲系統100除去細胞優選是自動化的，但可以可選地是半自動化的或手動的。在一個變化形式中，細胞除去是自動化的，其中集成平臺30識別并除去感興趣的細胞。細胞識別可以包括自動固定、滲透作用(permeabilzation)、染色、成像,和通過圖像分析(例如，通過用處理器進行視覺處理，通過用光探測器等)識別細胞。細胞除去可以包括使細胞除去工具600前進到含有感興趣的細胞10的孔220。細胞除去可以另外包括細胞除去方法選擇和/或細胞除去工具選擇。在另一個變化形式中，細胞識別可以是半自動化的，且細胞取回可以是自動化的。例如，細胞染色和成像可以被自動進行，其中感興趣的細胞的識別和選擇可以被手動進行。在另一個變化形式中，所有的步驟都可以被手動進行。然而，自動或手動步驟的任何組合可以被使用。
[0086]示例性應用
[0087]上述細胞捕獲系統100可以被用于各種生物測定和程序中。運行測定或程序優選包括將靶細胞捕獲在細胞捕獲系統內的可尋址的位置，以及將試劑輸送到每個捕獲的細胞的內部或表面，同時維持細胞與其各個孔或位置配準(registration)。
[0088]在第一實施例中，細胞捕獲系統100可以用作微陣列200，其中微球140在樣品引入前被引進到細胞捕獲系統100內。微球140優選稍大于孔通道224，但可以可選地小于孔通道224。微球140可以被涂上特定的分析物(例如親和分子等)，其中微球140可以在孔220中產生親和柱。微球140可以另外被標記用于成像。在一個變化形式中，多組微球140被相繼地引入細胞捕獲系統100，其中每組微球140具有與其它組不同的親和分子涂層。每個微球組優選被用同樣的成像標記進行標記(例如，全部用Cal Red標記)，但可以可選地用不同的成像標記進行標記。每個微球組優選包括少數量的微球140(例如，少于系統中孔220的數量)，但可以可選地具有更多數量的微球140。細胞捕獲系統100優選在每個微球組被引入后被成像以識別由組的組成微球140占據的孔220。然而，細胞捕獲系統100可以在所有的微球140被引入后被成像，特別是當每個微球組用不同的成像標記進行標記后。如此，高度多路復用珠(highly multiplexed bead)微陣列200可以在細胞捕獲系統100內產生。在另一個變化形式中，如圖18所示，微球140可以在孔220內形成小孔網絡，可以作為更小的孔過濾裝置。例如，約10微米的微球140可以被用于制作濾菌器，而約2微米的微球140可以被用于制作病毒過濾器。在另一個實施例中，親和分子涂覆的微球可以與樣品被同時地引進，其中微球與靶細胞結合以形成復合物。微球優選被按尺寸制造成使得復合物被捕獲在孔內而未結合的微球流過系統。微球140可以是聚合的、金屬的、順磁體的、磁性的，或具有生物學特征。例如，微球140可以由導熱材料制成并可以用作快速熱交換器單元。
[0089]在另一個實施例中，一個或多個測定可以在細胞捕獲系統100內進行。感興趣的細胞優選首先通過使樣品運行通過細胞捕獲系統100而被隔離。然后捕獲的細胞優選被染色，其中染色優選保持細胞生活力。然后包括形態學和細胞計數的細胞分析被優選進行。一個或多個測定然后可以在捕獲的細胞上進行。這些測定可能包括免疫細胞化學、熒光原位雜交(FISH)、聚合酶鏈反應(PCR)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和本領域技術人員已知的其它標準的細胞和分子測定。
[0090]隔離感興趣的細胞優選包括泵送樣品通過細胞捕獲系統的入口 320和通過細胞捕獲系統100的出口 420排出樣品的剩余物。隔離感興趣的細胞可以另外包括在樣品進入細胞捕獲系統100之前的樣品富集。隔離感興趣的細胞可以另外包括使緩沖劑運行通過細胞捕獲系統100以沖洗隔離的細胞。隔離感興趣的細胞優選包括將細胞留在孔220內，但可以可選地包括從細 胞捕獲系統100除去細胞。被除去的細胞可以經過第二細胞捕獲系統100以繼續地富集被隔離的細胞種群，或可以被儲存在細胞收集容積內用于芯片外分析。
[0091]抗體染色優選被用于識別容納感興趣的細胞的孔220。抗體染色可以另外區分感興趣的細胞與也已經被捕獲的相似大小的不希望的細胞20。抗體染色優選包括通過細胞捕獲系統100引入對感興趣的細胞10有特異性的結合抗體的溶液。結合抗體優選是原發抗體，但可以可選地是二次抗體，其中未結合的原發抗體優選在結合抗體引入之前被引入細胞捕獲系統100。然而,任何合適的細胞染色方法可以被使用。
[0092]細胞分析優選被用來確定捕獲的細胞的形態學和確定捕獲的感興趣的細胞的數量和位置。細胞分析優選通過相關的集成平臺30來進行，其中形態學和細胞計數優選通過整體芯片成像和圖像分析來完成。成像和分析優選自動進行，但可以可選地是半自動化的或手動進行。然而，形態學確定和細胞計數可以通過任何其它合適的方法來實現。
[0093]對隔離的細胞運行測定用來確定細胞的特征和/或確定細胞對于給定刺激的反應。分析可以單獨地對細胞運行(例如，單細胞水平分析)，其中細胞可以被單獨地流體地隔離在細胞捕獲系統100內。可選地，分析可以作為整體在細胞捕獲系統100上運行。可選地，單個陣列200子集可以與其它陣列200子集流體地隔離，其中不同的分析可以對不同的陣列200子集進行。可以對細胞運行的示例性測定包括FISH測定、選擇性細胞裂解和裂解液收集、單細胞分子分析(例如，PCR、RT-PCR、全基因組擴增、ELISP0T、ELISA、免疫-PCR等)、藥物測試、細胞培養、親和性分析、時間響應分析，但其它分析可以可選地/另外被運行。隔離的細胞可以在運行測定之前、期間或之后優選用細胞除去工具600來除去但可選地用任何合適的方法來除去。可選地，隔離的細胞可以被隔離在室222中(例如，用隔離層)、被固定、被培養在室222內，或以任何其它合適的方式被保留在室222中。
[0094]在一個具體的實施例中，用細胞捕獲系統100測定細胞包括預處理含有添加的癌細胞的樣品，啟動細胞捕獲系統100，使樣品流過細胞捕獲系統100，將細胞固定在它們各自的孔里，以及對固定的細胞染色。測定程序之后，細胞可以被手動地或自動地成像和分析。樣品優選是外周全血樣品，但可以是任何其它合適的含有靶細胞的樣品。細胞捕獲系統100優選包括12，800個孔，但可以可選地包括更多或更少的孔。預處理樣品優選包括稀釋樣品(如，使用在IX PBS混合物中的0.5%福爾馬林或任何其它合適的含有固定劑的溶液)和優選在振蕩器中培養樣品(例如，持續15-30分鐘)。啟動細胞捕獲系統100優選包括引入初始緩沖劑(例如，在IX PBS中l%BSA+0.l%triton X)和從系統100除去氣泡。使樣品流過細胞捕獲系統100優選包括在小于10，OOOPa的壓力下在少于十分鐘內使樣品流過系統100同時最小化氣泡的引入，但可以可選地包括在任何合適的壓力下在任何合適的時間幀內使樣品流過系統100。固定細胞優選包括用固定劑(例如，在洗滌緩沖劑中2%福爾馬林)快速固定細胞，這可以準備用于后續的抗體染色的細胞。對固定的細胞染色可以包括洗滌固定的細胞(例如，用在IX PBS中的l%BSA+25mM EDTA)和將含有對感興趣的細胞有特異性的抗體的抗體雞尾酒(antibody cocktail)(例如,包括識別人類上皮癌細胞的抗細胞角蛋白8/18或抗EpCAMdPJij白血球的CD45，和/或核染劑HoeSCht33342的原發抗體雞尾酒)引入細胞捕獲系統100。對固定的細胞染色可以另外包括培養細胞(例如，在室溫下30-45分鐘)。對細胞染色可以另外包括用洗滌緩沖劑(例如，在IX PBS中的l%BSA+25mMEDTA)洗滌細胞，引入含有結合到原發抗體的抗體的二次抗體雞尾酒(例如，包括Alexa-結合的抗CD45、抗細胞角蛋白8/18，和/或抗EpCAM的雞尾酒)，以及培養細胞(例如，在室溫下45分鐘)。測定細胞可以另外包括在每個測定步驟之間的洗滌步驟。細胞優選用含有培養基、緩沖劑、金屬離子清除劑和/或表面活性劑的洗滌緩沖劑(例如，含有在IX PBS中的1%BSA和0.l%triton X的洗滌緩沖劑、含有EDTA的洗滌緩沖劑等)洗滌。
[0095]樣品制備
[0096]細胞捕獲系統100優選與含有細胞的樣品一起使用。含有細胞的樣品優選是血液樣品，但可以可選地是體液，懸浮在緩沖劑或培養基中的細胞，或任何其它合適的含有細胞的樣品。
[0097]雖然含有細胞的樣品可以在沒有任何預處理的情況下被引入到細胞捕獲系統100，但預處理可以是優選的以增加細胞分選的功效。樣品預處理優選包括樣品富集以增加樣品中希望的細胞10的比例。樣品富集優選包括在樣品進入細胞捕獲系統100之前，基本上從樣品中除去不需要的組分。樣品預處理可以另外包括制備用于下游處理的樣品，或以任何其它合適的方式處理樣品用于任何合適的應用。
[0098]在第一變化形式中，優選除去可以在細胞捕獲系統100內形成障礙的樣品組分例如凝塊。例如,在血液樣品中，這些組分可以包括紅血球、血小板,和其它相似的血液組分。這些組分優選通過密度梯度離心被除去，其中紅血球和粒細胞小球優選被除去，并且樣品的剩余部分被保留。然而，這些組分可以通過過濾、選擇性裂解，或任何其它合適的除去或滅活方法被除去。[0099]在第二變化形式中，與希望的細胞10基本上相同的大小的不希望的細胞20被選擇性地除去。例如，如果CTC是希望的細胞10，那么單核細胞(例如，PMBC)優選被除去。不希望的、相似大小的細胞優選通過陰性選擇被除去，但可以可選地通過其它合適的除去方法例如離心來除去。陰性選擇優選通過不希望的細胞的免疫磁分離來實現，其中抗體涂覆的磁性顆粒被引入樣品。涂覆磁性顆粒的抗體優選靶向由不希望的細胞20表達而不是由希望的細胞10表達的抗原。例如，如果白血球是不希望的細胞20，那么抗CD45可以被使用。然后樣品經過磁場，其中磁性顆粒選擇性地從樣品中除去被結合的、不希望的細胞20。
[0100]陰性選擇可以可選地或另外在細胞捕獲系統100內實現，其中細胞捕獲系統100包括流體地連接到下游第二平臺(Stage)的第一平臺。第一平臺的通道優選包括選擇性地結合不希望的細胞20的親和分子(例如，抗體)，而允許希望的細胞10從其流過。親和分子可以作為涂層、作為親和分子涂覆的微球140、親和分子涂覆的微柱體、親和分子涂覆的微通道被引入，或以任何其它合適的方式引入。第一平臺可以是入口歧管300的部分或上游陣列200的子集、單獨的細胞捕獲系統100，或任何合適的上游平臺。第一平臺優選包括大尺寸的孔通道，優選大于希望的細胞10的直徑(例如，35-50微米)。第二平臺優選根據細胞大小和/或可變形性選擇希望的細胞10，并優選不包括任何抗體或細胞結合涂層。
[0101]在樣品制備的一個變化形式中，如圖19所示，通過密度梯度分離除去小樣品組分SlOO和通過免疫原性分離除去單核細胞S200來制備樣品。然后感興趣的細胞使用細胞捕獲系統來隔離S300，并對隔離的細胞進行后續的測定S400。
[0102]集成平臺
[0103]如圖20所示，細胞捕獲系統100優選與包括樣品工作站40和成像平臺50的集成平臺30—起被利用。集成平臺30優選是全自動化的，但可以可選地是半自動化的或手動操作的。集成平臺30可以進行移液、等分試樣(aliquoting)、混合、泵送、和監測中的全部或一些功能。集成平臺30可以另外自動識別被占的室222、成像所述室222，和/或對所述室222進行分析。集成平臺30可以另外選擇性地從細胞捕獲系統100除去細胞。集成平臺30可以另外或可選地進行任何其它合適的功能。細胞捕獲系統100優選與如上所述的細胞捕獲系統100 —起被利用，但可以可選地與任何合適的裝置或方法一起被利用。
[0104]樣品工作站40優選包括泵送系統，泵送系統調節通過系統的樣品流速以控制細胞上的剪切力，同時提供足夠的正壓以推動不想要的細胞和碎片通過孔220的孔室222。在一個變化形式中，泵送系統提供小于10，OOOPa的泵壓。更優選地，泵送系統提供約6，OOOPa的泵壓，但可以可選地提供任何合適的泵壓。泵送系統優選能夠處理不同的體積輸入，優選范圍從100微升到幾十毫升。如圖21所示，泵送系統優選通過流體歧管42耦合到細胞捕獲系統100的入口 320和出口 420，其中流體歧管42優選從上面將流體引入到細胞捕獲系統100，但可以可選地從下面、從側面，或從其他合適的方向將流體引入到細胞捕獲系統100。流體歧管42優選包括圍繞入口接觸部分和出口接觸部分的形成流體密封的元件43，例如O環、墊圈，或任何其它合適的密封元件。樣品工作站40優選包括排出氣泡的排氣系統(例如，使用疏水性排氣孔)。樣品工作站40可以另外用來制備與細胞捕獲系統100 —起使用的樣品。例如，樣品工作站40可以混合試劑、促進從樣品中除去不需要的細胞，或進行任何其它合適的功能。樣品工作站40可以另外用來取回被捕獲的細胞，并可以包括細胞收集容積和低壓發生器(如果使用的話)。[0105]工作站優選能夠同時處理血液或任何其它合適的試樣的多個樣品(例如，12、24、96個樣品等)。如圖22所示，樣品工作站40可以另外包括預先確定的樣品位置，其中樣品管例如試樣管可以被裝入具體位置，用于整個過程的正確識別。試樣管可以包括可以通過工作站自動識別或人工讀取的唯一標識符(例如，條形碼)。樣品工作站40可以另外接受用于處理樣品和/或捕獲的細胞的試劑。試劑優選以含有預加載或部分加載的試劑的成套試劑條被提供，但可以可選地以單獨的小瓶或任何其他合適的形狀因素被提供。試劑可以包括洗滌緩沖劑、清洗液、細胞染色劑、細胞固定劑、細胞生長介質、細胞裂解劑、原位雜交所需要的試劑、特異性核酸擴增所需要的試劑(例如，PCR試劑)、阻塞特定部分的功能所需要的試劑、清洗細胞捕獲系統100所需要的試劑，或任何其它合適的試劑。試劑在條上的配置和/或試劑提供或布置的順序優選取決于需要的過程。工作站優選接受用于多個過程的試劑，其中多個過程可以在單個芯片上同時進行。可以被實施的過程的例子包括免疫染色、單細胞蛋白質組分析、核酸分析、基因組測序，或在表達的細胞RNA和背景血漿表達之間的比較，測試藥劑的功效。樣品工作站40優選通過獨立的處理器來控制，但可以可選地通過任何合適的控制機構來控制。
[0106]集成平臺30可以另外包括成像平臺50。成像平臺50可以用來捕獲細胞的圖像。數字成像系統可以另外包括可以允許在平臺中特定圖像量化和報告的軟件。成像平臺50優選包括成像硬件和成像軟件。成像軟件優選控制成像硬件，并可以另外處理圖像。在一個變化形式中，成像軟件分析第一圖像以確定保留感興趣的細胞的孔220的地址，然后控制成像硬件以單獨地成像并詢問每個經識別的孔220。成像軟件可以另外儲存感興趣的細胞的位置用于進一步的細胞處理，例如細胞除去或單細胞分析。
[0107]成像硬件優選被配置成接受細胞捕獲系統100，并可以另外接受常規的成像設備，例如顯微鏡載玻片、細胞培養板，或任何其它合適的成像設備。成像硬件優選能夠在圖像捕獲前使顯微鏡自動聚焦，但可以可選地以多重焦距獲取一系列圖像，使用圖像后處理來銳化圖像，或采用任何其它合適的方法以得到聚焦的圖像。
[0108]成像硬件優選包括可以幫助自動校準、細胞捕獲系統詢問、細胞捕獲系統100攪動、或以任何其它合適的方式移動成像設備的自動化平臺52。自動化平臺52可以另外用來使細胞捕獲系統100與目標或圖像場對齊。自動化平臺52可以另外相對于細胞除去工具600移動細胞捕獲系統100以使細胞除去工具600的孔口與希望的孔220對齊。自動化平臺52可以另外將細胞移動到樣品工作站40。自動化平臺52優選由電動機驅動，但可以通過任何其它合適的機構來驅動。
[0109]自動化平臺52優選能夠至少在z方向移動，并且可以另外在X方向和/或y方向移動。在一個變化形式中，如圖23所示，平臺另外能夠傾斜細胞捕獲系統100，這可以使成像模塊56能夠自動對焦。細胞捕獲系統100可以被傾斜成具體的角度，其中基于不同的所得到的焦距，載玻片圖像的一些區域將比其它區域被更好地聚焦。然后，產生的對比度差異通過計算機算法詢問，計算機算法確定具有最大對比度的垂直剖面，其是指示理想焦距(最佳Z-高度)的度量。然后自動化平臺52將細胞捕獲系統100放回到平行于基部的平面位置，并將細胞捕獲系統100移動到確定的最佳Z-高度。
[0110] 平臺優選包括相對于平臺其它部分保持細胞捕獲系統100位置的保持機構54。保持機構54優選還能夠保持其它成像設備，例如載玻片或細胞培養板。保持機構54可以作為將細胞捕獲系統100偏置在支柱上的夾子、在平臺的寬面中的凹處，或任何其他合適的保持機構54。平臺優選一次容納一個細胞捕獲系統100，但可以可選地同時容納多個細胞捕獲系統100。在一個變化形式中，平臺包括包含多個細胞捕獲系統100的圓盤傳送帶或托盤輸送機，其中平臺使連續的細胞捕獲系統100在成像模塊56下方旋轉。
[0111]平臺可以另外包括熱耦合到平臺的配置成接觸細胞捕獲系統100的部分的熱控制系統。熱控制系統可以被用于通過在測定或反應期間加熱和/或冷卻細胞捕獲系統100來控制細胞捕獲系統100的溫度。例如，熱控制系統可以加熱細胞捕獲系統100以培養保留在其中的細胞，以及冷卻細胞捕獲系統100以猝滅給定的生化反應。在一個變化形式中，熱控制系統包括配置成接觸細胞捕獲系統100的整個寬面的單塊(block)。在另一個變化形式中，熱控制系統包括多個部分，每個部分配置成加熱或冷卻細胞捕獲系統100寬面的給定部分。熱控制系統優選包括電加熱器，但可以可選地包括感應加熱器、陶瓷加熱器，或任何其它合適的加熱器。熱控制系統可以包括散熱器、熱泵、換熱器，或任何其它合適的被動或主動的冷卻機構。熱控制系統優選是光學透明的，但可以可選地具有任何其它合適的光學性能。
[0112]平臺可以另外包括與細胞捕獲系統100的入口 320和出口 420相連的流體歧管42，使得通過細胞捕獲系統100的實時流動可以被目測。
[0113]成像硬件優選另外包括成像模塊56，成像模塊56包括成像器和優化的照明器，能夠在載玻片的多個預定的位置捕捉高分辨率圖像和/或捕捉載玻片的整個圖像。成像模塊56優選能夠用不同組的激發波長和發射波長工作，使得成像平臺50可以解析多種標記物(例如，熒光標記物、染色劑等)。照明器優選能夠提供適當的照明和用于熒光分辨、相差顯微術、暗視野顯微術、明視野顯微術，和/或任何其他合適的成像技術的波長。例如，成像硬件可以包括能夠分辨熒光染料例如FAM、Cal Red、Texas Red、Cy5、Cy5.5，或任何其它合適的用于細胞分析的熒 光染料的一個或多個發射器。成像模塊56優選包括成像器，成像器優選光學地連接到顯微鏡，該顯微鏡放大細胞捕獲系統100中要被成像的部分。成像器可以是5兆像素、10兆像素、20兆像素、50兆像素、100兆像素，或任何合適大小的成像器。成像器可以是(XD、CMOS成像器、行掃描儀，或任何其它合適的成像器。
[0114]成像硬件可以另外包括標識符閱讀器，標識符閱讀器用來讀取和識別成像設備標識符。成像硬件可以包括條形碼閱讀器、RFID標簽閱讀器、QR碼閱讀器、近場通訊設備，或任何其它合適的可以識別位于成像設備(例如，細胞捕獲系統100、顯微鏡載玻片等)上的唯一的標識符的機構。可選地或另外，成像模塊56可以被用作標識符閱讀器。在一個變化形式中，給定的物鏡被放置在唯一的標識符上以獲得成像模塊56成像的正確的縱橫比。在另一個變化形式中，唯一的標識符可以從多個圖像中拼接。然而，任何其它合適的獲得和識別唯一的標識符的方法可以被使用。
[0115]成像硬件優選通過運行成像軟件的處理器來控制，其中處理器優選控制平臺移動、顯微鏡聚焦和圖像捕捉，且可以另外控制其它功能。成像硬件控制優選基于通過圖像硬件采集的圖像，但可以可選地基于從感應器或集成平臺30的其它部分接收到的信號。
[0116]本領域技術人員從前述詳細描述和從附圖和權利要求書將認識，可以對本發明的優選的實施方式做出修改和改變，而沒有偏離下面的權利要求書中界定的本發明的范圍。
【權利要求】
1.一種細胞捕獲系統,包括: 界定在基底的寬面上的陣列，所述陣列包括: 多個平行的孔，每個孔包括: 室，其配置成容納單個細胞；以及 孔通道，其流體地連接到所述室； 入口通道，其流體地連接到所述孔的所述室； 出口通道，其流體地連接到所述孔的所述孔通道； 入口歧管，其界定在所述基底的所述寬面上，流體地連接到所述入口通道；以及 出口歧管，其界定在所述基底的所述寬面上，流體地連接到所述出口通道。
2.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述孔、所述入口通道和所述出口通道每個包括在所述基底的單一的寬面上的凹處。
3.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述陣列的所述孔基本上是相同的。
4.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述系統包括多個陣列；其中所述系統包括多個入口歧管，其中每個入口通道獨立地流體地耦合到相應的入口歧管，且其中所述系統包括多個出口歧管，其中每個出口通道獨立地流體地耦合到相應的出口歧管。
5.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述系統包括多個陣列；其中所述系統包括并聯地流體地連接所述多個陣列的所述入口通道的單個入口歧管。
6.根據權利要求5所述的細胞捕獲系統，其中所述系統包括多個出口歧管，其中每個出口通道獨立地流體地耦合到相應的出口歧管。
7.根據權利要求6所述的細胞捕獲系統，其中所述系統包括并聯地流體地連接所述多個陣列的所述出口通道的單個出口歧管。
8.根據權利要求7所述的細胞捕獲系統，其中所述出口歧管包括并聯地流體地連接的多個出口子歧管，其中每個出口子歧管并聯地流體地連接所述出口通道的子集。
9.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述系統包括多個陣列，每個陣列具有不同于其他陣列的孔通道寬度；其中所述多個陣列被串聯地流體地連接，其中具有最大孔通道寬度的所述陣列的所述入口通道被流體地連接到所述入口歧管，且具有最小孔通道寬度的所述陣列的所述出口通道被流體地連接到所述出口歧管；其中上游陣列的所述出口通道被流體地連接到鄰近的下游陣列的所述入口通道。
10.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中每個孔包括具有不同室寬度的多個流體地連接的室，其中所述多個室通過減小寬度而被線性地布置，使得具有最大寬度的所述室最接近所述入口通道，且具有最小寬度的所述室被流體地連接到所述孔通道。
11.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述陣列、所述入口歧管和所述出口歧管被共同地界定在頂層和所述基底的寬面之間。
12.根據權利要求11所述的細胞捕獲系統，其中所述基底和所述頂層包括光學透明材料。
13.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述基底還包括配置成將光反射到所述孔內的反射體。
14.根據權利要求1所述的細胞捕獲系統，其中所述系統還包括配置成穿過所述入口通道并取出孔的容納物的細胞除去工具。
15.根據權利要求14所述的細胞捕獲系統，其中所述細胞除去工具包括套管、孔口和內腔，所述套管在第一末端處界定密封的穿孔尖端，所述孔口穿過縱向套管壁，所述內腔配置成流體地連接到在第二套管末端處的細胞收集容積。
16.—種細胞分選裝置,包括: 界定在基底寬面上的多個平行陣列，每個陣列包括: 多個平行的孔，每個孔包括: 室，其配置成容納單個細胞；以及 孔通道，其流體地連接到所述室； 入口通道，其流體地連接到所述孔的所述室； 出口通道，其流體地連接到所述孔的所述孔通道； 入口歧管，其界定在所述基底寬面上，所述入口歧管被流體地連接到所述入口通道； 入口，其通過基底厚度而被界定，所述入口被流體地連接到所述入口歧管； 出口歧管，其界定在所述基底寬面上，所述出口歧管被流體地連接到所述出口通道；以 及 出口，其通過基底厚度而被界定，所述出口被流體地連接到所述出口歧管。
17.根據權利要求16所述的細胞分選裝置，其中所述入口和所述出口垂直地通過所述基底厚度從第二基底寬面分別延伸到所述入口歧管和所述出口歧管，其中所述第二基底寬面與所述第一基底寬面平行并相對。
18.一種用于界定在頂層和基底的單個寬面之間的系統的細胞除去工具，所述系統包括陣列，所述陣列包括多個平行的孔，每個孔配置成容納單個細胞；所述陣列還包括流體地連接到所述孔的所述室的入口通道和流體地連接到所述孔的所述孔通道的出口通道；所述細胞除去工具包括: 空心針，其包括: 套管，其界定內腔； 空心尖端，其流體地連接到所述內腔，包括: 相對的第一壁和第二壁，其從所述套管延伸，配置成穿過所述頂層并配置成界定所述入口通道的部分中的流體地隔離的容積，其中所述流體地隔離的容積與單個孔流體連通，所述第一壁和所述第二壁每個包括在遠離所述套管處逐漸變細成穿孔末端的凹形輪廓，所述穿孔末端配置成穿過所述頂層。
19.根據權利要求18所述的細胞除去工具，還包括平行于第一空心針的第二空心針，其中所述第二空心針與所述第一空心針之間的距離基本上等于所述室和所述孔通道的組合長度。
20.根據權利要求19所述的細胞除去工具，其中所述第二空心針包括空心尖端，所述空心尖端包括相對的壁，所述相對的壁配置成穿過所述頂層并配置成界定所述出口通道的部分中的流體地隔離的容積，其中所述流體地隔離的容積與單個孔流體連通，所述第二空心針具有尖端，該尖端具有與所述第一空心針的所述尖端的輪廓相似的輪廓。
21.根據權利要求20所述的細胞除去工具，還包括流體地耦合到所述第二空心針的增壓機構和流體地耦合到所述第一空心針的收集室，其中所述增壓機構引導流體通過所述第二空心針進入所述出口通道的所述流體地隔離的容積，且所述收集室收集從所述孔的所述室流入所述第 一空心針的顆粒。
【文檔編號】C04B30/00GK103998394SQ201280048442
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2012年7月25日 優先權日:2011年8月1日
【發明者】卡利安·翰迪克, 普里亞達詩尼·戈戈伊, 克里斯多佛·西默, 薩阿德·塞佩赫里·亞夫旦尼 申請人:德諾弗科學公司