引入有氨基酸和甾基的透明質酸衍生物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及被氨基酸修飾并引入有留基的透明質酸衍生物、該透明質酸衍生物和 藥物的復合物、以及含有該透明質酸衍生物和藥物的藥物組合物。
【背景技術】
[0002] 近年來，由于重組基因技術和化學合成技術的發展，以蛋白質和肽為活性成分的 制劑被實用化，其數量逐年持續遞增。但是，蛋白質和肽難以通過消化管或粘膜等吸收，另 外在體內不穩定，血中半衰期短。因此，蛋白質制劑和肽制劑需要通過頻繁注射來給藥，給 患者和醫務人員均帶來很大的負擔。期望開發出在不損害藥理活性的情況下用于將蛋白質 或肽膠囊化的具有緩釋性或靶向功能的DDS (藥物遞送系統）基材。另外，從給藥效率的觀 點考慮，期望向基材中盡可能地封裝入大量的蛋白質、肽。
[0003] 已知，蛋白質和肽的藥理活性因為它們的高維結構而比較大，由于與有機溶劑或 空氣界面的接觸、壓力或溫度、pH等外部環境引起的變性和凝集，蛋白質和肽的藥理活性會 受到損傷。另外，當把變性或凝集的蛋白質給藥于體內時，已知會增加抗原性等的風險。對 于以蛋白質或肽為活性成分的緩釋制劑來說，從制劑化工序起，經過制劑的貯存期間，直至 給藥后該活性成分在生物體內釋放為止，尋求確保蛋白質和肽的穩定性。
[0004] 對于低分子藥物來說，關于藥物穩定性的課題與蛋白質?肽相比不那么大，但依然 對具有提高難溶性藥物的溶解性的功能、或具有緩釋性或靶向功能的 DDS基材存在很大需 求。
[0005] 另外，從安全性的角度考慮，用于制劑的基材必須兼具非抗原性、非誘變源性、無 毒性、生物降解性。
[0006] 近年來，報道有使用多糖作為藥物載體的基材等。其中，透明質酸（HA)已知是于 1934年由K. Meyer從牛眼的玻璃體中分離出的生物材料（多糖），一直作為細胞外基質的 主要成分而熟知。HA是由D-葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺通過0 (1 - 3)糖苷鍵連接而成的 二糖單元構成的粘多糖的一種。HA在化學和物理結構方面沒有種類的差異，人也具有對其 的代謝途徑，HA是在免疫性和毒性方面最安全的醫用生物材料（Biomaterial)之一。
[0007] 除了上述安全性等特性以外，近年來，透明質酸作為與細胞的粘附、增殖、移動的 誘導相關的生理活性物質的方面也備受矚目。進而從制造的觀點考慮，可以由微生物大量 生產高分子量的透明質酸，因此關于透明質酸的DDS研宄日益盛行。通過將藥物與透明質 酸形成軛合物，據報道能夠實現藥物向癌組織的靶向（專利文獻1)、向肝臟的靶向（專利 文獻2)、降低抗原性等（專利文獻3)。另外，報道了在生物體內存在CD44、RHAMM(調控透 明質酸介導的游走性的受體）、LYVE-1 (淋巴管內皮細胞透明質酸受體1)、HARE (胞吞透明 質酸受體）等HA受體（非專利文獻7和非專利文獻8)。特別是CD44和RHAMM在大量的 癌細胞中過表達，因此正在嘗試使用HA作為癌靶向載體的基材。作為其粒子，可舉出紫杉 醇-HA軛合物（非專利文獻9?11和專利文獻12)、喜樹堿-HA軛合物（專利文獻13)、多 柔比星-HPMA[N-(2-羥丙基）甲基丙烯酰胺]-HA軛合物（非專利文獻12)、酪酸-HA軛合 物（非專利文獻13)、多柔比星封入HA-PEG-PLGA納米粒子（非專利文獻14)、siRNA封入 HA凝膠（非專利文獻15)、多柔比星封入HA被覆脂質體（非專利文獻16)等。進而，非專 利文獻17報道了通過酰胺鍵引入的經由乙二胺連接基與膽酸軛合的HA衍生物。以這些HA 為基材的載體可在體外被有效地吸收到CD44高度表達的細胞中（例如非專利文獻9)。但 是，在將HA系統給藥時，已知HA可被肝臟等的肝竇內皮細胞中存在的HARE受體瞬間吸收 而代謝，迅速從血中消失（非專利文獻18?20)。這樣，在使用透明質酸來延長滯留性或作 為靶向用DDS基材時，其在血中滯留時間短成為缺點。認為透明質酸的連續6個糖單元是 受體的識別部位，通過修飾羧基，試圖進行血中滯留時間的延長（專利文獻4、5和6)。
[0008] 通過高度修飾透明質酸的葡糖醛酸部分的羧基，開發出了實現血中滯留性長期化 的透明質酸衍生物，公開了其有用性（專利文獻7)。一般來說，通過提高葡糖醛酸部分的 羧基的修飾率，也可以使透明質酸衍生物的血中滯留性長期化。但是，已知兩者并非線性相 關，在某一閥值處，滯留性就會發生急劇變化。
[0009] 作為透明質酸中的羧基被氨基酸修飾的粒子，例如可舉出在N-甲基嗎啉的 存在下，使用通過采用2-氯-4, 6-二甲氧基-1，3, 5-三嗪而生成的4-(4, 6-二甲氧 基-1，3, 5-三嗪）-4-甲基嗎啉鐵(以下也稱為DMT-MM)作為縮合劑，通過甘氨酸的乙酯的 修飾，但修飾率最大為20% (非專利文獻1)。另外，作為使用三嗪系化合物作為縮合劑的 例子，報道了引入有丙氨酸的透明質酸對酶解的抗性增強，可期待用作粘性的添加物（非 專利文獻2)、還報道了通過類似的方法，用其他的氨基酸進行的修飾（非專利文獻3,專利 文獻9)。另外，還存在使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（以下也稱為 EDC)作為縮合劑，通過用亮氨酸的甲酯鹽酸鹽、纈氨酸的甲酯鹽酸鹽、異亮氨酸的甲酯鹽酸 鹽、脯氨酸的甲酯鹽酸鹽、苯丙氨酸的甲酯鹽酸鹽、精氨酸的甲酯鹽酸鹽和組氨酸的甲酯鹽 酸鹽修飾，在不脫保護的情況下凝膠化，制備非水溶性的生物相容性的膜的例子，但不知曉 修飾率（專利文獻8)。另外，在本申請優先權日以后公開的專利文獻15中報道了，通過將 透明質酸的羧基用特定的氨基-羧酸或其酰胺修飾而得到的透明質酸衍生物，兼具生物降 解性和血中滯留性兩者，而且對藥物從胞內體向細胞質內的釋放有效。
[0010] 另外，報道了 ：作為來自多糖的藥物載體，引入有膽留醇基等的普魯蘭多糖衍生物 在水溶液中形成納米尺寸的微粒，具有作為與疏水性低分子、肽、蛋白質等形成復合物的主 分子的功能（非專利文獻4)。通過對攝取蛋白質后的該普魯蘭多糖衍生物進行熱力學評價 可知，被攝取的蛋白質由于與普魯蘭多糖的羥基之間形成氫鍵而穩定化（非專利文獻5)。
[0011] 另外，還報道了羧基甲基纖維素（CMC)(專利文獻10)和引入有亞油酸的殼聚糖 (非專利文獻6)用作與蛋白質的復合物形成材料。進而，專利文獻11中，報道了一種包含 具有交聯基的透明質酸衍生物和具有疏水基的親水性多糖類衍生物的組合物，其中，具有 交聯基的透明質酸衍生物是通過在親水性多糖類衍生物的存在下，透明質酸或具有可交聯 基團的其衍生物的交聯形成反應而制備的。專利文獻14報道了，具有膽留醇基作為疏水基 的基團引入到透明質酸中的透明質酸衍生物通過在水中締合而形成微粒，從而形成與藥物 的復合物。
[0012] 現有技術文獻
[0013] 專利文獻
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[0015] 專利文獻2 :特開2001-81103號公報
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[0019] 專利文獻6 :國際公開W001/60412號小冊子
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[0021] 專利文獻8 :國際公開W092/20349號小冊子
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[0023] 專利文獻10 :國際公開第W02002/022154號
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