一種含有五羥黃酮衍生物活性成分的骨質疏松癥治療劑的制作方法

專利名稱：一種含有五羥黃酮衍生物活性成分的骨質疏松癥治療劑的制作方法
背景技術：
目前使用的用于骨質疏松癥的治療劑包括雌激素制劑、雄性促蛋白合成類固醇制劑、鈣補充劑、磷酸鹽制劑、氟化物制劑、異丙氧黃酮、維生素D3等。近年，已經開發出了用于骨質疏松癥的新型藥物，其中包括Merck公司(美國)在1995年開發的氨基雙膦酸酯(Aminobisphosphonate)和Eli Lilly公司(美國)在1997年開發的在選擇性雌激素受體調節劑(SERM)中發揮作用的雷洛昔芬(Raloxifene)。
上述骨質疏松癥治療劑主要是雌激素物質，已知雌激素能夠導致如癌癥、膽石癥和血栓癥等不良副作用。由于骨質疏松癥的治療中不可避免地長期給藥，因此始終存在著開發出即使長期給藥也具有高度安全性的能夠替代雌激素的新型有效藥物的需求。
據報道，植物雌激素，如大豆異黃酮可作為雌激素的替代品。1946年首次報道了在檢驗三葉草病的成因的過程中發現的植物雌激素，三葉草病由以紅三葉草(Trifolium subterraneum var.Dwalganup)為食的綿羊高發(高于30％)不孕而命名。三葉草病的起因被證實為一種含在植物中的類似雌激素的異黃酮，因此，植物中含有的這種化合物被命名為“植物雌激素”。此后報道的作為植物雌激素的化合物包括異黃酮化合物，如大豆黃酮、染料木黃酮、芒柄花素和鷹嘴豆素甲；香豆甾烷(coumestan)化合物，如香豆雌酚；木酚素化合物，如腸內酯和酚化合物，如腸二醇。此類植物雌激素主要以糖苷配基、6′-氧-乙酰基葡糖苷或6′-氧-丙二酰基葡糖苷的形式存在，大豆黃酮和染料木黃酮以7-氧-葡糖苷的形式存在。在上述化合物中，已知葡糖苷被腸細菌和胃酸水解并以糖苷配基的形式吸收，糖苷配基是一種游離的異黃酮。研究表明，上述植物雌激素發揮的作用與動物雌激素類似。即，植物雌激素通過與雌激素受體結合抑制乳腺癌細胞的增殖并被報道作為雌激素的替代品用于心血管疾病和在絕經期后的女性中出現的其他癥狀的治療。但是，由于藥效不充分并且需要高成本地從天然產品中分離和純化，所述的植物雌激素沒有廣泛地用于治療和預防骨質疏松癥。
在這種情況下，有充分的理由開發和探索用于治療和預防骨質疏松癥的安全有效的可選擇的化合物，并且能夠以經濟的方式制備此類化合物。
因此，本發明的一個主要目的是提供一種骨質疏松癥的治療劑，該治療劑含有五羥黃酮衍生物活性成分。本發明的詳細描述本發明提供了一種骨質疏松癥的治療劑，該治療劑含有由下列通式(I)所代表的五羥黃酮衍生物活性成分和可藥用的載體 其中，R1是龍膽三糖、吡喃型葡萄糖、氧-呋喃型阿拉伯糖、氧-二吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型半乳糖、氧-半乳糖苷-沒食子酸鹽、氧-龍膽二糖、氧-吡喃型葡萄糖、氧-葡糖苷酸、氧-新橙皮糖、氧-吡喃型鼠李糖、氧-蘆丁糖、氧-槐糖、氧-吡喃型木糖、OCH3、OH、鼠李龍膽二糖、鼠李葡萄糖或硫酸酯；R2是OH或氧-吡喃型葡萄糖；R3是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型葡糖醛酸或吡喃型葡萄糖；R4是OCH3或OH；及R5是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖或氧-葡萄糖。
在由通式(I)所代表的五羥黃酮衍生物中，將已知的化合物分類如下(i)通式I的衍生物的組，其中R2至R5是OH，R1不同，包括當R1是OH時的五羥黃酮、當R1是氧-α-L-呋喃型阿拉伯糖時的扁蓄苷、當R1是氧-吡喃型阿拉伯型糖時的古佳苷(guiajaverin)、當R1是氧-β-D-吡喃型半乳糖時的金絲桃苷、當R1是氧-β-D-吡喃型半乳糖時的異金絲桃苷、當R1是氧-吡喃型葡萄糖時的異槲皮苷、當R1是氧-[β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L吡喃型鼠李糖時的麥芽類糖苷(multinoside)A、當R1是(6-氧-乙酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖時的麥芽類糖苷(multinoside)A醋酸酯、當R1是氧-α-L吡喃型鼠李糖時槲皮苷、當R1是氧-β-D-蘆丁糖時的蘆丁、當R1是氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖時的五羥黃酮-3-氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、當R1是氧-(6″-氧-沒食子酰基)-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-(6″-氧-沒食子酰基)-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-(6-氧-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖時的五羥黃酮-3-氧-(6-氧-對香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、當R1是氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖時的五羥黃酮-3-氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、當R1是氧-[2″-氧-6-氧-對(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖時的五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-對(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖苷、當R1是氧-[6-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-[6-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型鼠李糖苷、當R1是氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-D-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-β-D-二吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-β-D-二吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-β-D-半乳糖苷-2″-沒食子酸時的五羥黃酮-3-氧-β-D-半乳糖苷-2″-沒食子酸鹽、當R1是氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型半乳糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖、當R1是氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-β-D-葡糖苷酸時的五羥黃酮-3-氧-β-D-葡糖苷酸、當R1是氧-β-D-吡喃型木糖時的五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型木糖苷、當R1是氧-二吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-二吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-龍膽二糖時的五羥黃酮-3-氧-龍膽二糖苷、當R1是氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖時的五羥黃酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖苷、當R1是氧-新橙皮糖時的五羥黃酮-3-氧-新橙皮糖苷、當R1是氧-槐糖時的五羥黃酮-3-氧-槐糖苷、當R1是龍膽三糖時的五羥黃酮-3-龍膽三糖苷、當R1是OCH3時的五羥黃酮-3-甲基醚、當R1是鼠李龍膽二糖時的五羥黃酮-3-鼠李龍膽二糖苷、當R1是鼠李葡萄糖時的五羥黃酮-3-鼠李葡萄糖苷和當R1是硫酸酯時的五羥黃酮-3-硫酸酯；(ii)通式(I)的衍生物的組，其中R1是-OH，R2至R5中的三個官能團是-OH，剩余的一個官能團不同，包括當R4是OCH3時的異鼠李黃素、當R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的棉花黃苷、當R3是OCH3的鼠李黃素、當R2是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-5-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R3是氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸時的五羥黃酮-7-氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸苷和當R5是氧-葡萄糖時的繡線菊糖苷(spireaoside)；(iii)通式(I)的衍生物的組，其中R1至R5中的三個官能團是OH，其余的二個官能團不同，包括當R3和R4是OCH3時的甲基鼠李黃素、當R4和R5是OCH3時的五羥黃酮-3′，4′-二甲基醚、當R1和R4是OCH3時的五羥黃酮-3，3′-二甲基醚、當R1和R3是OCH3時的五羥黃酮-3，7-二甲基醚、當R1是氧-[2″-氧-(6氧-對香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-(6-氧-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-[2″-氧-6氧-對(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-p-(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-蘆丁糖且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-蘆丁糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-α-L-吡喃型半乳糖且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-α-L-吡喃型半乳糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-槐糖并且R3是氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-3-氧-槐糖苷、當R1是氧-吡喃型半乳糖且R3是氧-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-吡喃型半乳糖基-7-氧-二吡喃型葡萄糖苷、當R1是氧-吡喃型葡萄糖且R3是氧-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-氧-吡喃吡喃型葡萄糖基-7-二吡喃型葡萄糖苷、當R1是吡喃型葡萄糖且R3是吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3，7-二吡喃型葡萄糖苷、當R1是龍膽二糖且R3是吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3-龍膽二糖基-7-吡喃型葡萄糖苷，和當R1和R5均為氧-β-D-吡喃型葡萄糖時的五羥黃酮-3，4′-二-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷；及(iv)通式(I)的衍生物的組，其中三個以上的官能團不同，包括當R1、R3和R5是OCH3且R2和R4是OH時的五羥黃酮-3，4′，7-三甲基醚和當R1、R3、R4和R5是OCH3且R2是OH時的五羥黃酮-3，3′，4′，7-四甲基醚。
上述通式(I)中的R1至R5基團具有相同的OH基的五羥黃酮是一種在4000多種天然植物中發現的酚化合物并且是一種已知的植物雌激素。它的分子式是C15H10O7，具有共振結構，分子量為302.33克/摩爾，在1936年測定出化學結構后也被稱為維生素P。五羥黃酮是一種蘆丁，一種其中的糖通過β鍵連接的糖苷并且廣泛地分布在植物中，如三葉草花、美洲豚草的花粉以及多種植物的果殼和莖中，在洋蔥、羽衣甘藍、花莖甘藍、萵苣、蕃茄和蘋果中也有分布。已經證實五羥黃酮不但在維持毛細血管壁的完整性和毛細血管抵抗中發揮重要的作用(見Gabor等，生物學和醫學中的植物類黃酮II生物化學、細胞學和醫學的性質(Plant Flavonoids in Biology and Medicine IIBiochemical，Cellular，and Medical Properties)，2801-15，1988；Havsteen等，生化藥理學(Biochemical Pharmacology)，321141-1148，1983)而且具有抗氧化活性、維生素P活性、紫外線吸收活性、抗高血壓活性、抗心律失常活性、抗炎癥活性、抗過敏活性、抗膽固醇活性、對肝臟毒性的抑制活性以及對不孕的治療效果，因此，可以預期在食物、治療和藥物產品以及化妝品中廣泛應用五羥黃酮。但是，沒有關于將五羥黃酮用于預防和治療骨質疏松癥的報道。
下文將說明一種含有五羥黃酮衍生物活性成分的本發明的骨質疏松癥治療劑。
為探求五羥黃酮衍生物對成骨細胞和破骨細胞的增殖效果，本發明將五羥黃酮的效果與已知用于治療骨質疏松癥的有效試劑植物雌激素染料木黃酮的效果進行了對比了，并發現五羥黃酮在活化成骨細胞增殖、提高堿性磷酸酶活性和抑制破骨細胞增殖方面比染料木黃酮具有更好的效果。
而且，在切除卵巢的小鼠中發現，給藥五羥黃酮衍生物不會帶來激素水平的變化，證實了五羥黃酮是一種不會導致子宮肥大的安全的試劑，子宮肥大是目前作為骨質疏松癥治療劑使用的雌二醇的不良副作用。而且，在增加小梁的骨面積易于劇烈變化的脛骨的小梁骨面積方面，五羥黃酮也被證實比雌二酮更有效，五羥黃酮對造血功能和免疫系統沒有不良的副作用。
因此，基于上述結果，發現本發明的五羥黃酮衍生物不但比目前使用的用于活化成骨細胞的增殖和抑制破骨細胞的增殖的植物雌激素染料木黃酮具有更好的效果，而且具有更小的副作用，對激素水平帶來很小的變化并且對造血功能和免疫系統沒有不良影響，證實了五羥黃酮衍生物作為骨質疏松癥治療劑或預防劑的用途。劑型可以將所述的對骨質疏松癥的治療具有優良效果的五羥黃酮衍生物與可藥用的賦形劑混合制備用于口服或不經腸胃給藥的藥物劑型，如片劑、膠囊、軟膠囊、液體、軟膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑或注射劑，其中的賦形劑包括粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙基纖維素等，崩解劑，如羧甲基纖維素鈣、甘醇酸酯淀粉鈉等，稀釋劑，如玉米淀粉、乳糖、大豆油、結晶纖維素、甘露醇等，潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉等，甜味劑，如蔗糖、果糖、山梨糖醇、天冬甜素等，穩定劑，如羧甲基纖維素鈉、α-或β-環糊精、維生素C、檸檬酸、白蠟等，防腐劑，如對羥甲基苯甲酸鹽、對羥丙基苯甲酸鹽、苯甲酸鈉等以及芳香劑，如乙基香蘭素、掩蔽調味劑、香味薄荷醇、香草調味劑等。而且，為增強預防和治療骨質疏松癥的療效，可以向制劑中加入鈣或維生素D3。為不經腸胃給藥本發明的藥物制劑，可以使用皮下、靜脈內、肌肉內或腹膜內注射。為不經腸胃給藥，可以使五羥黃酮衍生物與穩定劑或緩沖劑在水中混合制成溶液或懸浮液，可以將溶液或懸浮液制成安瓿或管形瓶的單次劑量劑型。劑量本發明用于骨質疏松癥的治療劑中的五羥黃酮的有效量為2至20mg/kg，優選8-12mg/kg，根據患者的年齡、性別、嚴重程度、給藥方式或預防的目的，每天可以向患者給藥1次以上。安全性文獻(見，M.Sullivan等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，77269，1951)中已經報道了本發明的五羥黃酮衍生物的毒性，對于對小鼠口服給藥和腹膜內給藥并且口服給藥的五羥黃酮的LD50低于160mg/kg的情況，證實五羥黃酮是安全的。在本發明中，檢查了五羥黃酮對肝臟、腎臟、大腦、子宮、皮膚和脛骨的副作用，結果表明肝臟、腎臟、大腦、皮膚和脛骨的重量不受影響，而且，給藥五羥黃酮沒有觀察到目前使用的治療劑所發生的子宮肥大的副作用，證實作為激素制劑的五羥黃酮衍生物可以作為骨質疏松癥的治療劑安全地使用。
下列實施例將進一步說明本發明，實施例不應被視為限制本發明的范圍。實施例1五羥黃酮對成骨細胞增殖的影響為分析五羥黃酮對成骨細胞增殖的影響，使用了人類類似成骨細胞的細胞系Saos-2并使用作為骨質疏松癥治療劑而被廣泛研究的植物雌激素染料木黃酮作為對比試劑。實施例1-1選擇和培養成骨細胞從附屬于漢城國立大學醫學院癌癥研究所(Cancer ResearchInstitute of School of Medicine，Seoul National University)的韓國細胞系庫(Korean Cell Line Bank)獲得與成骨細胞具有類似性質的Saos-2細胞系。
將Saos-2細胞接種在一個用10％(v/v)FBS，100單位/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素補充的RPMI 1640培養基(Gibco BRL，美國)中并在37℃，5％(v/v)CO2氣氛和飽和濕度條件下，在培養箱中長成單細胞層。每周向培養物中補充2至3次新鮮的培養基并使用0.25％(w/v)胰蛋白酶每周傳代培養1次。實施例1-2取決于試劑濃度的細胞增殖將Saos-2細胞分配在96孔的板(20,000細胞/孔)中并加入在1％DMSO中的五羥黃酮至最終濃度為10-2至10-9mg/ml，每個濃度6個孔。使用不含五羥黃酮的細胞作為空白組，使用以不同濃度的作為骨質疏松癥治療劑被研究的染料木黃酮處理的細胞作為對比組。細胞在37℃下在培養箱中生長3天，在加入MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物，三唑基藍)至0.05mg/ml的濃度后，在相同的條件下再培養4小時。然后，將與活細胞的數量成比例的紫色甲溶解在DMSO中并使用酶聯免疫吸附(ELISA)讀數器在550nm測量光密度(OD)。
通過計算加入五羥黃酮的孔的OD與空白孔的OD的比例計算細胞增殖率(％)，其中使用以相同濃度的五羥黃酮處理的6個孔的OD的平均值(見表1)。
細胞增殖率(％)＝{(以五羥黃酮處理的孔在550nm的OD的平均值-空孔在550nm的OD的平均值)/空白孔在550nm的OD的平均值}×100實施例1-3堿性磷酸酶(ALP)活性分析由于成骨細胞具有細胞特異的堿性磷酸酶活性，按照如下方式評價本發明的五羥黃酮對成骨細胞中的ALP活性的影響所使用的細胞的數量、測試試劑的濃度和培養條件與實施例1-2的MTT實驗相同并且在溫育3天后收獲細胞。使用染料木黃酮作為對比試劑。通過分析由對硝基苯基磷酸酯水解為對硝基苯酚和磷酸酯而導致的在405nm的OD的變化評價ALP活性(見表1)。
表1五羥黃酮對成骨細胞增殖的影響
*p＜0.05**p＜0.01如上表1所示，在使用MTT方法的細胞增殖實驗中，與沒有使用試劑處理的空白細胞相比，使用濃度在1×10-9至1×10-3mg/ml范圍內的不同濃度的五羥黃酮處理的細胞沒有表現出任何不同，而在1×10-2mg/ml濃度，五羥黃酮表現出是空白細胞增殖的109％的最大細胞增殖效果(p＜0.01)。另一方面，對比試劑染料木黃酮在1×10-9mg/ml的濃度為91％(p＜0.05)，在1×10-6mg/ml濃度為90.5％(p＜0.01)，在1×10-3mg/ml的濃度為86％(p＜0.01)以及在1×10-2mg/ml濃度為66％(p＜0.01)，這意味著染料木黃酮對成骨細胞的增殖具有抑制效果而不是促進效果。
在分析ALP活性的實驗中，在1×10-6mg/ml的濃度，五羥黃酮表現出是空白ALP活性的127％的最大ALP活化效果(p＜0.01)，而在1×10-4mg/ml的濃度，染料木黃酮表現出121％的最大ALP活化效果，表明本發明的五羥黃酮的ALP活化效果比染料木黃酮的ALP活化效果高約100倍。因此，本發明的五羥黃酮在促進成骨細胞增殖和活化ALP活性方面比近年被作為骨質疏松癥治療劑而廣泛研究的染料木黃酮更有效。實施例2五羥黃酮對破骨細胞增殖的效果為研究五羥黃酮是否對破骨細胞的增殖具有抑制效果，按照下文進行實驗。實施例2-1破骨細胞的選擇和培養以缺鈣飲食(美國俄亥俄州ICN生物醫學公司(ICN Biomedicals，Inc.))飼養ICR小鼠(韓國化學技術研究所(Korea Research Institute ofChemical Technology)韓國大田)4周，活化破骨細胞。避免周圍肌肉組織的污染摘除缺鈣小鼠的左右脛骨和股骨。將在清潔的工作臺上分類并分別置于冰上的股骨和左右脛骨加入到含有100μg/ml鏈霉素的α-MEM中，然后分別充分震蕩，將破骨細胞提取到培養基中。在置于冰上5分鐘后，將細胞懸浮液在800xg離心分離3分鐘，然后將細胞球粒重新懸浮到用10％FBS，100μg/ml鏈霉素和100單位/ml青霉素補充的α-MEM營養培養基中。將細胞懸浮液分配至細胞數為3.5×106/孔的24孔板中。實施例2-2取決于五羥黃酮濃度的細胞增殖向上述實施例2-1所獲得的破骨細胞中加入五羥黃酮，獲得1×10-8至1×10-2mg/ml的濃度。第二天，使用可商購的試劑盒(美國Sigma化學公司)對細胞進行抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP)染色，然后計數破骨細胞，破骨細胞是TRAP-陽性的多核細胞(MNC)，可通過在一個染為紅色的細胞中多于三個細胞核判斷(見表2)。
表2五羥黃酮對破骨細胞增殖的效果
*p＜0.05，**P＜0.01如上表2所示，雖然濃度在1×10-8至1×10-4mg/ml之間的五羥黃酮對破骨細胞的增殖具有很小的抑制效果，但濃度在1×10-3mg/ml和濃度在1×10-2mg/ml的五羥黃酮的細胞數量分別是空白組細胞數量的61％(p＜0.05)和25％，表明五羥黃酮對破骨細胞的增殖具有顯著的抑制效果。
基于實施例1和2的結果，清楚地證實了五羥黃酮是一種用于骨質疏松癥的潛在的治療劑，在1×10-2mg/ml的濃度下，五羥黃酮對成骨細胞的增殖具有促進效果，對破骨細胞的增殖具有抑制效果。實施例3五羥黃酮對切除卵巢的小鼠的影響使用絕經期后發生的I型骨質疏松癥的模型動物，雌性SD(Sprague-Dawley)小鼠評價五羥黃酮的藥效。使用從韓國化學技術研究所獲得的體重為200至300g的雌性小鼠(10周齡)作為實驗動物。通過包括下列步驟的程序進行實驗切除卵巢；向每組小鼠給藥試劑；在切除卵巢后的特定天數殺死小鼠并進行包括稱量體重、檢查內臟器官、測量小梁的骨面積、全部血細胞計數和血漿的生化分析在內的分析。實施例3-1切除卵巢和給予試劑按照下文所述除了假手術組(正常組)以外，切除對照組和實驗組小鼠的卵巢通過向左右下肢的股骨肌肉進行肌肉內注射5mg/100g氯胺酮(Ketamin，韓國Yuhan公司)和1mg/100g甲苯噻嗪(韓國BeyerKorea)使雌性小鼠全身麻醉，然后刮掉下腹部區域的毛，在臥位用Potadin液體(碘，韓國Samil Pharm.有限公司)對手術區域消毒，在無菌條件下，在中間切開大約2cm的腹部皮膚、腹部肌肉和腹膜，使用滅菌的鑷子使卵巢暴露，然后在使用絲線結扎輸卵管后，切除左右卵巢。接著，腹膜內注射0.3ml抗生素(Sulfaforte-4，韓國Yoonee化學有限公司)以防止感染，然后用絲線或尼龍線縫合腹膜、腹部肌肉和皮膚。
利用假手術組比較在空白組中僅僅由于切除卵巢所導致的變化，假手術組是進行卵巢切除小鼠的外科手術但不切除卵巢的動物，空白組是切除了卵巢但不給予試劑的動物。利用空白組對比在實驗組中由于給予試劑而導致的變化，實驗組是切除了卵巢并給予試劑的動物。
當給予實驗試劑時，在給藥前和給藥后的特定期間，使用導管(B.D公司24G)從尾部靜脈中取1.5ml血樣并進行全部血細胞計數(Coulter公司JT)和血漿生化分析(Crone公司Airon 200)。在尸體解剖過程中，從尾部的腔靜脈中取血樣并進行上述分析。然后，冷凍保存每個樣品用于測量小梁的股骨骨面積和檢查內臟器官。
手術后1周，給假手術組和空白組小鼠腹膜內注射10％的Tween80溶液，以1μg/kg/天的濃度給E2組小鼠注射17β-雌二醇，以10mg/kg/天的濃度給實驗組動物注射五羥黃酮或染料木黃酮9周，每周稱量每組小鼠的體重1次。在給藥期間，每周取血樣1次。在給藥9周后，使用肝素處理抽取全部血液。在全部血細胞計數(CBC)后，以3,000轉/分鐘離心分離20分鐘以獲得血漿，在-70℃保存血漿至使用。為測量骨的礦物質密度，摘除脊柱腰段L5和L6和右脛骨并分別保存在4％(v/v)的福爾馬林溶液中。實施例3-2取決于給藥五羥黃酮的體重變化在手術后10周，每周稱量1次假手術組、用17β-雌二醇處理的E2組和分別用五羥黃酮和染料木黃酮處理的實驗組的小鼠的體重(見表3)。
表3取決于給藥的體重變化的測量
*p＜0.05，**p＜0.01，與手術前相比#p＜0.05，##p＜0.01，與空白組相比如表3所示，假手術組的體重在手術后3周開始增加(p＜0.05)，而空白組的體重在手術后2周開始增加(p＜0.01)。即，與假手術組相比，空白組表現出更快的體重增長并且在給藥雌二醇后，此種體重的增加被減慢，手術后20周，與空白組相比，E2組表現出更慢的體重增加(p＜0.05)。同時，分別以10mg/kg/天的濃度給藥植物雌激素五羥黃酮或染料木黃酮的實驗組即使在切除卵巢后也表現出與空白組類似的體重的快速增加。因此，沒有發現給藥五羥黃酮會給體內的激素水平帶來有意義的變化。實施例3-3五羥黃酮使內臟器官重量的變化為查明五羥黃酮對實驗動物內臟器官的影響，在手術后9周，切除以實驗試劑給藥的實驗動物的肝臟、腎臟、大腦、子宮、皮膚和脛骨并測量每個器官的凈重(見表4)表4給藥后內臟器官的重量變化
**p＜0.01
如表4所示，對于肝臟、腎臟、大腦、脛骨和皮膚的重量，正常的假手術組、切除卵巢的空白組以及實驗組之間沒有表現出區別。但是，對于受卵巢所分泌的雌激素影響的子宮的重量，與假手術組相比，切除卵巢的空白組表現出顯著的增加(p＜0.01)，并且與空白組相比，在切除卵巢后給藥E2抑制了子宮的萎縮(p＜0.01)。另一方面，給藥植物雌激素五羥黃酮或染料木黃酮沒有導致子宮重量的變化，表明目前作為骨質疏松癥的治療劑使用的E2具有如子宮肥大的副作用，而五羥黃酮可以作為骨質疏松癥的治療劑安全地使用，不會產生不良的副作用。實施例3-4五羥黃酮對小梁骨面積的改變按照下文所述測量從使用不同的試劑處理9周的每組小鼠切除的腰椎和脛骨的小梁骨面積(TBA)即，使用定量圖象分析系統的數字化裝置(Wild Leitz公司)，通過繪出小梁的輪廓在計算機顯示器上獲得每個小梁的圖象，然后使用計算機計算位于接近脛骨的生長板下面的面積為2×106μm2的矩形內的骨小梁的平均面積，其中矩形的寬度大約是生長板長度的2/3。而且，在獲得矩形內的骨小梁數量后，用平均面積乘以骨小梁的數量以獲得每個骨骼樣品的小梁骨面積，對其進行統計學分析(見表5)。
表5取決于給藥的脛骨的小梁骨面積的變化
*p＜0.05，**p＜0.01
如表5所示，對于脛骨，空白組的TBA是34.62×104μm2，該數值與正常的假手術組的85.55×104μm2相比明顯降低(p＜0.01)，表明骨質疏松癥已經在空白組中發生，通過使用E2、五羥黃酮或染料木黃酮處理，此種降低的TBA被分別再次增加至空白組TBA的148％、160％和138％，特別是五羥黃酮的情況，觀察到TBA的顯著增加(p＜0.05)。
使用與上述方法相同的方法測量從使用實驗試劑處理9周的動物中切除的腰椎的TBAs(見，表6)。
表6取決于給藥的腰椎的小梁骨面積的變化
*p＜0.05，**p＜0.01如表6所示，對于腰椎，空白組的TBA是67.53×104μm2，該數值與假手術組的93.70×104μm2相比降低(p＜0.01)，但是，通過使用E2、五羥黃酮或染料木黃酮處理，此種降低的TBA被分別再次增加至空白組TBA的132％(p＜0.01)、129％(p＜0.05)和128％(p＜0.05)，表明這些實驗試劑對由于切除卵巢而引起的TBA的降低具有抑制效果。特別地，在TBA易于顯著變化的脛骨中，五羥黃酮比目前作為骨質疏松癥的治療劑使用的E2表現出使TBA更顯著地增加，表明五羥黃酮是一種不會導致子宮肥大的更有效的治療劑，子宮肥大是E2所導致的不良副作用。實施例3-5全部血細胞計數為查明由于給藥試劑所導致的實驗動物的異常，測量反應身體狀況和異常的全部血細胞計數。即，為查明實驗小鼠的血細胞生成作用的變化，測量從手術前的小鼠以及手術后給藥10周的小鼠獲得的血液樣品中的紅血細胞計數、血紅蛋白(Hb)的濃度和紅細胞比容(Ht)，并查明免疫系統，如組織的發炎和壞死的變化，測量白細胞計數、淋巴細胞計數、單核細胞計數和粒細胞計數(見表7)。
表7取決于給藥的全部血細胞計數的變化
*p＜0.05，**p＜0.01
如表7所示，在所有組中，在手術前后RBC計數沒有表現出任何變化，血紅蛋白濃度和紅細胞比容在手術后降低。在五羥黃酮或染料木黃酮處理組中，在手術前后白細胞計數沒有表現出任何變化，但在假手術組和E2組中，手術后白細胞計數降低。而且，淋巴細胞和粒細胞計數僅在E2組中顯著降低，在所有組中，單核細胞計數沒有變化。因此，發現五羥黃酮是一種不會干擾體內的造血功能和免疫系統的安全試劑。實施例3-6五羥黃酮引起的血漿的生化變化由于血液反應身體狀況，通過測量生化參數評價五羥黃酮在體內的安全性即，在手術前、手術后1周和手術后10周，取小鼠血樣，測量堿性磷酸酶(ALP)、鈣、無機磷酸鹽、血液尿素氮(BUN)、肌酸酐、總膽固醇、HDL-膽固醇和LDL-膽固醇(見表8)。
表8取決于給藥的血漿的生化參數變化
*p＜0.05，**p＜0.01，與空白組相比
#p＜0.05，##p＜0.01，與手術前相比$p＜0.05，$$p＜0.01，與手術1周后相比如表8所示，在所有組中，直接與骨骼的新陳代謝相關的ALP活性表現出隨年齡降低的傾向，特別地，在假手術組和染料木黃酮處理組中，手術后10周的小鼠表現出ALP活性的顯著降低，與手術前和手術后1周的小鼠相比，鈣濃度沒有變化。在空白組和染料木黃酮處理組中，與手術前的小鼠相比，手術后10周的小鼠的無機磷酸鹽的水平顯著降低。
雖然在所有組中，與蛋白質的新陳代謝和肌肉量相關的血液尿素氮的水平均維持在適當水平，但在所有組中，肌酸酐的水平均升高。
已知在絕經后的女性中升高的總膽固醇水平在所有組中均升高，但在假手術組的升高較低。雖然在所有組中，HDL-膽固醇的水平均隨時間而降低，但在正常的假手術組以及切除卵巢組中發現LDL-膽固醇的水平隨時間而升高。
因此，發現本發明的五羥黃酮是一種用于骨質疏松癥的有效的治療和預防劑。實施例4五羥黃酮制劑的劑型糖精.....................................0.8g糖.......................................25.4g甘油.....................................8.0g芳香劑...................................0.04g乙醇.....................................4.0g山梨酸...................................0.4g蒸餾水...................................適量五羥黃酮鹽酸化物的類黃酮衍生物............1gNaCl......................................0.6g抗壞血酸..................................0.1g蒸餾水....................................適量如上文的明確說明和證明，本發明提供了一種含有五羥黃酮衍生物活性成分的骨質疏松癥治療劑，其中五羥黃酮衍生物能夠有效地促進成骨細胞的增殖和抑制破骨細胞的增殖。本發明的五羥黃酮衍生物可以在實踐中用于骨質疏松癥的治療和預防，因為它能夠比骨質疏松癥的常規治療劑更有效地抑制破骨細胞的增殖和促進成骨細胞的增殖，能夠顯著地增加小梁的骨面積，不會改變體內的激素水平和對造血功能和免疫系統產生副作用。
權利要求
1.一種用于骨質疏松癥的治療劑，所述的治療劑含有由下列通式(I)所代表的五羥黃酮衍生物活性成分和可藥用的載體 其中，R1是龍膽三糖、吡喃型葡萄糖、氧-呋喃型阿拉伯糖、氧-二吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型半乳糖、氧-半乳糖苷-沒食子酸鹽、氧-龍膽二糖、氧-吡喃型葡萄糖、氧-葡糖苷酸、氧-新橙皮糖、氧-吡喃型鼠李糖、氧-蘆丁糖、氧-槐糖、氧-吡喃型木糖、OCH3、OH、鼠李龍膽二糖、鼠李葡萄糖或硫酸酯；R2是OH或氧-吡喃型葡萄糖；R3是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖、氧-吡喃型葡糖醛酸或吡喃型葡萄糖；R4是OCH3或OH；及R5是OCH3、OH、氧-吡喃型葡萄糖或氧-葡萄糖。
2.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中的五羥黃酮衍生物是當通式(I)中的R2、R3、R4和R5為-OH時，通式(I)所代表的下列化合物五羥黃酮、扁蓄苷、古佳苷、金絲桃苷、異金絲桃苷、異槲皮苷、麥芽類糖苷A、麥芽類糖苷A醋酸酯、槲皮苷、蘆丁、五羥黃酮-3-氧-(2″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羥黃酮-3-氧-(6″-氧-沒食子酰基)-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-(6-氧-對香豆酰基)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羥黃酮-3-氧-D-吡喃型葡萄糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-4)-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-對(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基]-α-L-吡喃型鼠李糖苷、五羥黃酮-3-氧-[6-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基-β-(1-4)-吡喃型鼠李糖苷、五羥黃酮-3-氧-[α-L-吡喃型鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基(1-4)α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)β-D-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-2)]-[β-吡喃型葡萄糖基-(1-6)]-β-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-[α-吡喃型鼠李糖基-(1-4)-α-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-2)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-β-D-二吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-β-D-半乳糖苷-2″-沒食子酸鹽、五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基-(1-3)-α-L-吡喃型鼠李糖基-(1-6)-β-D-吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-β-D-葡糖苷酸、五羥黃酮-3-氧-β-D-吡喃型木糖苷、五羥黃酮-3-氧-二吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-龍膽二糖苷、五羥黃酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基吡喃型半乳糖苷、五羥黃酮-3-氧-新橙皮糖苷、五羥黃酮-3-氧-槐糖苷、五羥黃酮-3-龍膽三糖苷、五羥黃酮-3-甲基醚、五羥黃酮-3-鼠李龍膽二糖苷、五羥黃酮-3-鼠李葡萄糖苷和五羥黃酮-3-硫酸酯。
3.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中的五羥黃酮衍生物是當通式(I)中的R1為-OH并且R2、R3、R4和R5中的三個官能基團是-OH時，通式(I)所代表的下列化合物異鼠李黃素、棉花黃苷、鼠李黃素、五羥黃酮-5-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-7-氧-β-D-吡喃型葡糖醛酸苷和繡線菊糖苷。
4.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中的五羥黃酮衍生物是當通式(I)中的R1、R2、R3、R4和R5中的三個官能基團是-OH時，通式(I)所代表的下列化合物鼠李黃素、五羥黃酮-3′，4′-二甲基醚、五羥黃酮-3，3′-二甲基醚、五羥黃酮-3，7-二甲基醚、五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-(6-氧-對香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-[2″-氧-6-氧-對(7″″-氧-β-D-吡喃型葡萄糖基)香豆酰基-β-D-吡喃型葡萄糖基)-α-L-吡喃型鼠李糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-蘆丁糖苷-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-α-L-吡喃型阿拉伯糖基-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-7-氧-β-D-吡喃型葡萄糖苷-3-氧-槐糖苷、五羥黃酮-3-氧-吡喃型半乳糖基-7-氧-二吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-氧-吡喃型葡萄糖基-7-二吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3，7-二吡喃型葡萄糖苷、五羥黃酮-3-龍膽二糖基-7-吡喃型葡萄糖苷或五羥黃酮-3，4′-二-β-D-吡喃型葡萄糖苷。
5.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中的五羥黃酮衍生物是五羥黃酮-3，4′，7-三甲基醚或五羥黃酮-3，3′，4′，7-四甲基醚。
6.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體選自由聚乙烯吡咯烷酮和羥丙基纖維素所組成的組。
7.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由羧甲基纖維素鈣和甘醇酸酯淀粉鈉所組成的組的崩解劑。
8.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由玉米淀粉、乳糖、大豆油、結晶纖維素和甘露醇所組成的組的稀釋劑。
9.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由硬脂酸鎂和滑石粉所組成的組的潤滑劑。
10.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由蔗糖、果糖、山梨糖醇和天冬甜素所組成的組的甜味劑。
11.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由羧甲基纖維素鈉、α-或β-環糊精、維生素C、檸檬酸和白蠟所組成的組的穩定劑。
12.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由對羥甲基苯甲酸鹽、對羥丙基苯甲酸鹽和苯甲酸鈉所組成的組的防腐劑。
13.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中可藥用的載體是選自由乙基香蘭素、掩蔽調味劑、香味薄荷醇和香草調味劑所組成的組的芳香劑。
14.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中的治療劑是選自由片劑、膠囊、軟膠囊、液體、軟膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑和注射劑所組成的組的口服或不經腸胃給藥的藥物劑型。
15.權利要求1所述的用于骨質疏松癥的治療劑，其中還包括鈣和維生素D3。
全文摘要
本發明涉及一種含有五羥黃酮衍生物活性成分的骨質疏松癥治療劑。本發明的五羥黃酮衍生物可以在實踐中用于骨質疏松癥的治療和預防,因為它能夠比骨質疏松癥的常規治療劑更有效地抑制破骨細胞的增殖和促進成骨細胞的增殖,能夠顯著地增加小梁的骨面積,而不會改變體內的激素水平和對造血功能和免疫系統產生副作用。
文檔編號C07H17/07GK1383381SQ01801856
公開日2002年12月4日 申請日期2001年3月9日 優先權日2000年8月14日
發明者金貞淑, 河惠景, 宋啟用 申請人:韓國韓醫學研究院