Cab分子的制作方法

專利名稱：：Cab分子的制作方法
技術領域：
：本發明涉及CAB分子，針對CEA的ADEPT構建物，以及它們在診斷和治療中的用途。
背景技術：
：傳統的治療性分子在患者的身體各處自由地循環，直到它們被肝臟或者其它清除機制從循環中去除。這些非靶向的分子，在廣泛的細胞和組織中，無差別地產生其藥理作用。這可能對患者引起嚴重的副作用。當該分子是用來殺死癌細胞的高毒性的化學治療劑時，這個問題尤其突出，此時治療窗(therapeuticwindow)可能很小，治療窗為有效劑量(efficaciousdose)和有害劑量(injuriousdose)或者甚至致死劑量之間的差值。因此，近些年來，研究者已經試圖開發特異性地影響患者的細胞、組織或器官的特定子集的化合物。通過優先結合于待治療組織呈現的特定靶分子，多數此類化合物靶向特定的組織。通過優先地影響靶細胞、組織或器官，有效劑量和有害劑量之間的差額可以被增加，這同樣也增加了治療方案成功的機會并減少了副作用的出現。利用優先結合的方法的一個形式是抗體導向酶-前體藥物療法(antibody-directedenzymeprodrugtherapy，ADEPT)。參見例如，Xu等，2001，ClinCancerRes.73314-24.；Denny，2001，EurJMedChem.36577-95。在ADEPT中，將抗體或抗體片斷(antibodyfragment)與能夠將前體藥物轉化成活性的細胞毒素劑(cytotoxicagent)的酶連接。對患者運用ADEPT偶聯物(ADEPTconjugate)，偶聯物集中到靶組織中。隨后，前體藥物被給與患者。所述前體藥物在患者整個體內循環，但由于它處在它的非活性的形式下，該前體藥物引起很小的副作用或不引起副作用。所述前體藥物由局部化的ADEPT偶聯物酶轉化成它的活性藥物形式。因為ADEPT偶聯物被局限于靶組織，所述前體藥物只有在靶組織的附近才能被活化。因此，遍布身體各處的活性藥物濃度相對較低，但在靶組織的附近產生出濃度相對較高的活性藥物，這允許藥物在希望的部位發揮它的療效，增大了毒素的治療窗(therapeuticwindow)。癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，“CEA”)由Gold和Freedman在J.Exp.Med.，121，439-462，(1965)中首先描述。多數結腸直腸癌和許多其它腫瘤表達CEA。CEA在腫瘤組織中高表達，在正常的器官中，特別是消化道中則以較低濃度被發現。發明簡述本發明涉及CAB分子，針對CEA的ADEPT構建物，以及它們在診斷和治療中的用途。本發明的第一個方面涉及包括修飾的氨基酸序列的CAB分子。在一個實施方案中，CAB分子具有SEQIDNO1中提出的未修飾序列。在一個實施方案中，CAB分子具有從SEQIDNO1中提出的氨基酸序列修飾得到的氨基酸序列，并且修飾發生在至少一個從下列位置中選出的位置100，102，104，105，107，163，165，166，184和226，其中位置編號根據圖1所示的SEQIDNO1。在優選的實施方案中，CAB分子包括發生在100位、184位和226位的修飾。在優選的實施方案中，CAB分子包括發生在100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位、184位和226位的修飾。在優選的實施方案中，CAB分子包括發生在100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位和226位的修飾。在優選的實施方案中，修飾選自下列中的至少一個T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D，其中位置的編號是根據圖1所示的SEQIDNO1。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.6分子，所述CAB1.6分子具有如下的修飾T100L、S184D和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子具有如下的修飾T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子具有如下的修飾T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括如圖25說明的CAB1.2(SEQIDNO1)、CAB1.6(SEQIDNO5)、CAB1.7(SEQIDNO6)或CAB1.13的scFV部分。在優選的實施方案中，CAB分子進一步包括β-內酰胺酶分子。在優選的實施方案中，CAB分子具有未修飾的氨基酸序列，或者具有從在SEQIDNO2中所說明的氨基酸修飾得到的氨基酸序列，并且修飾是在至少一個從下列位置中選出的位置上3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置編號根據圖2所示的SEQIDNO2。在優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在優選的實施方式中，修飾發生在265位和568位。在優選的實施方式中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、265位和568位。在優選的實施方式中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、226位、265位和568位。在優選的實施方案中，CAB分子具有這樣的修飾，即所述修飾包含至少一個從下面選出的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置編號根據如圖2所示的SEQIDNO2。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.2i分子，所述CAB1.2i分子包含如下的修飾K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包含CAB1.6分子，所述CAB1.6分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.6i分子，所述CAB1.6i分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D和S226D。在一優選的實施方案中，CAB包括CAB1.7i分子，所述CAB1.7i分子包括如下的修飾K30、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V和S226D。在一優選的實施方案中，CAB包括CAB1.13i分子，所述CAB1.13i分子包含如下修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S226D、K265A和S568A。在優選的實施方案中，CAB分子包括如圖25中闡明的CAB1.2(SEQIDNO2)或CAB1.2i，CAB1.6(SEQIDNO7)，CAB1.6i(SEQIDNO8)，CAB1.7(SEQIDNO9)，CAB1.7i(SEQIDNO10)，如圖25中闡明的CAB1.13，或者如圖25中提出的CAB1.13i。本發明的第二個方面涉及編碼在此闡明的CAB分子的核酸。本發明的第三個方面涉及對需要的對象進行治療，包括對對象施用如在此提供的CAB分子，以及作為CAB分子的底物的前體藥物。本發明的第四個方面涉及包含CAB分子的藥物組合物。附圖簡述圖1表示了一個未修飾CAB分子的6個CDR的氨基酸序列。位置編號從H1的第一個位置開始，如圖2A中所示的SEQIDNO2中所列示的。6個CDR的位置編號根據如圖1所示的SEQIDNO1，是如以下所述H126-35；H2，50-65；H3，99-109；L1，159-168；L2，184-190和L3，223-231。圖2提出CAB1分子(2A)的氨基酸序列和BLA(2B)的氨基酸序列。圖3提出了CAB1.6CDR(3A)和CAB1.7CDR(3B)的氨基酸。圖4提出了CAB1.6(4A)和CAB1.6i(4B)分子的氨基酸序列。圖5提出了CAB1.7(5A)和CAB1.7i(5B)分子的氨基酸序列。圖6呈示了涉及質粒pME27.1的詳圖。圖6A提出了質粒pME27.1的示意圖。Plac＝lac啟動子，PelB前導序列＝信號序列，CAB1scFv＝單鏈抗體，BLA＝β-內酰胺酶基因，CAT＝氯霉素乙酰轉移酶抗性基因，T7終止子＝終止子。圖6B顯示CAB1-scFv的序列、互補決定區(CDRs)和選擇用來進行組合誘變的突變。圖6C顯示pME27.1的核苷酸序列。圖6D顯示CAB1的氨基酸序列，其顯示了例如重鏈的序列、接頭的序列、輕鏈的序列和BLA的序列。圖7顯示結合作用檢測和SDSPAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)的結果。具體而言，圖7A顯示來自文庫NA05的變異體的結合作用；圖7B展示NA05文庫的穩定性CAB1-BLA變異體的SDSPAGE；圖7C顯示來自NA06的多個分離物(isolates)與CEA的結合作用。圖8顯示CAB1-scFv的vH和vL序列與公開的人抗體頻率分析進行的比較。具體而言，圖8A顯示在與人重鏈序列比對中，所測得的五種最豐富氨基酸的頻率。圖8B顯示在與人輕鏈序列比對中，所測得的五種最豐富氨基酸的頻率。圖9顯示NA08文庫的篩選結果。X軸顯示pH7.4下的結合作用，Y軸顯示pH6.5下的結合作用。被選擇用來進行進一步分析的克隆用方塊表示。圖10顯示是一個三維模型，具有被選擇出來用于進行組合誘變的位點。圖11顯示NA08變異體與固定化CEA的依賴于pH的結合。X軸顯示BLA活性，Y軸顯示CEA結合活性。變異體的名稱顯示在左上角。圖12提出CAB工程的概要。左邊的一列是蛋白質的名稱。中間的一列詳述了從前一行而來的累積性變化。右面的列提供每個突變的推定理由，如本文件的內容所提供的。例如，做出了從CAB1到CAB1.1的改變，用以增加蛋白質的總體穩定性，如在此提供的。如可從本列中看到的，其中做出改變也用以除了其他事項而外，增加分子的依賴于pH的結合作用，增加親和力和去除T-細胞表位。圖13顯示多種CAB1變異體與固定化CEA的結合。與CEA的結合(X軸)和BLA活性(Y軸)顯示，例如不同結合pH下的不同特性。圖14提出多種CAB1變異體與LS174T細胞的結合。顯示了針對LS174T的結合特性，實驗方案如在此描述的。同樣，在不同的pH下，可以觀察到不同的結合特性。圖15公開了相關序列如下圖15A公開了SW149.5蛋白的氨基酸序列；圖15B公開了CAB1.1蛋白的氨基酸序列；圖15C公開了CAB1基因的核苷酸序列；圖15D公開了CAB1.2蛋白的氨基酸序列；圖15E公開了CAB1.4CDRs的氨基酸序列；圖15F公開了CAB1.4CDRs的核苷酸序列；圖15G公開了整個CAB1.4基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15H公開了CAB1.4蛋白的氨基酸序列；圖15I公開了CAB1.6CDRs的核苷酸序列；圖15J公開了整個CAB1.6基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15K公開了整個CAB1.6i基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15L公開了CAB1.7CDRs的核苷酸序列；圖15M公開了整個CAB1.7基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15N公開了整個CAB1.7i基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15O公開了CAB1CDRs的核苷酸序列；圖15P公開了整個CAB1.2基因的核苷酸序列，包括BLA等；圖15Q公開了SW149.5CDRs的氨基酸序列；圖15R公開了SW149.5CDRs的核苷酸序列；圖15S公開了整個SW149.5的核苷酸序列，包括BLA等；圖15T公開了BLA的核苷酸序列；圖15U公開了CAB1.1的核苷酸序列。圖16顯示CAB1.1i和CAB1.13i在T1918荷瘤無胸腺小鼠(tumorbearingathymicmice)中的藥動學和組織分布。X軸顯示以小時為單位的時間；Y軸顯示BLA活性。圖17顯示的是，如實施例10中所述，在LS174TSCID模型中，當C-Mel或戊二酰-C-Mel在晚于CAB1.224小時施用時，其抗腫瘤活性，其中x軸是以天為單位的時間，y軸是腫瘤體積，以mm3為單位測量。圖18顯示的是，在LS174TSCID模型中，在CAB1.2給藥24小時后給予具有抗腫瘤活性的C-Mel和戊二酰C-Mel時的毒性-存活，如實施例10中所述的。x軸表示以天為單位的時間，y軸表示活著的小鼠的數目。圖19顯示的是，在LS174TSCID模型中，在CAB1.2給藥24小時后給予C-Mel和戊二酰C-Mel時的毒性-體重，如實施例10中所述的。x軸表示以天為單位的時間，y軸表示體重百分數。圖20顯示的是，與對照相比，聯合給予CAB1.2/前體藥物之后的動物體重的影響，如實施例12所述。x軸表示以天為單位的時間，y軸表示以克為單位的治療組重量。圖21圖示的是，與對照相比，聯合給予CAB1.2/前體藥物的存活情況。x軸表示以天為單位的時間，y軸表示存活動物的數目。圖22顯示的是與對照相比，聯合給予CAB1.2/前體藥物的功效，如實施例12所述。x軸表示的是以天為單位的時間，y軸表示以mm3為單位測量的腫瘤體積。各組如下第1組CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，18hr)；第2組CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，36hr)；第3組CAB1.2/C-Mel(1mg/kg，24hr)；第4組未治療的對照；第5組只給予CAB1.2(2.5mg/kg)；第6組只給予C-Mel；第7組梅爾法蘭(10mg/kg)；第8組P97ADEPT/C-Mel(2.5mg/kg，18hr)；第9組BLA/C-Mel(1.5mg/kg，18hr)。圖23顯示功效，其中x軸是天數，y軸表示以mm3為單位測量的腫瘤體積。圖24公開相關的序列如下圖24A公開CAB1.2i的氨基酸序列；圖24B公開CAB1.2i的核苷酸序列；圖24C公開CAB1.13i的氨基酸序列；圖24D公開CAB1.13i的核苷酸序列。圖25A和25B分別提出了CAB1.11i的氨基酸和核苷酸序列。如26顯示IHC(免疫組織化學)染色的結果，如實施例15所述。第1列表示案例的編號；第4列表示樣品病理學；第5列表示樣品診斷；第6列表示組織來源/發現部位；第7列表示H&E染色的結果，如實施例中所述；第8列表示針對對照，人細胞角蛋白的染色結果；第9-12列表示針對相關CAB的染色結果；第13列顯示無抗體染色結果。圖27顯示平均腫瘤體積(27A)和平均體重(27B)，如實施例16所述。x軸顯示時間，以天為單位計量，y軸分別表示以mm3為單位計量的腫瘤體積，以及體重變化的百分數。圖28顯示在不同的時間點上GC-Mel的血漿濃度。x軸表示以分鐘計量的時間，y軸表示濃度。圖29顯示腫瘤暴露于Mel的暴露比率。圖29A顯示腫瘤/血漿CG-Mel暴露比率，以x軸表示時間并以y軸表示腫瘤/血漿暴露比率。圖29B顯示的是腫瘤暴露于苯丙氨酸氮芥(也稱美法侖或梅爾法蘭(Melphalan))，柱指明了時間，y軸表示標準化劑量(normalizeddose)，如實施例中描述的。圖29C顯示GC-Mel給藥后苯丙氨酸氮芥腫瘤血漿比率，如在此描述的，柱表示時間，y軸表示腫瘤/血漿暴露比率。發明詳述除非另外定義，在此所用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域的普通技術人員所通常了解的含義相同的含義。盡管與在此描述的方法和材料相似或等價的任何方法和材料可以用于本發明的實踐或試驗中，還是對優選的方法和材料進行了描述。出于本發明的目的，下列術語的使用如下文所述。“CAB”分子應該是指與CEA靶或微靶(microtarget)結合的靶向劑(targetedagent)，其具有未修飾的或修飾的序列，并且它們的未修飾的序列包含SEQIDNO1或SEQIDNO2中闡明的氨基酸序列。SEQIDNO1提出本發明CAB分子的未修飾CDR部分的氨基酸序列，如圖1所示。SEQIDNO2提出包括BLA的CAB分子，如圖2所示，并且位置編號分別根據圖1和圖2中提出的SEQIDNO1和SEQIDNO2。CAB名稱的后面可跟隨數字，用以對本發明的修飾的特定組合進行命名。例如，如上面提出的，并且貫穿本申請余下的部分，CAB1.6指的是具有如下修飾的CAB分子T100L、S184D和S226D，其中位置編號根據SEQIDNO1；或者，具有如下突變的CAB分子K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D，其中位置編號根據SEQIDNO2。同樣，例如，CAB1.7i指的是具有如下修飾的CAB分子K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置編號根據如圖2所示的SEQIDNO2。“靶向劑(targetedagent)”是選擇性地與感興趣的微靶結合的化學實體(chemicalentity)。靶向劑的例子是抗體、肽和抑制劑。感興趣的是具有期望的催化活性的靶向酶(targetedenzyme)，它可以，以高親和性和選擇性，與一個或多個靶結構結合。當結合于靶標的時候，靶向酶保留其至少大部分活性。“結合部分(bindingmoiety)”是靶向劑(或ADEPT構建物，例如CAB分子)的一部分，其與微靶結合。結合部分可以包括CAB的一個以上的相鄰或不相鄰的區域。“活性部分(activemoiety)”是靶向劑(或者ADEPT構建物，例如CAB分子)的一部分，其賦予試劑功能性。活性部分可以包括例如CAB分子的一個以上的相鄰或不相鄰的區域。特別地，活性部分可為β-內酰胺酶。在此，術語“蛋白質(protein)”和術語“肽(peptide)”和“多肽(polypeptide)”可被替換使用，指的是包含兩個或更多個由肽鍵連接的氨基酸殘基的分子。術語“細胞(cell)”、“細胞系(cellline)”和“細胞培養物(cellculture)”可以替換地使用，所有這些名稱都包括子代。詞匯“轉化體(transformants)”或“轉化細胞(transformedcells)”包括原代的轉化細胞和得自該細胞的培養物，無論傳代數是多少。由于有意的或無意的突變，所有的子代在DNA內容(DNAcontent)上可能不是嚴格地一致。這樣的突變型子代被包括在轉化體的定義中該突變型子代具有的功能與在最初的轉化細胞中篩選的功能相同。細胞可為原核的或真核的。術語“寡核苷酸(oligonucleotide)”，如此處所用，被定義為包含兩個或更多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。確切的大小將取決于許多因素，這些因素又取決于寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可以通過任何合適的方法制備，包括例如對適當的序列進行克隆和限制，和直接化學合成，進行直接化學合成的方法諸如Narang等，1979，Meth.Enzymol.6890-99的磷酸三酯法(phosphotriestermethod)；Brown等，1979，Meth.Enzymol.68109-151的磷酸二酯法(phosphodiestermethod)；Beaucage等，1981，TetrahedronLett.221859-1862的二乙基亞磷酰胺法(diethylphosphoramiditemethod)；和美國專利號4,458,066的固相支持法(solidsupportmethod)，在此引入每種方法作為參考。Goodchild，1990，BioconjugateChemistry1(3)165-187中提供了合成方法的綜述，在此引入作為參考。術語“引物(primer)”，如此處所用，指的是當其被置于引發引物延伸的條件下時，能夠充當合成的起始點的寡核苷酸。引物延伸產物與核酸鏈互補，其合成在必需的四種不同的核苷三磷酸和DNA聚合酶的存在下，在合適的緩沖液中，在適宜的溫度下被引發。“緩沖液(buffer)”包括緩沖劑(buffer)、輔因子(諸如二價金屬離子)和鹽(用以提供適宜的離子強度)，其被調節為期望的pH值。雜交到基因序列的非編碼鏈(等價地，非編碼鏈的子序列(subsequence))上的引物在此稱為“上游(upstream)”或“正向(forward)”引物。與基因序列的編碼鏈雜交的引物在此稱為“下游(downstream)”或“反向(reverse)”引物。在本領域，具有相似側鏈的氨基酸殘基家族已被定義。這些家族包括具有堿性側鏈的氨基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側鏈的氨基酸(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)，具有非極性側鏈的氨基酸(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、半胱氨酸、甘氨酸)，具有β-分支的側鏈的氨基酸(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳族側鏈的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。在此使用通常的三字母或單字母氨基酸縮寫。等價的替換包括在權利要求的范圍中。本發明的肽、多肽和蛋白質可以包含一種或更多種的非典型氨基酸。非典型氨基酸包括但不限于普通氨基酸的D-異構體，α-氨基異丁酸，4-氨基丁酸(4-Abu)，2-氨基丁酸(2-Abu)，6-氨基己酸(Ahx)，2-氨基異丁酸(2-Aib)，3-氨基丙酸，鳥氨酸，正亮氨酸，正纈氨酸，羥脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，半胱磺酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，丙氨酸環己酯(cyclohexylalanine)，β-丙氨酸，氟代氨基酸，設計型氨基酸(designeraminoacid)，諸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸，以及通常的氨基酸類似物。術語“Ab”或“抗體(antibody)”指的是與目標抗原結合的多克隆和單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、人抗體、免疫球蛋白或抗體，或者抗體的功能性片斷。諸如此類的功能性實體的例子包括完整的抗體分子，抗體片段，諸如Fv、單鏈Fv、互補決定區(complementaritydeterminingregions，CDRs)、VL(輕鏈可變區)、VH(重鏈可變區)以及它們的任意組合，或者免疫球蛋白肽的其它任何能夠與目標抗原結合的功能部分(functionportion)。在這些例子中，該構建物具有如下的次序vL-(GGGGS)6-vH；然而，所述例子是非限制性的，所有vL和vH的次序都意圖被包括在本發明的范圍中。術語“前體藥物(前藥(prodrug))”指的是這樣的化合物它經由一個或多個酶學催化步驟轉化成活性化合物，該活性化合物具有相比前藥而增加的藥理學活性。前藥可以包括前原部分(pro-part)或非活性部分，以及藥物或活性藥物或可檢測部分(detectablemoiety)。任選地，前藥也含有連接物(linker)。例如，前藥可被酶切開以釋放活性藥物。可替換地，酶可以改變前藥以釋放出可檢測部分。在一個更具體的例子中，靶向酶(targetedenzyme)對前藥的切割將活性藥物釋放到靶向酶結合的標靶附近。“前原部分(pro-part)”和“非活性部分(inactivemoiety)”指的是前藥在被轉化之后的的非活性部分。例如，如果前藥包括由肽連接到活性藥物上的PEG分子，前原部分指的就是帶有肽連接體部分或不帶有肽連接體部分的PEG部分。如此處所用，“GC-Mel”指的是前藥戊二酰-頭孢菌素-苯丙氨酸氮芥(glutaryl-cephalosporin-melphalan)，例如Senter等，美國專利5,773,435中公開的，在此引入作為參考，包括任何的圖。術語“藥物(drug)”和“活性藥物(activedrug)”和“可檢測部分(detectablemoiety)”指的是前藥的活性部分。靶向酶對前藥進行切割以后，活性藥物對目標腫瘤、細胞、傳染物(infectiousagent)或其它致病物(agentofdisease)產生治療性的作用。可檢測部分充當診斷工具，這些可檢測部分被意圖包括在權利要求的范圍內。活性藥物可以是任何可以殺死細胞或抑制細胞增殖的化學實體。如此處所用，“Mel”指的是苯丙氨酸氮芥(也稱美法侖、馬法蘭、梅爾法蘭(Melphalan))。Mel的結構已為本領域所熟知，也可以在美國專利5,773,435中找到。在此，術語“％序列同源性(％sequencehomology)”與術語“％同源性(％homology)”、“％序列同一性(％sequenceidentity)”和“％同一性(％identity)可以交換使用，指的是當使用序列比對程序進行比對的時候，兩個或更多肽序列之間的氨基酸序列同一性水平。例如，如此處所用，80％同源性與80％序列同一性意義相同，其以確定的算法測定，并且因此，給定序列的同源物在該給定序列的一個長度段上具有大于80％的序列同一性。示范性的序列同一性水平包括但不限于與給定序列有60、70、80、85、90、95、98或99％或更多的序列同一性。可以用來確定兩個序列間的同一性的示范性的計算機程序包括但不限于BLAST程序集，例如BLASTN、BLASTX，和TBLASTX、BLASTP和TBLASTN，其為本領域技術人員和本領域所熟知。也參見Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215403-10和Altschul等，1997，NucleicAcidsRes.，253389-3402。當評價給定的氨基酸序列相對于GenBankProteinSequences(GenBank蛋白質序列)和其它公共數據文庫中的氨基酸序列時，一般用BLASTP程序進行序列搜索。優選地，BLASTX程序將已按照所有閱讀框(readingframe)被翻譯的核酸序列針對GenBankProteinSequences和其它公共數據文庫的氨基酸序列進行搜索。BLASTP和BLASTX都以默認參數運行，開放空位罰分(opengappenalty)為11.0，延伸空位罰分(extendedgappenalty)為1.0，使用BLOSUM-62矩陣。參見Altschul等，1997。優選地，為了確定兩個或更多個序列間的“％同一性”而對選定的序列進行的比對是使用例如MacVector6.5版本下的CLUSTAL-W程序進行的，使用默認參數，包括開放空位罰分10.0，延伸空位罰分0.1和BLOSUM30相似性矩陣(BLOSUM30similaritymatrix)。本發明的第一個方面涉及包含修飾的氨基酸序列的CAB分子。在一個實施方案中，CAB分子具有SEQIDNO1中提出的未修飾序列。在一個實施方案中，CAB分子具有從SEQIDNO1中提出的氨基酸序列修飾得來的氨基酸序列，并且所述修飾發生在至少一個選自下列位置的位置上100、102、104、105、107、163、165、166、184和226位，其中位置編號根據圖1所示的SEQIDNO1。在優選的實施方案中，CAB分子包括在100位、184位和226位上的修飾。在優選的實施方案中，CAB分子包括100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位、184位和226位上的修飾。在優選的實施方案中，CAB分子包括100位、102位、104位、105位、107位、163位、165位、166位和226位上的修飾。在優選的實施方案中，修飾選自下面的至少一個T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D，其中位置編號根據圖1所示的SEQIDNO1。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.6分子，所述CAB1.6分子具有如下的修飾T100L、S184D和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子具有下面的修飾T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A、S184D和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子具有如下的修飾T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、S163A、S165Y、Y166A和S226D。在優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.2(SEQIDNO1)、CAB1.6(SEQIDNO5)、CAB1.7(SEQIDNO6)或CAB1.13的scFV部分，如圖25中所闡述。在優選的實施方案中，CAB分子進一步包括β-內酰胺酶分子。在一優選的實施方案中，CAB分子具有未修飾的SEQIDNO2提出的氨基酸序列，或者具有從SEQIDNO2提出的氨基酸序列修飾得來的氨基酸序列，并且修飾發生在選自下列位置的至少一個位置3、13、16、37、100、102、104、105、107、146、163、165、166、181、184、226、265和568，其中位置編號根據圖2所示的SEQIDNO2。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、268位和568位。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、226位、265位和568位。在優選的實施方案中，CAB分子進一步包括β-內酰胺酶分子。在一優選的實施方案中，CAB分子具有從SEQIDNO2中提出的氨基酸序列修飾得到的氨基酸序列，并且所述修飾發生在選自下列位置中的至少一個位置3、13、16、37、100、102、104、105、107、146、163、165、166、181、184、226、265和568位，其中位置編號根據圖2所示的SEQIDNO2。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、146位、181位、184位和226位。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位和226位。在一優選的實施方案中，修飾發生在3位、13位、16位、37位、100位、102位、104位、105位、107位、146位、163位、165位、166位、181位、184位、226位、265位和568位。在一優選的實施方案中，CAB分子具有這樣的修飾，即所述修飾包含至少一個從下面選出的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A，其中位置編號根據如圖2所示的SEQIDNO2。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.2i分子，所述CAB1.2i分子包含如下的修飾K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包含CAB1.6分子，所述CAB1.6分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D和S226D。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.6i分子，所述CAB1.6i分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、M146V、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.7分子，所述CAB1.7分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D和S226D。在一優選的實施方案中，CAB包括CAB1.7i分子，所述CAB1.7i分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S184D、S226D、K265A和S568A。在一優選的實施方案中，CAB分子包括CAB1.13分子，所述CAB1.13分子包含如下的修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V和S226D。在一優選的實施方案中，CAB包括CAB1.13i分子，所述CAB1.13i分子包含如下修飾K3Q、R13K、T16G、L37V、T100L、T102L、P104A、Y105I、F107N、M146V、S163A、S165Y、Y166A、W181V、S226D、K265A和S568A。在優選的實施方案中，CAB分子包括如圖25中提出的CAB1.2(SEQIDNO2)或CAB1.2i，如圖25中提出的CAB1.6(SEQIDNO7)、CAB1.6i(SEQIDNO8)、CAB1.7(SEQIDNO9)、CAB1.7i(SEQIDNO10)、CAB1.13，或者如圖25中提出的CAB1.13i。在另一實施方案中，CAB是MDTA，如2002年6月12日提交的PCT申請號US03/18200中描述的，在此以其整體引入作為參考。本發明的CAB分子中的一些顯示出，相對于與非靶標的結合而言，其優先地結合于靶標上存在的微靶。所述結合上的差異可由靶標(target)和非靶標(non-target)之間的任何差異造成，靶標和非靶標之間的差異如pH、氧分壓、溶質或分析物(例如乳酸、糖或其它有機或無機分子)的濃度、溫度、光或離子強度的差異。本發明的CAB的優先結合可以用來在一組期望的條件下與微靶結合，在體外、離體、在原位或在體內(例如試驗對象中的靶組織)鑒定標靶，殺死靶細胞或組織，在靶組織中或在靶組織附近將前體藥物轉化成活性藥物。它也可以用作表面催化劑，例如，靶向漆酶(targetedlaccase)。其它的用途包括，例如定向生成化合物(例如從葡萄糖生成H2O2)和定向破壞化合物(例如來自特定組織的代謝物或信號分子)。在一個實施方案中，使用親和力成熟法(affinitymaturationmethod)對CAB進行選擇、制造或修飾，例如描述在2002年6月12日提交的PCT申請中，在此以其整體引入作為參考。在另一實施方案中，使用環嫁接法(loop-graftingmethod)對CAB進行選擇、制造或修飾，所述環嫁接法例如描述于2002年6月12日提交的美國專利申請序列號10/170,387中，在此以其整體引入作為參考。在另一實施方案中，CAB為多功能多肽，如2002年6月12日提交的美國專利申請序列號10/170,729中描述的，在此以其整體引入作為參考。在另一實施方案中，本發明的CABs被用于診斷或治療應用中，例如以其整體在此引入作為參考的美國專利4,975,278中描述的那些應用，以及為本領域所熟知的方法。在一個實施方案中，CAB分子進一步包括活性部分。所述活性部分可以是具有活性的分子或具有活性的分子的一部分。所述活性可為任何活性。活性部分可以具有的活性種類的例子包括，例如可檢測活性(detectableactivity)、酶活性、治療活性(therapeuticactivity)、診斷活性(diagnosticactivity)、毒性活性(toxicactivity)或結合活性(bindingactivity)。活性部分可以是CAB的分離部分，例如，與結合部分(bindingmoiety)融合或偶聯的酶；或者它可以是CAB的一個必須部分，例如CAB與微靶的結合作用可以活化或抑制微靶或靶標的活性；或者CAB可以是下面所討論的類型的靶向酶(targetedenzyme)，也在共同審查中的、以其整體在此引入作為參考的美國專利申請序列號10/022,073和10/022,097中予以討論。在另一實施方案中，活性部分顯示出酶活性，例如，其為酶或酶的活性片斷或衍生物。特別感興趣的是可以用來在治療環境下對前體藥物進行活化的酶。大量的具有不同催化作用方式的酶已被用來對前體藥物進行活化。參見，例如Melton&KnoxEnzyme-prodrugstrategiesforcancertherapy(1999)和Bagshawe等，CurrPoinImmunol11579(1999)。可以用來制造本發明的CAB的酶的類型的例子包括，但不限于蛋白酶、羧肽酶、β-內酰胺酶、天冬酰胺酶、氧化酶、水解酶、裂合酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、醛縮酶、磷酸酶、激酶、轉移酶、聚合酶、核酸酶、核苷酸酶、漆酶、還原酶以及類似物。參見例如2001年9月12號提交的共同在審的美國專利申請序列號09/954,385，在此以其整體引入作為參考。同樣地，本發明的CAB可以，例如展現出蛋白酶、羧肽酶、β-內酰胺酶、天冬酰胺酶、氧化酶、水解酶、裂合酶、脂肪酶、纖維素酶、淀粉酶、醛縮酶、磷酸酶、激酶、轉移酶、聚合酶、核酸酶、核苷酸酶、漆酶或還原酶的活性以及類似活性。可使用的酶的例子是那些可以對前體藥物進行活化的酶，如下面描述的，以及那些可以從代謝物制得毒性劑的那些酶，例如從葡萄糖中制得過氧化氫。參見Christofidou-Solomidou等，2000，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol278L794。在一個實施方案中，本發明提供了CAB，其進一步包括β-內酰胺酶(β-lactamase(“BLA”))。在另一個實施方案中，BLA為在此以其整體引入作為參考的、共同在審的美國專利申請序列號10/022,073和10/022,097描述的靶向酶。BLA酶廣泛分布于革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌中。BLA序列已經被熟知。圖3描述了BLA序列的代表性例子。BLA酶的專一性不同，但相同的是它們水解β-內酰胺，產生出取代的β-氨基酸。因此，它們賦予針對含有β-內酰胺的抗生素的抗性。因為BLA酶對哺乳動物來說不是內源性的，所以它們經受的來自抑制劑、酶底物或內源酶系的干擾是最小的(不像蛋白酶)，因此特別適合于治療性的施用。進一步地，BLA酶適合于本發明的治療方法是因為它們尺寸小(來自陰溝腸桿菌(E.cloacae)的BLA是一個39kD的單體；來自大腸桿菌(E.coli)的BLA是30kD的單體)，以及因為它們具有針對其底物高度的專一性活性和在37℃下具有最適活性。參見Melton等，Enzyme-ProdrugStrategiesforCancerTherapy，KluwerAcademic/PlenumPublishers，NewYork(1999)。可以用來制造本發明的CAB的具體BLA的例子包括，但不限于A、B、C或D類的β-內酰胺酶(ClassA，B，CorDβ-lactamase)、β-半乳糖苷酶，參見Benito等，FEMSMicrobiol.Lett.123107(1994)，纖連蛋白、葡糖氧化酶、谷胱甘肽S-轉移酶，參見Napolitano等，Chem.Biol.3359(1996)，和組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tissueplasminogenactivator)，參見Smith等，J.Biol.Chem.27030486(1995)。根據其序列，β-內酰胺酶被分成四類。參見Thomson等，2000，MicrobesandInfection21225-35。絲氨酸β-內酰胺酶被再分成三類A(青霉素酶)、C(頭孢菌素酶)和D(苯唑青霉素酶(oxacillnase))。B類的β-內酰胺酶是含鋅的或金屬β-內酰胺酶。可以使用任何類別的BLA來制造本發明的CAB。在本發明的一個實施方案中，BLA具有的針對頭孢硝噻(nitrocefin)的比活力(specificactivity)大于約0.01U/pmol，其中使用的是美國專利申請序列號10/022,097中描述的測定方法。在另一實施方案中，比活力大于約0.1U/pmol。在另一實施方案中，比活力大于約1U/pmol。優選地，這些比活力指的是BLA結合于微靶時的比活力。在一個實施方案中，CAB中的BLA酶包括SEQIDNO3中提出的氨基酸序列。在另一實施方案中，CAB中的BLA酶與圖2中描述的序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％或更多同一性。在優選的實施方案中，CAB為CAB1.6、CAB1.6i、CAB1.7或CAB1.7i。被CAB或者一個或多個結合部分所結合的靶標(target)可以是任何這樣的物質或成分對其，可以制成分子，用于結合CEA。在一個實施方案中，所述標靶是表面。在一個實施方案中，所述表面是生物表面。在另一個實施方案中，所述生物表面是器官的表面。在另一實施方案中，所述生物表面是組織的表面。在另一實施方案中，所述生物表面是細胞的表面。在另一實施方案中，所述生物表面是患病的器官、組織或細胞的表面。在另一實施方案中，所述生物表面是正常或健康的器官、組織或細胞的表面。在另一實施方案中，所述表面是組織的間隙空間中的大分子。在另一實施方案中，所述生物表面是病毒或病原體的表面。在另一實施方案中，所述表面是非生物表面。在另一實施方案中，所屬非生物表面是醫療裝置(medicaldevice)的表面。在另一實施方案中，所述醫療裝置是治療裝置。在另一實施方案中，所述治療裝置是植入的治療裝置。在另一實施方案中，所述的醫療裝置是診斷裝置。在另一實施方案中，所述診斷裝置是孔(well)或盤(tray)。細胞或組織的來源包括人、所有其它動物、細菌、真菌、病毒和植物。組織是復合的靶標，指的是單一的細胞類型、細胞類型的匯集或一般為特定種類的細胞的集合體。組織可以是原樣的或經過改變的。人的組織的一般類型包括但不限于上皮組織、結締組織、神經組織和肌肉組織。在另一實施方案中，靶標是這樣的癌相關靶標其表達CEA或者具有結合于其自身的CEA或者其附近有CEA。所述癌相關靶標(cancer-raletedtarget)可以是本發明的成分結合的任何靶標，其中本發明的成分的結合是作為對對象的癌癥或與癌癥相關的狀態進行的診斷、檢測或治療的一部分，所述涉及癌癥的靶標例如癌性細胞、組織或器官，與癌性細胞、組織或器官相關的分子，或者與癌性細胞、組織或器官相關的分子、細胞、組織或器官(例如結合于腫瘤的診斷性或治療性分子，其被給予對象或給予得自對象的活組織(biopsy)；或者與癌性組織相關的健康組織，諸如脈管系統)。本發明的第二個方面涉及編碼在此提出的CAB分子的核酸。所述核酸可以是，例如DNA或RNA。本發明也提供了包含核酸的質粒，所述核酸編碼包括CAB之全部或部分的多肽。質粒可以是例如表達質粒，其允許多肽在宿主細胞或有機體中表達，或在體外表達。表達載體可以允許多肽在例如細菌細胞中表達。所述細菌細胞可以是例如大腸桿菌(E.coli)細胞。由于遺傳密碼的冗余性(redundancy)，一般來說，有大量的DNA序列編碼任何給定氨基酸序列，從這個意義上說，它們是等價的。如下所述，可以期望選擇一個或另一個等價的DNA序列用在表達載體中，這基于表達載體將要插入的宿主細胞的優先密碼子選擇。本發明意圖包括編碼期望CAB的所有DNA序列。可以使用一個可操作的表達克隆，其構建是通過在表達載體中置放入與合適的控制序列可操作連接的編碼序列。所述載體可以設計成在宿主細胞中自主復制或整合到宿主細胞的染色體DNA上。用得到的克隆來轉化合適的宿主，并且在適合進行該編碼序列表達的條件下對經轉化的宿主進行培養。然后將表達出的CAB從培養基中或從細胞中分離，盡管在一些情況下CAB的回收(recovery)和純化并不是必須的。構建包含編碼序列和合適的控制序列的適宜克隆是利用本領域所熟知的標準連接和限制技術(standardligationandrestrictiontechniques)。一般而言，分離的質粒、DNA序列或合成的寡核苷酸被以期望的形式切割、修飾和重新連接。如果沒有通常可用的適宜的限制位點的話，可以在編碼序列的末端加入適宜的限制位點，以使表達克隆的構建更加便利。位點專一性的DNA切割是通過使用一種(或多種)合適的限制酶處理實現的，進行限制酶處理的條件是本領域通常所知的，并且商業上可得的限制酶的制造商對其也有具體說明。參見，例如Amersham(ArlingtonHeights，IL)、RocheMolecularBiochemicals(Indianapolis，IN)和NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)的產品目錄。典型的溫育時間是在特定酶的最適溫度下約一個到兩個小時。每次溫育過后，通過使用苯酚和氯仿抽提將蛋白質移出；所述的抽提之后可以進行醚類抽提，以及使用乙醇沉淀來將DNA從含水組分中回收。如果需要的話，可以通過使用標準技術，進行聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳來將切割的片斷按大小分開。參見，例如Maxam等，1980，MethodsinEnzymology65499-560。連接可以以例如15-30μl的體積，在下面的標準條件和溫度下進行20mMTris-Cl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，33μg/mlBSA，10-50mMNaCl，以及以下兩組條件中的一組，即40μMATP和0.01-0.02(Weiss)單位的T4DNA連接酶，在0℃下(用以連接具有互補單鏈末端的片斷)，或者1mMATP和0.3-0.6單位的T4DNA連接酶，在14℃下(用于“平末端(bluntend)”連接)。具有互補末端的片斷的分子間連接，一般在總DNA濃度33-100μg/ml(總末端濃度5-100nM)下進行。平末端的分子間連接(任選地，一般使用20-30倍摩爾過量的接頭)在1μM的總末端濃度下進行。可以使用本領域已知的任何合適的方法，對質粒結構的正確連接進行確認。例如，對質粒結構的正確連接的確認可以通過首先使用連接混合物對合適的宿主進行轉化，其中合適的宿主諸如是大腸桿菌(E.coli)菌株DG101(ATCC47043)或大腸桿菌(E.coli)菌株DG116(ATCC53606)。可以通過氨芐青霉素、四環素，或通過其它抗生素抗性或敏感性，或者通過使用其它的標記來對成功的轉化體進行選擇，這取決于質粒構建的方式，如本領域所理解的。然后根據Clewell等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA621159的方法制備來自轉化體的質粒，任選地在此之前進行氯霉素法擴增(chloramphenicolamplification)。參見Clewell，1972，J.Bacteriol.110667。可替代地，可以使用“堿-酸(Base-Acid)”抽提方法制備質粒DNA，所述方法在BethesdaResearchLaboratoriespublicationFocus5(2)的第11頁，并且，以DNA的CsCl/溴化乙錠超速離心代替該實驗方案的第12步到第17步可以得到非常純的質粒DNA。作為另一個可替代的方案，可以按照賣主提供的實驗方案、使用商業上可得的質粒DNA分離試劑盒，例如HISPEEDTM、QIAFILTERTM和QIAGEN質粒DNA分離試劑盒(Qiagen，ValenciaCA)。分離的DNA可以通過，例如限制酶消化進行分析；和/或通過Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463的雙脫氧法進行測序，如Messing等，1981，Nuc.AcidsRes.9309進一步描述的；或通過Maxam等，1980，MethodsinEnzymolgy65499中的方法進行測序。控制序列、表達載體和轉化方法取決于用來表達該基因的宿主細胞的類型。一般地說，原核細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞被用作宿主。一般來說，原核宿主用來生產重組蛋白質是最高效和最便利的，因此優選它來表達蛋白質。最常用的表達重組蛋白質的原核生物是大腸桿菌(E.coli)。然而，也可以使用除了大腸桿菌(E.coli)以外的微生物菌株，諸如桿菌，例如枯草桿菌(Bacillussubtilis)，假單孢菌(Pseudomonas)和沙門氏菌(Salmonella)的各個種，以及其它細菌菌株。在諸如此類的原核生物系統中，一般使用含有如下所述復制位點和控制序列(controlsequence)的質粒載體所述復制位點和控制序列來自該宿主或與宿主相容的種。關于在大多數細菌啟動子的控制下對構建物(constructions)進行的表達，可以使用得自E.coliGeneticStockCenter的、列于GCSC#6135下的大腸桿菌(E.coli)K12菌株MM294作為宿主。至于具有PLNRBS或PLT7RBS控制序列的表達載體，可以使用大腸桿菌(E.coli)K12菌株MC1000λ溶原體，N7N53cI857SusP80，ATCC39531。1987年4月7日存放在ATCC的大腸桿菌(E.coli)DG116(ATCC53606)和1985年3月29日存放在ATCC的大腸桿菌(E.coli)KB2(ATCC53075)也是有用處的宿主細胞。至于M13噬菌體重組體，使用易于被噬菌體感染的大腸桿菌(E.coli)菌株，諸如大腸桿菌(E.coli)K12菌株DG98(ATCC39768)。所述DG98菌株在1984年7月13日被存放在ATCC。例如，一般使用pBR322的衍生物對大腸桿菌(E.coli)進行轉化，如Bolivar等，1977，Gene295描述的。質粒pBR322含有氨芐青霉素和四環素抗性基因。構建期望的載體時可以保留或破壞這些藥物抗性標記，這有助于檢測期望的重組體的是否存在。通常使用的原核控制序列，即轉錄起始的啟動子，其任選地具有操縱基因(operator)，隨同具有核糖體結合位點序列，所述原核控制序列包括β-內酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)啟動子系統，參見Chang等，1977，Nature1981056；色氨酸(trp)啟動子系統，參見Goeddel等，1980，Nuc.AcidsRes.84057；和源自λ的PL啟動子，參見Shimatake等，1981，Nature292128；和基因N核糖體結合位點(NRBS)。頒發于1987年12月8日的美國專利號4,711,845提出了可移植控制系統盒(portablecontrolsystemcassette)。這個盒包括PL啟動子，其可操作地連接NRBS，依次位于第三個DNA序列的上游，所述第三個DNA序列具有至少一個限制位點，該限制位點允許在NRBS序列3’端的六個堿基對之內進行切割。Chang等在1986年10月8日公開的歐洲專利公開號196,864中描述的磷酸酶A(phoA)系統也有用處。然而，與原核生物相容的任何可以利用的啟動子系統都可以用來構建本發明的表達載體。除細菌以外，真核微生物如酵母菌也可以被用作重組體宿主細胞。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的實驗室株，面包酵母(Baker′syeast)最常被使用，盡管許多其他的菌株也是可利用的。盡管利用2微米復制起點(twomicronoriginofreplication)的載體是常用的，參見Broach，1983，Meth.Enz.101307，其它適合酵母菌表達的質粒載體是已知的。參見，例如Stinchcomb等，1979，Nature28239；Tschempe等，1980，Gene10157；和Clarke等，1983，Meth.Enz.101300。酵母載體的控制序列包括合成糖酵解酶的啟動子。參見Hess等，1968，J.Adv.EnzymeReg.7149；Holland等，1978，Biotechnology174900；和Holland等，1981，J.Biol.Chem.2561385。本領域已知其它啟動子包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動子，參見Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.2552073，以及其它糖酵解酶的啟動子，諸如3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶和葡糖激酶。具有生長條件控制轉錄的額外優點的其它啟動子是下列蛋白的啟動子區醇脫氫酶2、異細胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酯酶、與氮代謝相關的降解酶和負責對麥芽糖和半乳糖進行利用的酶。當置于編碼序列的3端，終止序列也可被用來增強表達。諸如此類的終止子，在來自酵母的基因中、在跟隨編碼區域的3端非翻譯區域中被發現。含有酵母相容啟動子、復制起始點和其它控制序列的任何載體，都適合用于構建酵母表達載體。編碼序列也可以在源自多細胞生物的真核宿主細胞培養物中表達。參見，例如TissueCulture，AcademicPress，CruzandPatterson，editors(1973)。有用處的宿主細胞系包括COS-7；COS-A2；CV-1；鼠類細胞，諸如鼠骨髓瘤細胞N51和VERO；HeLa細胞和中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用于這些細胞的表達載體通常包括與哺乳動物細胞相容的啟動子和控制序列，諸如常用的來自猿猴病毒(SimianVirus)40(SV40)的早期啟動子和后期啟動子，參見Fiers等，1978，Nature273113，或者其它病毒啟動子諸如得自多瘤病毒、腺病毒2型、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)或禽肉瘤病毒的病毒啟動子，或者免疫球蛋白啟動子和熱激啟動子。增強子區在優化表達中也是重要的；這些一般是在啟動子區上游所發現的序列。如果需要的話，可以從病毒來源獲得復制起點。然而，整合進染色體中是真核細胞中DNA復制的通常機制。植物細胞也可以用作宿主，可以獲得與植物細胞具有相容性的控制序列，諸如胭脂氨酸合酶啟動子和多腺苷酸化信號序列，參見Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Gen.1561。利用桿狀病毒載體所提供的控制系統的、使用昆蟲細胞的表達系統也得到了描述。參見Miller等，在GeneticEngineering(1986)，Setlow等編著，PlenumPublishing，Vol.8，pp.277-97中。基于昆蟲細胞的表達可以在Spodopterafrugipeida中實現。這個系統也可以成功地生產重組酶。根據所使用的宿主細胞，使用適合于這些細胞的標準技術完成轉化。對原核細胞或其它含有堅實的細胞壁障礙的細胞使用氯化鈣進行鈣處理，如Cohen，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110描述的。以根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)進行的轉染用于某些植物細胞，參見Shaw等，1983，Gene23315。對于哺乳動物細胞，Graham等，1978，Virology52546的磷酸鈣沉淀法為優選的。轉化進入酵母菌是根據VanSolingen等，1977，J.Bact.130946和Hsiao1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA763829的方法進行的。可以期望對這樣的DNA序列進行修飾，即所述DNA編碼多肽，該多肽包含本發明CAB的全部或部分，用以提供，例如，與宿主細胞的密碼子選擇更加相容的序列而不改變編碼的蛋白質的氨基酸序列。對最初的5-6個密碼子進行諸如此類的修飾可能改善表達效率。已被修飾以改善表達效率、但編碼相同氨基酸序列的DNA序列被認為是等價的，包含在本發明中。多種位點專一引物介導誘變方法是可以利用的并且在本領域是已知的。參見，例如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，1989，secondedition，chapter15.51，″Oligonucleotide-mediatedmutagenesis″，在此引入作為參考。聚合酶鏈反應(PCR)可以用來進行位點專一誘變(site-specificmutagenesis)。在本領域當前另一標準技術中，使用編碼期望突變的合成寡核苷酸作為引物，以指導互補核酸序列的合成，所述互補核酸序列含在單鏈載體中，諸如pBSM13+衍生物，其作為誘變引物之延伸產物的構建模板。將經過誘變的DNA轉化進入宿主細菌中，并將發生轉化的細菌之培養物鋪板并鑒定。對經過修飾的載體的鑒定可能需要將選定轉化體的DNA轉移到硝酸纖維素濾膜或其它膜上，并且使“提升物(lifts)”與激酶處理的合成誘變引物雜交，其中進行雜交的溫度是允許與修飾的序列精確相配的雜交、而同時防止與原始的未經誘變的鏈進行雜交的溫度。然后，對含有可以與探針雜交的DNA的轉化體進行培養(一般通過序列分析對DNA序列進行確認)，其作為修飾DNA的儲存文庫(reservoir)。一旦多肽在重組宿主細胞中得到表達，對多肽進行純化可以是期望的。可以使用多種純化程序。另一個實施方案中，在高嚴格度條件下，將編碼CAB的核酸與這樣的核酸雜交所述核酸與編碼在此公開的任何氨基酸序列的核酸互補。高嚴格度條件可以是，例如在65℃下，在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA中，與結合在濾膜上的DNA雜交；以及在68℃下，在0.1xSSC/0.1％SDS中漂洗(Ausubel等，eds.，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.I，GreenPublishingAssociates，Inc.，和JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork在p.2.10.3)。其它高嚴格度條件可以在，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，pages2.10.1-16和MolecularCloningALaboratoryManual，2ded.，Sambrook等(eds.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，pages9.47-57中找到。在另一實施方案中，使用中嚴格度條件。中嚴格度條件可以是，例如在42℃下，在0.2xSSC/0.1％SDS中漂洗(Ausubel等，1989，前述)。其它中嚴格度條件可以在例如CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.I，Ausubel等(eds.)，GreenPublishingAssociates，Inc.，和JohnWiley&Sons，Inc.，1989，pages2.10.1-16和MolecularCloningALaboratoryManual，2ded.，Sambrook等(eds.)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989，pages947-57中找到。本發明第三方面提供了對對象進行治療的方法，其中對象需要這種治療方法，該方法包括對對象施用CAB和前藥，其中前藥是CAB的底物。在另一個實施方案中，本發明提供了治療對象的方法，是通過對對象施用進一步包括BLA的CAB和前藥，其中前藥被BLA轉化成活性藥物。適合于這個實施方案的前藥的例子，例如在Melton等，Enzyme-ProdrugStrategiesforCancerTherapy，KluwerAcademic/PlenumPublishers，NewYork(1999)，Bagshawe等，CurrentOpinioninImmunology11579-83(1999)和Kerr等，BioconjugateChem.9255-59(1998)中提供的。在另一實施方案中，CAB特別地為CAB1.6，CAB1.7或CAB1.7i。酶/前藥/活性藥物聯合使用的例子可以在，例如在Bagshawe等，CurrentOpinionsinImmunology，11579-83(1999)；Wilman，“ProdrugsInCancerChemotherapy，”BiochemicalSocietyTransactions，14，pp.375-82(615thMeeting，Belfast1986)和V.J.Stella等，″ProdrugsAChemicalApproachToTargetedDrugDelivery，″DirectedDrugDelivery，R.Borchardt等(ed)，pp.247-67(HumanaPress1985)中找到。在一個實施方案中，前藥是肽。作為前藥的肽的例子可從Trouet等，ProcNatlAcadSciUSA79626(1982)，和Umemoto等，IntJCancer43677(1989)中找到。這些和其他報道顯示肽在血液中足夠穩定。來自肽的前藥的其它優點是可以對它們的氨基酸序列進行選擇，以便賦予活性藥物適宜的藥理學性質，如半衰期、組織分布和低毒性。大多數報道的來自肽的前藥依賴于由例如溶酶體酶類所進行的相對非特異性前藥活化過程。前藥(prodrug)可以是經過一步以上的步驟被轉化成活性藥物的物質。例如，前藥可以被CAB轉變成活性藥物的前體(precursor)。前體可被轉變成活性藥物，例如借助另外的一種或多種CAB的催化活性、施予該對象的一種或多種其它酶的催化活性、該對象中或對象的靶部位中天然存在的一種或多種酶(如蛋白酶、磷酸酶、激酶或聚合酶)的催化活性轉變，被施予該對象的藥物轉變或被非酶催化的化學過程(如氧化、水解、異構化或差向異構化)轉變。大部分涉及前藥的研究是在使用已有藥物的計劃被發現有問題以后進行的。具體而言，抗癌藥物的特征一般是非常低的治療指數。通過將這些藥物轉變成具有減少的毒性的前藥，然后選擇性地在患病組織將其活化，藥物的治療指數得到了顯著增加。參見Melton等，Enzyme-prodrugstrategiesforcancertherapy(1999)，和Niculescu-Duvaz等，AnticancerDrugDes14517(1999)。文獻描述了許多通過蛋白質工程或定向進化改變酶的底物特異性的方法。因此，本領域技術人員能夠發展酶的特異性，以適應均勻結構(evenstructure)，所述均勻結構對天然存在的酶來說是差底物。因此，可以設計前藥，即使這些藥物因另外方式不服從某種前藥策略。使用偶合于尋靶試劑(targetingagents)(通常是抗體或抗體片段)上的毒素已經進行了許多研究。參見，例如Torchilin，EurJPharmSci11Suppl2S81(2000)和Frankel等，ClinCancerRes6326(2000)。上述方案的可替代方案是將這些毒素轉變成前藥，然后選擇性地將它們釋放到患病組織中。本發明的前藥包括但不限于aurstatins、喜樹堿、含磷酸酯(鹽)的前藥、含硫代磷酸酯(鹽)的前藥、含硫酸酯(鹽)的前藥、含肽的前藥、D-氨基酸修飾的前藥、糖基化的前藥、含β-內酰胺的前藥、含任選地取代的苯氧乙酰胺的前藥或含任選地取代的苯乙酰胺的前藥，5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前藥，它們可被偶聯物的酶轉變成活性更高的細胞毒性自由藥物。可被衍生化成為用于本發明的前藥形式的細胞毒性藥物包括，但不限于依托泊苷、temposide、阿霉素(adriamycin)、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線菌素D、絲裂霉素、順鉑和順鉑類似物、博來霉素、esperamicin(參見美國專利號4,675,187)、5-氟尿嘧啶、梅爾法蘭，其它相關的氮芥以及它們的衍生物。參見例如美國專利號4,975,278。在本發明的一個實施方案中，CAB包括堿性磷酸酶(AP)，它將表鬼臼毒素葡糖苷(epipodophyl-lotoxinglucosides)的4′-磷酸衍生物轉變成活性的抗癌藥物。諸如此類的衍生物包括依托泊苷-4′-磷酸、依托泊苷-4-′-硫代磷酸和鬼臼噻吩甙-4′-磷酸。本發明的其它實施方案可以包括這些葡糖苷的磷酸衍生物，其中磷酸部分被置于葡糖苷的其它羥基基團上。然而，根據另一實施方案，用作本發明的前藥的磷酸衍生物是依托泊苷-4′-磷酸或依托泊苷-4′-硫代磷酸。定向AP將磷酸基團從前藥中除去，釋放出活性抗腫瘤劑。本實施方案的磷酸絲裂霉素前藥(mitomycinphosphatedrug)可以是絲裂霉素C或泊非霉素的N7-C1-8烷基磷酸衍生物，或其藥學上可接受的鹽。N7指的是連接于母體藥物米吐烷(mitosane)核的第7位上的氮原子。根據另一實施方案，使用的衍生物是7-(2′-氨基乙基磷酸)絲裂霉素(“MOP”)。可替代地，MOP化合物可以被稱為9-甲氧基-7-[[(膦酰氧基)乙基]氨基]米吐烷二鈉鹽。本發明的其它實施方案可以包括將N7-烷基絲裂霉素硫代磷酸鹽(N7-alkylmitomycinphosphorothioates)用作前藥。在本發明的另一實施方案中，CAB包括青霉素酰胺酶(penicillinamidaseenzyme)，它將新的阿霉素前藥轉變成活性抗腫瘤藥物阿霉素。在另一實施方案中，青霉素酰胺酶為青霉素V酰胺酶(″PVA″)，它是從尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)中分離得到的，水解苯氧乙酰基酰胺鍵。利用的前藥可以是N-(對羥基苯氧乙酰基)阿霉素(“APO”)，它被酰胺酶水解，釋放出有效的抗腫瘤劑或者阿霉素。本發明也包括，例如使用阿霉素前藥N-(對羥基苯氧乙酰基)阿霉素和其它可以以實質上相同的方式衍生的相關阿霉素前藥。例如，使用前藥N-(苯氧乙酰基)阿霉素也在本發明的范圍內。此外，應該理解本發明的阿霉素前藥包括阿霉素的其它N-羥基苯氧乙酰基衍生物，如在苯環的不同位置取代，以及在苯環上含有除了在此描述的羥基基團以外的取代基的N-苯氧乙酰基衍生物。更進一步地，本實施方案包括將其它酰胺酶，諸如青霉素G酰胺酶用作CAB的一部分，以及使用其它相應地衍生的前藥，使得特定酰胺酶可以將該前藥水解成活性抗腫瘤形式。例如，當CAB進一步包括青霉素G酰胺酶的時候，前藥應該含有苯乙酰胺基團(與APO的苯氧乙酰胺基團不同)，因為青霉素G酰胺酶水解這種類型的酰胺鍵(參見例如A.L.Margolin等，Biochim.BiophysActa.616，pp.283-89(1980))。從而，本發明其它的前藥包括N-(對羥基苯乙酰基)阿霉素，N-(苯乙酰基)阿霉素和阿霉素的其它任選取代的N-苯乙酰衍生物。應該理解，本發明包括任何這樣的前藥所述前藥是通過將母體藥物的氨基基團和苯氧乙酸、苯乙酸或其它相關的酸的羰基反應而得到。因此，除了阿霉素，蒽環類抗生素前藥能夠以和在此描述的阿霉素前藥基本上相同的方式被衍生和起作用，它也落入本發明的范圍。例如，可以根據本發明被制造和使用的其他前藥包括蒽環類抗生素的羥基苯氧乙酰胺衍生物、羥基苯乙酰胺衍生物、苯氧乙酰胺衍生物和苯乙酰胺衍生物，其中蒽環類抗生素諸如是道諾霉素和洋紅霉素。其它含胺的藥物諸如梅爾法蘭、絲裂霉素、氨基蝶呤、博來霉素和放線菌素D也可以按此處所述被修飾，以便得到本發明的前藥。本發明的另一實施方案涉及的CAB形式的酶是胞嘧啶脫氨酶(″CD″)。脫氨酶催化5-氟胞嘧啶(″5-FC″)的轉變成有效的抗腫瘤藥物5-氟尿嘧啶(″5-FU″)，其中5-氟胞嘧啶缺乏抗腫瘤活性。本發明方法的另一實施方案提供一種聯合化療方法，其使用幾種前藥和單個CAB。根據這個實施方案，使用了多種前藥，它們都是同一CAB的底物。從而，特定的CAB將多種前藥轉變成細胞毒性形式，在腫瘤部位引起增加的抗腫瘤活性。經常會要求延長藥物肽、蛋白或小分子的血液循環半衰期。一般地，短的半衰期——持續數分鐘到數小時——不僅要求更頻繁的給藥，而且要求更高的劑量，以取得治療效果——經常高到初始峰值劑量引起副作用。延長這種治療劑的半衰期允許更低量、頻率更低以及因此可能更安全的劑量，生產起來更低廉。此前，研究者增加了蛋白質的半衰期，是通過將蛋白共價融合在PEG上，參見美國專利5,711,944；人血清白蛋白，參見美國專利5,766,883；或Fc片斷，參見WO00/24782。此外，藥物針對人血清白蛋白的非特異性定向作用，已經通過體內化學偶聯藥物實現了。參見美國專利5,843,440。此外，在癌癥藥物的情況下，有人提出由于增強的穿透性和保持力，高分子量藥物可以集中在腫瘤中。從而，可以通過將藥物與蛋白或其它高分子量聚合物連接來從而改善藥物的治療指數。本發明的另一個實施方案中提供了一種治療對象的一種狀態的方法，其包括對對象施用具有β-內酰胺酶活性的CAB和前藥。在另一實施方案中，CAB被定向于表達CEA的細胞、組織、腫瘤或器官。在另一實施方案中，前藥被CAB轉化成為活性藥物。在另一實施方案中，活性藥物是烷化劑。在另一實施方案中，前藥是抗癌的氮芥前藥。在另一實施方案中，活性藥是梅爾法蘭。在另一實施方案中，前藥是戊二酰-C-Mel或戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(參見，例如Senter等，美國專利5,773,435，在此引入作為參考，包括任何圖在內；以及Kerr等，BioconjugateChem.9255-59(1998))。在另一實施方案中，前藥是C-Mel。參見Kerr等BioconjugateChem.9255-59(1998)。在另一實施方案中，前藥是長春藥-頭孢菌素(vinca-cephalosporin)或亞得里亞霉素頭孢菌素(doxorubicincephalosporin)。參見Bagshawe等，CurrentOpinioninImmunology，11579-83(1999)。可以用于本發明的其它聯合的前藥/酶包括但不限于美國專利號4,975,278；和Melton等，Enzyme-ProdrugStrategiesforCancerTherapyKluwerAcademic/PlenumPublishers，NewYork(1999)中的那些前藥。在第四個方面，本發明涉及包括-CAB分子的藥物組合物。在此描述的CAB，編碼它們的核酸以及某些實施方案中的前藥可以合并入適合給藥的藥物組合物。諸如此類的組合物一般包含活性化合物和藥學上可接受的載體。如此處所用，專用語“藥學上可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”意圖包括任何和所有的與藥物施用可相容的溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑以及類似物。諸如此類的介質和試劑用于藥學上有活性的物質，是本領域已經熟知的。除了達到與活性化合物不相容程度的任何傳統媒介或試劑之外，在組合物中使用傳統的介質和試劑是預期的。輔助的活性化合物也可以合并進入組合物中。本發明包括制備藥物組合物的方法，所述藥物組合物調制感興趣的CAB、前藥或核酸的表達或者活性。諸如此類的方法包括將藥學上可接受的載體與調節感興趣的活性化合物的表達或活性的試劑進行配制。諸如此類的組合物可以進一步包括另外活性劑。從而，本發明進一步包括這樣的制備藥物組合物的方法所述方法將藥學上可接受的載體，與調節感興趣的CAB、前藥或核酸的表達或活性的試劑，和一種或多種另外的活性化合物配制在一起。本發明的藥物組合物被配制成與它的希望給藥途徑相適應。給藥途徑的例子包括腸胃外的給藥，如靜脈內、皮內、皮下、口腔(如吸入)、經皮(局部的)、經粘膜和直腸給藥。用于腸胃外、皮內或皮下應用的溶液或混懸液可以包括下面的成分無菌稀釋劑，諸如用于注射的水，鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩沖劑，諸如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及調整張力的試劑，諸如氯化鈉或葡萄糖。可以用酸或堿調節pH值，諸如鹽酸或氫氧化鈉。腸胃外制劑可以裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。適合用于可注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液(當溶于水時)或分散體系(dispersion)以及無菌粉末，用于即時制備無菌可注射的溶液或分散體系。用于靜脈內給藥時，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、聚氧乙基代蓖麻油(CremophorELTM)(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有的情況下，組合物必須是無菌的并且應該是流動的，達到容易通過針孔的程度。它在制造和貯藏條件下必須是穩定的，并且它必須防止微生物諸如細菌和真菌的污染作用。載體可以是溶劑或分散介質，包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態聚乙二醇，以及類似物)以及它們的合適的混合物。適宜的流動性可以得以保持，通過例如使用諸如卵磷脂的覆層、在分散體系的情況下保持必要的顆粒大小、和通過使用表面活性劑。微生物行為的阻止可以通過多種抗細菌和抗真菌劑來實現，例如抗細菌和抗真菌劑是對羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇(chlorobutanol)、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞以及類似物。在許多情況下，優選地在組合物中包括等滲劑(isotonicagent)，例如糖；多元醇，諸如甘露醇；山梨醇；氯化鈉。通過在組合物中引入延緩吸收的藥劑，諸如單硬脂酸鋁和明膠，可以實現可注射組合物的延長吸收。無菌可注射溶液可以這樣制備將活性化合物以需要的量并入合適的溶劑中，所述溶劑帶有按需要混入的上面列舉出的成分的一種或組合，然后進行過濾除菌。一般地，分散體系這樣制備將活性化合物混入無菌載體(vehicle)，所述無菌載體含有基本分散介質和需要的其他成分，這些成分來自上面舉出的那些成分。在無菌粉末用以制備無菌可注射溶液的情況下，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，這些制備方法從其先前過濾除菌的溶液產生出活性成分加上任何另外需要成分的粉末。口腔用組合物一般包含惰性的稀釋劑或可食用載體。它們可以包在明膠膠囊中，或被壓成片。為了經口腔治療性給藥的目的，活性化合物可以與賦形劑混在一起，以片劑、含片或膠囊劑的形式使用。口腔用組合物也可以用流體載體制備，用作漱口劑，其中流體載體中的化合物被應用于口腔，漱口(swished)并吐出或咽下。藥學上可相容的結合劑和/或佐劑材料可被包括進來，作為組合物的一部分。片劑、丸劑、膠囊劑、含片和類似物可以含有下列任何的成分，或者具有類似性質的化合物粘合劑，諸如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如淀粉或乳糖；崩解劑，諸如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或Sterotes；助流劑，諸如膠體二氧化硅；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或芳香劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橘味香精(orangeflavoring)。對于通過吸入的給藥，化合物以氣溶膠噴發藥的形式遞送，所述氣溶膠噴發藥來自加壓容器或分散器(dispenser)，其含有合適的噴射劑，如氣體，諸如二氧化碳，或者來自噴霧器。也可以通過經粘膜或經皮的手段進行全身用藥。對于經粘膜或經皮給藥，在制劑中使用穿透劑，該穿透劑適合于要穿透的屏障。諸如此類的穿透劑是本領域一般了解的，其包括，例如用作經粘膜給藥時的去污劑、膽鹽和夫西地酸衍生物。經粘膜給藥可以通過使用鼻腔噴霧劑或栓劑來實現。對于經皮給藥，可以將活性化合物配入軟膏、藥膏、凝膠或乳膏中，如本領域一般知曉的。化合物也可以被制成栓劑(如使用傳統的栓劑基質，諸如可可脂和其它甘油酯)或保留灌腸劑的形式，用以進行直腸遞送。在一個實施方案中，活性化合物與這樣的載體制備到一起所述載體將保護化合物不被身體快速排除，諸如控制釋放制劑，包括埋植劑和微囊遞送系統。可以使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，諸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯類和聚乳酸。制備此類制劑的方法對本領域的技術人員而言是顯然的。原料也可以通過商業途徑從AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc.獲得。脂質體混懸液(包括帶有針對病毒抗原的多克隆抗體而定向于受感染細胞的脂質體)也可以用作藥學上可接受的載體。這些可以根據本領域技術人員已知的方法進行制備，例如美國專利號4,522,811中描述的方法。將經口腔或非經腸胃的組合物制成單位劑型特別便利，這方便給藥和統一劑量。單位劑型(dosageunitform)，如此處所用，指的是物理地分散的單位，其作為單位的劑量，適合于要被治療的對象；每個單位含有活性化合物的預先確定的量，其中活性化合物的量是計算好的，用以與需要的藥學載體聯用時產生期望的療效。本發明的單位劑型的規格取決于并直接依賴于活性化合物的獨特性質和所要取得的特定療效，以及本領域中將此種活性化合物進行復配用以治療個體的固有限制。一般地，要遞送給對象的CAB的量取決于許多因素，包括例如給藥途徑，CAB的活性，它特異性地定向于對象的期望細胞、組織或器官的程度，從對象中清除非特異性結合的CAB所需時間的長度，期望的療效，對象的體重，對象的年齡，對象的一般健康狀況，對象的性別，對象的飲食情況，對象對CAB的免疫應答，給予對象的其它藥物或治療，疾病的嚴重程度和先前或未來預期的治療過程。對于也給予前藥的應用，其它對治療有效量的確定有影響的因素將會包括，例如給予的前藥的量、前藥及其相對應活性藥物的活性以及前藥和活性藥物的副作用或毒性。CAB質量/對象質量的范圍的例子包括，例如從約0.001到30mg/kg體重，從約0.01到25mg/kg體重，從約0.1到20mg/kg體重；和從約1到10mg/g，2到9mg/kg，3到8mg/kg，4到7mg/kg或5到6mg/kg體重。在具體的實例中，采用范圍在約0.1到20mg/kg體重之間的CAB對對象進行治療，每周一次，持續約1到10周之間，優選為2到8周之間，優選為約3到7周之間，和優選為持續約4、5或6周。也應理解，在特定治療過程中，CAB的有效量可能增加或減少，并且治療將持續直到取得期望的結果或者直到治療因其它原因而中斷，其中所述治療可以是變化的，也可以是不變的。根據診斷性化驗的結果，劑量可以被改變，并且是顯而易見的，其中診斷性化驗如在此描述的。在本發明的一個實施方案中，也將前藥給予對象。應該理解，合適的前藥劑量依賴于許多因素，這些因素包括在普通的有技術的醫師、獸醫或研究者的知識領域中。例如，前體藥物的單次或多次劑量將依賴于與上述提供的影響CAB有效量的因素相同的因素。示范性的劑量包括每千克對象或樣本重量對應前藥的毫克或微克數(如每千克約1微克到每千克約500毫克、每千克約100微克到每千克約5毫克、或每千克約1微克到每千克約50微克)。應進一步理解，前藥的適宜劑量依賴于前藥相應于期望療效的效力。當這些前藥中的一種或多種要被給予動物(如人)時，醫師、獸醫或研究者可以，例如在最開始時開相對低劑量的處方，隨后增加劑量，直到取得適當的響應。優選地，對對象施用CAB，然后施用前藥。更優選地，給予CAB和給予前藥之間的時間間隔，足以使CAB能夠通過與它的靶標結合而聚集在其靶部位，并使未結合的CAB能夠從對象身體的非靶部分中被清除。最優選地，當給予前藥時，對象身體中與靶結合的CAB和未結合的CAB的比率為最大值或接近最大值。給予CAB之后達到這個程度所需要的時間，被稱為“清除時間(clearingtime)”。可以在實驗系統中對清除時間進行確定或估計，例如通過給予對象可檢測的CAB(如放射標記的或熒光標記的CAB)，并在定時的間隔同時測量靶部位和非靶對照部位的酶量。對一些前藥，特別是它們所對應的活性藥物為高毒性的前藥來說，確保對象系統內的未結合CAB低于一定閾值更加重要。這也可以通過實驗確定，正如上面所述。在一個實施方案中，前藥的施用是全身性的。在另一個實施方案中，前藥施用于要被結合的標靶處或施用在要被結合的標靶附近。藥物組合物可以與給藥的說明書一同包括在容器、包、分散器(dispenser)或藥盒中。實施例實施例1scFv的穩定pME27.1的構建質粒pME27.1的產生是將BglI-EcoRV片段插入表達載體pME25中，其中BglI-EcoRV片段編碼一部分pelB前導序列、CAB1-scFv和一小部分BLA(參見圖6)。編碼CAB1-scFv的插入片段是由Aptagen(Herndon，VA)合成的，是基于scFvMFE-23的序列合成的，其中scFvMFE-23的序列在[Boehm，M.K.，A.L.Corper，T.Wan，M.K.Sohi，B.J.Sutton，J.D.Thornton，P.A.Keep，K.A.Chester，R.H.Begent和S.J.Perkins(2000)BiochemJ346Pt2，519-28，Crystalstructureoftheanti-(carcinoembryonicantigen)single-chainFvantibodyMFE-23andamodelforantigenbindingbasedonintermolecularcontacts]中有描述。含有合成基因(pPCR-GME1)和pME25的質粒被BglI和EcoRV消化，凝膠純化，用Takara連接酶連接在一起。連接體被轉化進入TOP10(Invitrogen，Carlsbad，CA)電感受態細胞，涂平板于含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟的LA培養基上。質粒pME27.1含有如下特征質粒pME27.1的示意圖可以在圖6A中找到。CAB1序列可以在圖6B中找到，其中指明了重鏈和輕鏈區；氨基酸序列也可以在圖6D中找到，具有接頭(linker)和BLA。選擇用以進行誘變的突變將CAB1-scFv的vH和vL序列的序列與公開的人抗體頻率分析(BorisSteipe(1998)Sequenzdatenanalyse.(″SequenceDataAnalysis，僅作為德文可得)在Bioanalytikeds.H.ZorbasundF.Lottspeich，SpektrumAkademischerVerlag.S.233-241中)進行了比較。作者將如Kabat數據文庫中找到的人抗體的可變區片段的序列進行了比對，并計算每個位置上每種氨基酸出現的頻率。這些比對見圖8中。具體而言，圖8A顯示了人重鏈序列比對中的5種最豐富氨基酸的觀察頻率的比對情況。圖8B顯示的是人輕鏈序列比對中的5種最豐富氨基酸的觀察頻率的比對情況。我們將這些頻率與CAB1的實際氨基酸序列相比較，并鑒定出33個滿足下面標準的位置●該位置不是如Kabat命名法所定義的CDR的一部分。●在CAB1-scFv中出現的氨基酸在少于10％人抗體的同源位置上被觀察到。●該位置不是scFv的輕鏈中的最后6個氨基酸中的一個。得到的33個位置被選擇用來進行組合誘變(combinatorialmutagenesis)。針對33個位置中的每一個，合成了誘變寡核苷酸，以便使得靶位點將從CAB1-scFv中的氨基酸變成人抗體同源位置的最豐富氨基酸。圖6B顯示了CAB1-scFv的序列，CDRs和選擇用來進行組合誘變的突變。文庫NA05的構建表1列出了33個誘變寡核苷酸的序列，其用于產生組合文庫NA05表1采用33個誘變引物，使用Quik-Change多位點定向誘變試劑盒(QCMS；StratageneCatalog#200514)，構建組合物文庫NA05。根據模板質粒pME27.1，對引物進行設計，使得它們在感興趣的密碼子每側側翼具有17個堿基。運用大腸桿菌(E.coli)密碼子選擇表，對感興趣的密碼子作出改變，以編碼合適的共有氨基酸。所有的引物都設計成與模板DNA的同一鏈退火(即，在這種情況下都是正向引物)。除了所使用的引物濃度以外，QCMS反應按照QCMS手冊中的描述進行；QCMC手冊推薦在反應中每種引物使用50ng，而我們對每種引物使用3ng。也可以使用其它量的引物。具體而言，反應含有50-100ng的模板質粒(pME27.1；5178bp)，1μl引物混合物(10μM所有引物組合起來的儲液，含有的每種引物是0.3μM)，1μldNTPs(QCMS試劑盒)，2.5μl10xQCMS反應緩沖液，18.5μl去離子水(deoinizedwater)和1μl酶混合物(QCMS試劑盒)，總體積是25μl。熱循環程序是1個循環為95℃下持續1分鐘；接下來是30個循環，每個循環95℃下1分鐘、55℃下1分鐘、然后65℃下10分鐘。DpnI消化是通過加入1μlDpnI(QCMS試劑盒中提供)，在37℃下溫育2小時，另外加入1μlDpnI，并在37℃下再溫育2小時。1μl的反應產物被轉化入50μl來自Invitrogen的TOP10電感受態細胞(electrocompetentcell)中。電穿孔以后，加入250μlSOC，然后在37℃下進行1個小時的溫育，溫育過程伴隨振蕩。隨后，10-50μl的轉化混合物涂平板于具有5ppm氯霉素(CMP)的LA平板上或具有5ppmCMP和0.1ppm頭孢噻肟(CTX)的LA平板上，以選擇出活性BLA克隆。來自CMP+CTX平板的活性BLA克隆用于篩選，而來自CMP平板的隨機文庫克隆被測序，用以評估文庫的質量。16個隨機選擇的克隆被測序。這些克隆含有1到7個突變的不同組合。對改進型表達的篩選當TOP10/pME27.1在LB培養基中、于37℃下被培養時，完好的融合蛋白在1天后達到峰值，大部分融合蛋白在培養三天之后被宿主蛋白酶降解。降解似乎主要發生于CAB1融合蛋白的scFv部分，這是因為培養物在3之后含有相當數量的自由BLA，這可以使用Western印跡法(Westernblotting)或頭孢硝噻(nitrocefin)(Oxoid，NewYork)活性試驗來檢測。從而，我們對文庫NA05進行了篩選，該篩選能夠檢測CAB1-scFv的變異體，所述變異體可以在超過3天的37℃培養中對抗宿主蛋白酶的降解。將文庫NA05涂于LA培養基的瓊脂平板上，該LA培養基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟(Sigma)。將910個菌落轉移進總共10個的96-孔板中，其含有100μl/孔的LA培養基，所述LA培養基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟。每個板上有四個孔接種TOP10/pME27.1作為對照，每個板有一個孔留為空白。在37℃下，將板培養過夜。第二天，培養物被用來接種新鮮平板(生產平板(productionplate))，其含有100μl的相同培養基，接種使用的是轉移蓋印工具，甘油被加入到主平板中，貯藏于-70℃下。生產平板在加濕搖床中、于37℃下培養3天。向生產平板的每孔中加入100μlBPER(Pierce，Rockford，IL)，用以將蛋白質從細胞中釋放出來。將生產平板以PBST(含有0.125％Tween-20的PBS)稀釋100倍，對BLA活性進行測量是通過將20μl稀釋的裂解產物轉移到180μl頭孢硝噻(nitrocephin)分析緩沖液中，(0.1mg/ml頭孢硝噻(nitrocephin)，溶解在50mMPBS緩沖液中，其含有0.125％的辛基吡喃葡萄糖苷(octylglucopyranoside)(Sigma))，并使用Spectramax增強平板讀數計(Spectramaxplusplatereader)(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，在490nm下對BLA活性進行測定。使用如下程序，測量與CEA(癌胚抗原，BiodesignIntl.，Saco，Maine)的結合作用將96孔板進行包被，每孔以100μl的含有5μg/mlCEA的50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6過夜包被。用PBST對板進行洗滌，以300μl的酪蛋白(Pierce，Rockford，IL)封閉1-2小時。從稀釋100-1000倍的生產平板取出100μl樣品，加入到CEA包被的平板上，并將平板在室溫下放置2小時。隨后，用PBST將板洗滌4次，并加入200μl頭孢硝噻(nitrocefin)分析緩沖液，按照上面的描述測量BLA活性。通過CEA結合作用分析，測定了BLA活性，并且對裂解產物平板中的總體BLA活性進行比較，并鑒定出顯示高水平總體BLA活性和高水平CEA結合活性的變異體。以四個重復實驗，使用相似的實驗方案，對優勝者進行確認將優勝者在2ml含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟的LB中培養3天。使用BPER試劑將蛋白質從細胞中釋放出來。如上面的敘述進行結合作用分析；但對每個變異體，測試培養物裂解物的不同稀釋度。圖7A顯示了結合作用曲線。也通過SDS聚丙烯酰胺電泳對培養物上清液進行了分析。圖7B顯示來自NA05的7個變異體的電泳圖。標出了變異體NA05.6的融合蛋白帶。表2顯示6個變異體的等級。對數據進行了標準化，并計算了性能指數(performanceindex)。數據清楚地顯示出相較于融合構建物pME27.1，NA05.6產生出數量顯著較大的融合蛋白。表2顯示在穩定性方面具有最大改進的6個變異體的序列文庫NA06的構建克隆NA05.6被選作最好的變異體，并被用作第二輪組合誘變的模板；克隆NA05.6被叫做CAB1.1。用來產生文庫NA05，以便產生組合變異體的相同誘變引物的亞集合被予以使用，所述組合變異體具有下面突變K3Q，L37V，E42G，E136Q，M146V，F170Y，A194D，A234G；所述突變在來自NA05的其它優勝者中已經被鑒定出來。編碼突變S14P的引物并沒有被使用，因為它的序列與NA05.6(CAB1.1)中出現的突變R13K和T16G重疊。如上所述，使用QuikChangeMultisite構建組合文庫，并將其稱為NA06。模板是pNA05.6，并使用1μl的引物混合物(10μM儲液，由所有引物組合而成，每種引物為1.25μM)。文庫NA06的篩選篩選按照上面的敘述進行，具有如下的修改在3塊96孔板上，篩選291個變異體。將來自裂解液平板的10μl樣品加到180μl含有10μl/ml嗜熱菌蛋白酶(Sigma)的50mM咪唑緩沖液中，所述緩沖液pH7.0，含有0.005％Tween-20和10mM氯化鈣。該混合物在37℃下溫育1小時，以水解NA05.6(CAB1.1)的不穩定變異體。該經過蛋白酶處理的樣品被用來進行CEA結合實驗，如上面所述。在2ml培養基中，對有希望的變異體進行培養，如上面描述的，并取得了嗜熱菌蛋白酶處理后的樣品的結合曲線。圖7C顯示選定克隆的結合曲線。在嗜熱菌蛋白酶溫育以后，許多變異體保持了比母本NA05.6(CAB1.1)大得多的結合能力。表3顯示比NA05.6(CAB1.1)抗蛋白酶能力顯著較大的6個變異體所有的6個變異體都具有突變L37V；該突變在從相同文庫中隨機選出的克隆中是少見的。進一步的測試顯示，在所有變異體中，變異體NA06.6具有最高水平的總BLA活性和最高水平的抗蛋白酶抗性。選定NA06.6，并稱為CAB1.2。實施例2生成具有pH依賴性結合作用的scFv選擇誘變的位置根據相近同源物MFE-23的公開的晶體結構[Boehm，M.K.，A.L.Corper，T.Wan，M.K.Sohi，B.J.Sutton，J.D.Thornton，P.A.Keep，K.A.Chester，R.H.Begent和S.J.Perkins(2000)BiochemJ346Pt2，519-28，Crystalstructureoftheanti-(carcinoembryonicantigen)single-chainFvantibodyMFE-23andamodelforantigenbindingbasedonintermolecularcontacts]，構建了NA06.6(CAB1.2)的scFv部分的3D結構模型，使用的是軟件包MOE(ChemicalComputingGroup，Montreal，Canada)并且使用默認參數。結構的空間填充模型可以用肉眼檢查。CDRs的側鏈按下述評級0＝掩埋的，1＝部分暴露的，和2＝完全暴露的。側鏈與CDR3的距離按下述評級0＝側鏈是在CDR3內，1＝側鏈離開CDR3的距離為1個氨基酸，和2＝側鏈遠離CDR3的距離為2個氨基酸。在少數情況下，如果CDR側翼的殘基滿足距離和暴露標準的話，它們也被包括在內。根據這個評級，下面的側鏈被作為誘變的目標a)暴露＝2并且距離＝2或更小b)暴露＝1并且距離＜2CDR中40個位點符合這些標準。圖10顯示了CDRs和被選擇進行誘變的殘基。表4顯示被選擇進行誘變的40個位點的標準和位置。文庫NA08的構建構建了組合文庫，其中40個選定的部位被隨機地以天冬氨酸或組氨酸替換。選擇這個取代是因為已有報道，組氨酸側鏈和羰基基團之間的離子相互作用形成IgG分子和Fc受體間相互作用的pH依賴性的結構基礎[Vaughn，D.E.和P.J.Bjorkman(1998)Structure6，63-73.，StructuralbasisofpH-dependentantibodybindingbytheneonatalFcreceptor]。使用QuickChange多位點定向誘變試劑盒(QCMS；StratageneCatalog#200514)構建組合文庫NA08，其中使用40種誘變引物。對引物進行設計，使得它們在感興趣的密碼子的每側具有17個堿基，是根據模板質粒NA06.6(CAB1.2)進行。感興趣的密碼子被變成簡并密碼子SAT，以編碼天冬氨酸和組氨酸。所有的引物都被設計成與相同的模板DNA鏈退火(即這種情況下，均為正向引物)。除了所用的引物濃度以外，QCMS反應是按照QCMS手冊的描述進行；手冊推薦在反應中每種引物使用50-100ng，而在這個文庫中使用的每種引物的量顯著較低，因為這使得母體模板的背景較低。具體而言，所有引物合起來使用0.4μM。在最終反應中，單個簡并引物濃度為0.01μM(約2.5ng)。QCMS反應物含有50-100ng的模板質粒(NA06.6，5178bp)，1μl的引物混合物(所有引物的10μM儲液，目的在于給出上述提到的期望引物濃度)，1μldNTP(QCMS試劑盒)，2.5μl10xQCMS反應緩沖液，18.5μl去離子水，1μl酶混合物(QCMS試劑盒)，總體積是25μl。熱循環程序是1個循環為95℃下持續1分鐘，接下來是30個循環，每個循環是95℃下1分鐘、55℃下1分鐘、65℃下10分鐘。DpnI的消化是通過加入1μlDpnI(QCMS試劑盒中提供)，在37℃下溫育2小時，另外加入0.5μlDpnI并在37℃下再溫育2小時。1μl的每種反應產物被轉化進入50μl來自Invitrogen的TOP10電感受態細胞(electrocompetentcell)中。電穿孔以后，加入250μlSOC，然后進行1個小時的37℃下的溫育，溫育過程伴隨振蕩。隨后，10-50μl的轉化混合物涂于具有5ppm氯霉素(CMP)的LA平板上或具有5ppmCMP和0.1ppm頭孢噻肟(CTX)的LA平板上，以選擇活性BLA克隆。在兩種平板類型上取得的菌落數目是相當的(以10μl轉化混合物涂平板，CMP板上有652個菌落，CMP+CTX板上有596個菌落)。來自CMP+CTX平板的活性BLA克隆被用于篩選，而來自CMP平板的隨機文庫克隆被測序，用以評估文庫的質量。反應的引物如表4所示表4CDRs的引物變異體的測序變異體在含有5ppmCMP的LA培養物中、在37℃下被搖動培養過夜。使用Qiagen試劑盒少量制備DNA，并且用M13反向引物和nsa154f引物對每個克隆中的BLA基因進行測序。M13反向CAGGAAACAGCTATGACnsa154fGGACCACGGTCACCGTCTCCTC篩選pH依賴的結合將文庫NA08涂于具有LA培養基的瓊脂平板上，含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟(Sigma)。將552個菌落移進總共6個的96孔板中，其含有100μl/孔的LA培養基，所述LA培養基含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟。每個板上有四個孔接種TOP10/NA06.6作為參照。在37℃下將板培養過夜。第二天，培養物被用來接種新平板(生產平板)，其含有100μl的相同培養基，接種使用的是轉移蓋印工具(transferstampingtool)，在主平板中加入甘油，貯藏于-70℃下。生產平板在加濕搖動器中，37℃下培養2天。向生產平板，以每孔加入100μlBPER(Pierce，Rockford，IL)，用以將蛋白質從細胞中釋放出來。將生產平板用PBST(含有0.125％Tween-20的PBS)稀釋100倍，BLA活性的測量如上所述。使用如下方法測量與CEA(癌胚抗原，BiodesignIntl.，Saco，Maine)的結合將96孔板以每孔100μl的含有5μg/mlCEA的50mMpH9.6的碳酸鹽緩沖液包被過夜。以PBST對板進行沖洗，以300μl的酪蛋白(Pierce，Rockford，IL)進行1-2小時的封閉。將生產平板稀釋100-1000倍，取出100μl樣品加入CEA包被的平板中，并在室溫下放置2小時。隨后，用PBST將板洗滌4次，并加入200μl頭孢硝噻(nitrocefin)分析緩沖液，如上所述測量BLA活性。在pH6.5的50mM磷酸緩沖液中對CEA結合作用進行測定；并在單獨的實驗中，在pH7.4的50mM磷酸緩沖液中對其進行測定。通過CEA結合分析在pH6.5和pH7.4下測定BLA活性，然后將裂解物平板中發現的總BLA活性進行比較，并鑒定pH6.5下顯示出對CEA有良好結合性、但在pH6.5下結合性顯著變弱的變異體。對pH6.5下和pH7.4下的結合性進行比較，比較示于圖9中。對優勝者的確認是通過將它們在5ml的含有5mg/l氯霉素和0.1mg/l頭孢噻肟(Sigma)的LB培養基中、在37℃下培養2天。隨后，對培養物進行離心，將沉淀物懸浮于375μl的BPER試劑中，以釋放融合蛋白。BLA活性按照上面的描述進行測定。1單位活性被定義為能夠引起吸光度每分鐘增加1mOD的BLA量。根據樣品的BLA活性總量將其稀釋，根據上面的敘述進行CEA結合分析，但在每個孔中加入不同的樣品稀釋液。可以取得每個樣品的結合曲線，反映出變異體與CEA的親和力。圖11顯示pH7.4和pH6.5下測得的幾個感興趣的變異體的CEA結合曲線。所有的5個變異體顯示出CEA結合的pH依賴性的增加。鑒于母本NA06.6在pH6.5下結合性相比pH7.4下僅僅好一點，一些變異體在pH6.5下顯示出比pH7.4下強得多的CEA結合性。變異體NA08.15在pH7.4下顯示出非常弱的結合于CEA的能力，但在pH6.5下結合性顯著；該變異體被稱為CAB1.4。下面的表5，顯示具有最大結合改進的變異體中的突變。表5實施例3從CAB1.4誘變得到CAB1.6對CAB1.4重鏈的CDR3中的T100部位的密碼子進行飽和誘變。對位點飽和誘變，設計了互補寡核苷酸(oligo)ME239FATTATTGTAATGAGGGGNNSCCGACTGGGCCGTACTAME239RTAGTACGGCCCAGTCGGSNNCCCCTCATTACAATAAT，使得簡并密碼子(NNS)對應于T100，它兩側各有17個與CAB1.4同源的堿基對。寡核苷酸對(oligopair)被用來進行QuickChange(Stratagene)反應，使用CAB1.4DNA作為模板，根據生產廠商建議的實驗方案進行。PCR循環之后，用DpnI消化反應混合物，使用1μl轉化50μl的InvitrogenTOP10電感受態細胞。將轉化物涂在LA+5ppmCMP+0.1ppmCTX平板上，以選擇攜帶選擇性標記并在突變后仍然生產活性BLA的克隆。然后平板被用于挑出克隆，進行篩選。篩選過后，選出具有T100L突變(ACT-CTC)的克隆ME184.1(＝CAB1.6)，進行進一步的優化。實施例4誘變CAB1.6得到SW149.5用常規的QuikChange誘變方案(Stratagene)，使用質粒pME184.1作為模板，制得針對CAB1.6分子H3CDR的10個氨基酸殘基(G99，P101-Y109)的10個個體位點飽和小型文庫(mini-library)。對改進的親和性進行篩選以后，分離來自小型文庫SW129的克隆pSW129.5和來自小型文庫SW134的克隆pSW134.1。克隆pSW129.5從引物ME270F和ME270R新得到了突變T102L，如下面顯示的。克隆pSW134.1從ME275F和ME275R得到了新突變F107N，如下面顯示的。克隆pSW129.5被用作進一步誘變的模板并用來分離克隆pSW149.5，如下所述。在這個篩選中，也鑒定出P104和Y105部位的幾個突變。為了將這些突變以及克隆pSW134.1的F107N突變組合到pSW129.5骨架中，使用引物SW133F和SW133R，使用pSW129.5作為模板建立一個有限隨機化文庫(limitedrandomizedlibrary)。隨后，基于改進的表達和親和力，選擇了克隆pSW149.5。使用了下面的引物，如上所述ME270FGTAATGAGGGGCTGCCGNNSGGGCCGTACTACTTTGAME270RTCAAAGTAGTACGGCCCSNNCGGCAGCCCCTCATTACME275FCGACTGGGCCGTACTACNNSGACTACTGGGGCCAAGGME275RCCTTGGCCCCAGTAGTCSNNGTAGTACGGCCCAGTCGSW133FGAGGGGCTCCCGCTCGGGRVCNTTTACAACGACTACTGGGGCCAAGGSW133RCCTTGGCCCCAGTAGTCGTTGTAAANGBYCCCGAGCGGGAGCCCCTC實施例5誘變SW149.5得到CAB1.7利用幾種簡并引物，實現H2、L1和L2CDR的幾個氨基酸殘基的有限隨機化。選作靶標進行有限隨機化的殘基是H2CDR中的D57，T58，P62，Q65；L1CDR中的S163，S165和S166；以及L2CDR中的S186和S190。對這些變異體進行篩選，使得可以鑒定出蛋白上的、可能進一步改善蛋白與CEA的結合性的部位。使用引物SW134FP、SW135FP、SW136FP、SW137FP和SW138FP，使用QuikChange多位點誘變試劑盒(Stratagene)，按照制造商推薦的方法，制備了文庫SW155。對得到的文庫進行篩選，選出最佳的變異體，即克隆pSW155.17，這是因為它顯示出了顯著改善的結合CEA的能力；該克隆被命名為CAB1.7。使用下面的引物制備文庫SW155SW134FP[Phosp]CTTCTGGCTTCAACATTACCGACTCCTATATGCACTGSW135FP[Phosp]GCCTGGAGTGGATTGGATTATTGATCCTGAGAATGSW136FP[Phosp]GATCCTGAGAATGGTSWTRCTGAATATGCCCBGAAGTTCRNCGGCAAGGCCACTTTTACSW137FP[Phosp]CTGCAGTGCCAGCTCADCTGTAYMTDCCATGCACTGGTTCCAGCSW138FP[Phosp]CGTGATTTATGATACARVCAACCTGGCTRSTGGAGTCCCTGCTCGCTTC實施例6制備CAB1.6i和CAB1.7i圖12顯示CAB1.6i和CAB1.7i的開發，并表明了在該過程中并入的突變。為了對多種CAB1變異體的靶標結合性質進行比較，我們對如上提供的含有相應表達質粒的5mlTOP10F’培養物進行培養，所述培養是在含有5mg/l氯霉素LB培養基中、在25℃下、培養3天。將培養物進行離心，丟棄所得到的上清液。細胞沉淀物重新懸浮于500μLB-PER試劑中。將其溫育30分鐘。使用頭孢硝噻(nitrocephin)作為底物，對每個樣品中的內酰胺酶濃度進行測定，如上所提供的那樣。在50mM磷酸鹽緩沖液中，在pH6.5和pH7.4下，研究了樣品與包被有CEA的微量滴定板的結合，如上面所提供的那樣。結合曲線在圖13中示出。在相似的實驗中，對變異體結合LS174T細胞的能力進行了測定。將LS174T細胞接種于96孔聚苯乙烯板的培養基中，以1×105細胞/孔進行接種，其中培養基含有70％DMEM，30％F12，非必需氨基酸，L-Glut和丙酮酸鈉(SodiumPyruvate)(均來自Mediatech)。將板在加濕的CO2培養箱中，于37℃下，培養20小時。然后，以含有4％甲醛的PBS(Polysciences，Warrington，PA)固定細胞。以PBST對板進行洗滌，并在每孔中加入1mg/mlNaBH4(Sigma)，用以猝滅任何反應性基團。然后再用PBST對板進行洗滌。然后繼續進行與CAB分子的結合，其方式和結合到CEA抗原上相同。圖14顯示CAB1.2、CAB1.4、CAB1.6和CAB1.6結合LS174T細胞的結合曲線。CAB1.7在pH6.5下的結合親和力與CAB1.2在相同pH下的結合曲線近似。不同的是，pH7.4下的結合曲線顯示出顯著的差異。在pH7.4下，CAB1.7顯示出相比CAB1.2，與腫瘤細胞的結合顯著較弱。令人驚訝的是，CAB1.7結合曲線達到飽和水平，該飽和水平也是pH依賴的。這暗示著，相對于在pH7.4下而言，飽和時，在pH6.5下更多的CAB1.7分子可以結合到腫瘤細胞上。實施例7BLA的表位去除在β-內酰胺酶的序列上進行i-mune分析(免疫鑒定分析)，按照(提交于4/15/98的美國專利申請序列號09/060,872)的描述進行。Humanpopulation-basedidentificationofCD4+T-cellpeptideepitopedeterminants(CD4+T-細胞肽表位決定簇的基于人群體的鑒定)(JournalofImmunologicalMethods，28195-108)。使用69個社區供體外周血細胞樣品(communitydonorperipheralbloodcellsamples)。鑒定出4個CD4+T細胞表位。對每個表位肽序列，進行關鍵殘基檢測(criticalresiduetesting)。關鍵殘基檢測包括針對肽序列的丙氨酸掃描，以及由功能和結構限制指導的特定氨基酸修飾。將增殖水平減少到背景水平的肽表位序列，被選出并整合進入β-內酰胺酶的酶序列的DNA構建物中。修飾的酶蛋白變異體被表達和純化，然后采用人外周血細胞，體外檢測它們誘導細胞增殖的能力。誘導出最低水平的體外細胞增殖的變異體被選擇出來，以便包括進CAB1.6和CAB1.7中。實施例8CAB1.6i和CAB1.7i的構建如下所述，對質粒pME184(CAB1.6)和pSW155.17(CAB1.7)中的BLA基因進行突變，用以引入去免疫化的BLA(＝BLAi)基因，所述BLA基因含有去除K265A和S568A突變的表位。使用引物HR016F和HR017F，應用QuikChangeMultisite誘變試劑盒(Stratagene)，按照廠商推薦的方法，將兩個突變整合進入pME184.1(CAB1.6)中，得到質粒pSW175.3(CAB1.6i)。為了構建質粒pSW169.3(CAB1.7i)，將質粒pSW155.17中的BLA基因的0.9-kbNruI片段與來自質粒pCD1.1的另一個0.9-kbNruI片段交換，其中來自pCD1.1的片段含有兩個突變。下面的引物被使用HR016F[Phosp]GATTACCCCGCTGATGGCGGCCCAGTCTGTTCCAGHR017F[Phosp]CTACTGGCGGGTTTGGCGCGTACGTGGCCTTTATTCCTG實施例9CAB1.11i和CAB1.13i在帶有T1918腫瘤的無胸腺小鼠中的藥物動力學和組織分布表6概括描述了研究方案設計。將來自TaconicLabs的50只雌性小鼠，18-22g，約6-8周齡，植入源自于腫瘤的T1918細胞；是以皮下注射懸于DMEM培養基中的5×107細胞/mL的T1918細胞進行。通過吸入異氟烷麻醉動物，并通過皮下注射100μL細胞懸液植入細胞(約5×106細胞/小鼠)。表6研究設計植入腫瘤以后，至少每天對動物進行觀察，對瀕死的和痛苦的動物實施無痛致死術。每周對腫瘤測量兩次。當腫瘤達到約≥250mm3時，根據腫瘤大小和生長速率選擇出39個動物，并隨機分成4組。對第1組的三只小鼠不進行給藥，對第2組—第4組的每組12只動物，以單次IV推注給予CAB1.11i或CAB1.13i(1mg/kg)。用PBS將CAB1.11i和CAB1.13i分別配成0.05mg/mL和/或0.2mg/mL，并在60分鐘內注射。注射量是約100μL/小鼠，經由尾靜脈給藥。在劑量給藥的那天稱重小鼠；并且，劑量基于所有動物的平均重量。用熱燈和加熱墊溫暖小鼠，并將其置于限制器(restrainer)中。用70％的酒精擦拭尾巴，并經由尾靜脈、以快速靜脈注射給予劑量。在劑量給藥后的6小時、12小時、24小時和48小時時，用異氟烷(isoflourane)對每組中三個動物進行麻醉，并通過心臟穿刺將血液收集到EDTA中。對血液樣本，在收集的20分鐘之內進行離心，并收集血漿組分，冷凍在-70℃的冷凍器中。在CAB給予后的6小時、12小時、24小時和48小時時，對來自每組的3個動物進行麻醉，以收集血漿、腫瘤、肝和腎，并分析CAB濃度。從所有的動物收集肝、腎和腫瘤，進行沖洗、吸干、稱重并在液氮中速凍。對于來自對照組的血液和組織樣本，僅在基線(baseline)處予以收集。組織樣本在冰上的PBS中被勻漿化，PBS帶有15μg/mL抑肽酶(2mL緩沖液克組織)。將勻漿與B-PER混合(1∶1)，并予以離心。通過使用頭孢硝噻(nitrocefin)分析測量BLA活性，從而對組織上清液和血漿樣品中的CAB濃度予以確定，如上面所提供的。結果如圖16中所示。實施例10LS174TSCID模型中、在CAB1.2給藥24小時后的時刻給予的C-Mel或戊二酰-C-Mel的抗腫瘤活性對雌性CB17-SCID小鼠(7-9周齡，TaconicLabs)，使用懸于100微升體積的無血清DMEM中的2×106個LS174T細胞，進行皮下激發(MedimmuneACUCprotocol#ACF037)。當平均皮下(subcutaneous(SC))腫瘤體積約為100-150mm3時，將動物隨機分配成治療組。沒有可檢測腫瘤或腫瘤過大(體積＞300mm3)的動物被排除出去。根據研究方案設計(表7)，以劑量方式，將CAB1.2和/或前藥給予動物。1.劑量給藥溶液的制備C-Mel是如下配制的將冷凍貯存于-70℃下的、100mg/mL的溶解在DMSO中的C-Mel儲備溶液解凍，立即加到1.0M碳酸氫鈉(Nabicarbonate)中，以C-Mel1.0MNaHCO3的比例(V/V)為3.5∶1進行添加，渦旋混合(vortexed)，在5％蔗糖水溶液中稀釋至終濃度為15mg/ml，經由0.2微米過濾器裝置過濾除菌，并置于冰浴中直至使用。戊二酰-C-Mel是如下配制的對藥物進行稱量并溶于3.0當量(eq)的1.0MNaHCO3中。用渦旋混合器(vortex)將溶液混合均勻，并以5％蔗糖水溶液稀釋到30mg/mL的終濃度。將溶液以PBS進一步稀釋到20mg/mL，并置于冰袋上保存，直至施用。荷瘤的動物被給予100微升的配制在PBS中的CAB1.2，劑量為1mg/kg，經由尾靜脈單次IV快速注射。在CAB1.2給藥后24小時時，根據研究方案設計，對動物通過單次IV快速注射給予C-Mel或戊二酰-C-Mel，給藥量為75mg/kg或150mg/kg。通過每天的觀察和每周一次的體重測定，對毒性進行監測。每周兩次對腫瘤進行測量。平均腫瘤體積超過2000mm3的治療組被無痛處死，腫瘤過大和/或壞死的個體動物被無痛處死。如果研究中剩下的動物少于6個，將治療組無痛處死，除非欲監測獲得針對腫瘤再生長的完全響應(completeresponse)的個體動物。收集數據，所有治療組的中值腫瘤體積被確定±SEM，并繪制成圖，用以進行分析(腫瘤激發之后的天數對腫瘤體積)。腫瘤應答如圖17所示，其中x軸是以天為單位的時間，y軸是以mm3為單位測量的腫瘤體積。圖18顯示毒性-存活。x軸顯示以天為單位的時間，y軸顯示活小鼠的整數數目。圖19顯示毒性-體重。x軸顯示以天為單位的時間，y軸顯示體重百分數。實施例11在T-LS-174-T腫瘤荷瘤無胸腺小鼠中、給予CAB1.2之后的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2的功效和毒性研究方案設計如表8所示。來自TaconicLabs的40只18-22g的雌性Ncr小鼠，被植入源于腫瘤的TLS174T細胞，植入是通過皮下注射、以2×107細胞/mL懸于DMEM中的細胞進行。動物通過異氟烷吸入法被麻醉，細胞的植入是通過皮下注射100μL細胞懸液(約2×106個細胞/小鼠)進行。表8.研究方案設計儲備溶液是這樣制備的在帶有螺旋帽的無菌聚苯乙烯試管中，將戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2溶解在DMSO中，濃度為100mg/mL。用無菌過濾的NaHCO3(1M)對儲備溶液進行稀釋，達到碳酸氫鹽比藥物的摩爾比為3∶1，并用渦旋混合器(vortexmixer)混合均勻。以5％(w/v)無菌蔗糖溶液將溶液稀釋到10mg/mL，得到10％的DMSO濃度。儲備溶液的制備是在稀釋的24小時之內，經過稀釋的物質是在制備的60分鐘之內予以施用。當腫瘤達到約≥250mm3時，根據腫瘤大小和生長速率選擇出20個動物，并編制成4組。每組5只小鼠，不進行給藥；或者給予CAB1.2i(1mg/kg)，然后在CAB給藥后24小時時給予單次劑量的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(50或100mg/kg)；或者在CAB給藥后的24小時和48小時時給予兩次劑量的戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2(100mg/kg)。CAB配制成0.2mg/mL，戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2配制成10mg/mL，如表9所規定。表9測試物的濃度和劑量體積所有的測試物品都在稀釋和配制的60分鐘內注射。經由尾靜脈給藥，注射量為約100μL/小鼠(CAB1.2i)或200μL/小鼠(戊二酰-C-Mel-L-Phe-NH2)。當腫瘤達到≥250mm3，將動物編制成組。在給藥的那天(第1天)對小鼠進行稱重，并且劑量以全部動物的平均體重為基礎。用熱燈和加熱墊溫暖小鼠，并將其置于限制器(restrainer)中。用70％的酒精擦拭尾巴，并經由尾靜脈快速靜脈注射給予劑量。在第8天和中間的一天，對后來的體重進行測量，其中中間的一天取決于時間安排(第4天或第5天)。對動物進行籠邊(cageside)觀察，觀察毒性體征和癥狀。處死瀕死的或痛苦的小鼠，并對其尸體進行解剖。尸體解剖在任何動物被發現死亡的2小時內進行。在第8天，通過CO2吸入對所有動物進行無痛處死，并進行尸體解剖。所有動物的腎和腫瘤，以及任何異常的組織或器官，都在尸體解剖的當時，用福爾馬林進行固定，用于組織病理學。每周對腫瘤測量2次，持續45天。平均腫瘤體積超過2000mm3的治療組被無痛處死，腫瘤過大和/或壞死的個體動物被無痛處死。在第45天，所有剩下的動物通過吸入CO2無痛處死。實施例12在SCID小鼠的LS184T人直腸結腸模型中的CAB1.2的抗腫瘤活性用懸浮于體積為100微升的無血清DMEM中的2×106LS174T細胞，對雌性CB17-SCID小鼠(8-10周齡，TaconicLabs)，進行皮下(SC)激發(MedimmuneACUCprotocol#ACF037)。當中值腫瘤體積約為100-150mm3時，將動物隨機地分類成治療組。無可檢測腫瘤的動物和腫瘤過大(體積＞300mm3)的動物被排除。在這個研究中，在接種腫瘤細胞之后的第8天、第14天和第21天給予CAB1.2和p97-特異性的ADEPT構建物(P97ADEPT)，然后劑量給予C-Mel，其中p97-特異性的ADEPT構建物并不顯著地結合到LS174T細胞上。經靜脈(IV)將溶解在PBS中的CAB1.2給予荷瘤動物，劑量為1或2.5mg/kg，注射體積以PBS計為100微升。C-Mel(其作為100mg/ml的DMSO中的冰凍溶液貯藏在-70℃下)被新鮮配制(15mg/ml，以0.1M碳酸氫鈉PBS的比例為5∶4)；并基于平均體重基準，以150mg/kg的劑量，對所有接受前藥的治療組進行給藥，經由尾靜脈IV推注，注射體積是200微升。新鮮配制梅爾法蘭(2mg/ml，在20％DMSO/PBS中)并進行腹膜內給藥，注射體積為100微升。治療組在下面的表10中列出。簡言之，被給予2.5mg/kg的CAB1.2的動物，在CAB1.2處理后的18小時或36小時時，被給予C-Mel。被給予1mg/kg的CAB1.2的動物，在CAB1.2處理后的24小時時，被給予C-Mel。對照組如下未治療者；單獨給予2.5mg/kgCAB1.2；10mg/kg梅爾法蘭；單獨給予C-Mel；給予2.5mg/kgP97ADEPT，18小時之后再給予C-Mel；給予1.5mg/kgβ-內酰胺酶(BLA，1.5mg/kg，其與使用的2.5mg/kgCAB1.2BLA摩爾濃度相等)，18小時后給予C-Mel。每星期重復一次治療，進行三個周期。每星期進行兩次腫瘤測量(毫米為單位)；進行腫瘤測量的人員對治療組不知情。表10每天對動物的全身表現進行監視，每周對動物體重測量一次，每周進行兩次腫瘤測量。收集數據，并且所有治療組的中值腫瘤體積被確定為±SEM，繪制成圖，用以進行分析(腫瘤攻擊后的天數對腫瘤體積)。圖21-23描述了研究的功效結果。在第8天，當小鼠第一次接受CAB1.2蛋白時，治療組的中值腫瘤體積約為177mm3。在研究的這個階段，腫瘤倍增時間(Tumordoublingtime)大約為24-26小時；當18-36小時后給予C-Mel時，CAB1.2和P97ADEPT治療組中的腫瘤體積幾乎倍增到約315mm3。一般地，相比于未治療、梅爾法蘭、C-Mel、BLA或CAB1.2對照組，接受CAB1.2、并在CAB1.2給藥后的第18小時、第24小時或第36小時加上C-Mel的治療組，在研究期間，顯示出更高的腫瘤生長抑制作用。在腫瘤細胞攻擊后的第24天，18、24或36小時后給予C-Mel的CAB1.2治療組的腫瘤生長抑制比率，分別為未治療對照組的70％、75％和68％(p＜0.05，雙尾T檢驗(two-tailedT-Test)，假設每一個獨自分析為異方差)。在第15-34天中，當劑量給予P97ADEPT之后的18小時給予C-Mel時，觀察到了相似程度的腫瘤生長抑制(在第24天，相比未治療組，存在～63％的生長抑制，p＜0.05)，這表明BLA融合蛋白的非特異性瘤內保留。在隨后的時期里，CAB1.2/C-Mel治療組相對P97ADEPT/C-Mel治療組，在腫瘤生長抑制比率上出現了分離，具體而言，在第44天，24小時CAB1.2/C-Mel治療組與P97ADEPT/C-Mel治療組相比而言，在中值腫瘤體積上具有三倍的差距，這是顯著性的(分別地，611mm3±176對1871mm3±379，p＜0.05)。在第44天，將C-Mel治療組作為比較者，則24小時CAB1.2/C-Mel和18小時P97ADEPT/C-Mel治療組給出的生長抑制率分別為89％和68％(p＜0.05，相比C-Mel治療組)。在CAB1.2/C-Mel18小時和36小時治療組中的剩余動物也給出了與CAB1.2/C-Me124小時治療組一致的結果(分別為87％和89％的生長抑制)。在24小時CAB1.2/C-Mel治療組中，有兩個動物的可測量腫瘤塊在外觀上完全消退(在第16天和第44天記錄到)。在第34天，BLA/C-Mel治療組具有顯著的抗腫瘤活性(相比未治療對照組，腫瘤生長抑制為65％，p＜0.05)。本研究在第44天結束。在多個不同的治療組中觀察到了治療相關的毒性，該毒性由體重減輕(圖21)和動物死亡(圖22)所表明，所述治療組包括接受CAB1.2加上C-Mel的治療組。在第9天，當給予第一次C-Mel劑量時，測出各個治療組的平均體重，并被用作荷瘤動物的基線體重(baselineweight)，用以確定每個治療組內的體重損失。接受CAB1.2之18小時后接受C-Mel的治療組，在完成第三輪CAB1.2/C-Mel治療之后，在第16天的體重減輕為13％，第24天為21％。在治療中，由于程序上的錯誤，一個動物在第14天被丟失。所觀察到的與毒性相關的死亡如下第27天發現2個動物死亡，第30和34天發現各有3個動物死亡；在18小時CAB1.2/C-Mel治療組的研究中，總計是8/9毒性相關致死。接受CAB1.236小時后再接受C-Mel的治療組，在第16天體重減輕8％，第24天體重減輕20％。一個動物在第12天被處死，原因在于腫瘤部位的過度壞死。毒性相關的死亡如下第16天發現1個動物死亡，第27天發現2個動物死亡，第30天、第34天和第37天各發現1個動物死亡；在36小時CAB1.2/C-Mel治療組的研究中，總計是6/9毒性相關致死。接受CAB1.224小時后再接受C-Mel的治療組，在第16天體重減輕為12％，在第24天體重減輕為19.7％。毒性相關的死亡如下在第30天、第34天和第37天各發現1個動物死亡；在24小時CAB1.2/C-Mel治療組的研究中，總共有3/10毒性相關致死。梅爾法蘭治療組，在第16天體重減輕11％，在第24天體重減輕12.5％。毒性相關的死亡如下第24天、第34天和第37天發現各有一個動物死亡；在單獨使用梅爾法蘭的治療組的研究中，總共有3/10毒性相關致死。相對于起作用的治療組而言，剩下的治療組沒有一個表現出顯著毒性，盡管BLA/C-Mel治療組第24天被記錄到確實具有的體重減輕為16.7％。CAB1.2與C-Mel聯用，在LS174T腫瘤模型中取得了顯著的腫瘤生長抑制活性，具有＞80-90％的腫瘤生長抑制率，并且在個別動物中，觀察到某種程度的腫瘤消退。在一些治療組中使用的攻擊性(aggressive)劑量和時間表產生毒性，這是意料之中的。三個周期的治療是有毒性的，記錄到顯著性體重減輕和動物死亡；但在兩個周期的療法中，特別是在接受1mg/kgCAB1.2的CAB1.2/C-Me124小時治療組中，觀察到可接受的毒性。以最大耐受劑量(MTD)給予梅爾法蘭，造成了30％動物死亡，這與在24小時CAB1.2/C-Mel治療組中所觀察到的死亡數目相近，但梅爾法蘭具有比該24小時CAB1.2/C-Mel治療組顯著較小的功效；在第34天，抑制率分別為34％和86％(對于CAB1.2/C-Mel，p＜0.05；p＝并不顯著，就梅爾法蘭相對未治療對照組而言)。并且，在梅爾法蘭治療組中，未發生腫瘤消退；而24小時CAB1.2/C-Mel治療組中，2/10的動物具有可觸摸腫瘤塊的完全消退。在不引起過多動物死亡、在不進一步改進腫瘤響應的情況下，本研究中使用的梅爾法蘭的MTD劑量和時間表不能被超越。P97ADEPT/C-Mel和BLA/C-Mel治療組也具有顯著的抗腫瘤活性，表明這些分子在C-Mel給藥18小時時間點上的非特異性腫瘤保留；但是，在研究期間不像24小時CAB1.2/C-Mel治療組那么有效。圖20顯示的是，與對照組相比，CAB1.2/前藥組合起來聯用之后的動物體重效應。x軸表示天為單位的時間，y軸表示以克為單位測量出的治療組體重。圖21圖示的是，相比對照組，CAB1.2/前藥并用的存活情況。x-軸表示以天為單位的時間，y軸表示存活動物的數目。圖22顯示的是，與對照組相比，CAB1.2/前藥并用的功效。x軸表示以天為單位的時間，y軸表示以mm3為單位測量出的腫瘤體積。如實施例中敘述的，在第8天、第14天和第21天，動物接受CAB1.2和對照物。對于第3組(CAB1.2/C-Mel，24小時)，在第16天和第44天中的每一天，觀察到有一個動物中存在完全響應(completeresponse)。在計算中值腫瘤體積的時候，這些動物的腫瘤體積值被記作0mm3。各組如下第1組CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，18小時)；第2組CAB1.2/C-Mel(2.5mg/kg，36小時)；第3組CAB1.2/C-Mel(1mg/kg，24小時)；第4組未治療的對照組；第5組單獨CAB1.2(2.5mg/kg)；第6組單獨GCR9885；第7組梅爾法蘭(10mg/kg)；第8組P97ADEPT/C-Mel(2.5mg/kg，18小時)；第9組BLA/C-Mel(1.5mg/kg，18小時)。實施例13CAB1.13i和CAB1.11i在無胸腺小鼠上的源于腫瘤的TLS174T人結腸直腸腫瘤模型中的抗腫瘤活性本研究，在源于腫瘤的T-LS174T荷瘤的雌性無胸腺小鼠中，對使用CAB1.13i和CAB1.11i并隨后給予戊二酰-C-Mel的功效進行比較。使用PBS，將CAB1.11i稀釋到0.05mg/mL和0.2mg/mL，將CAB1.13i稀釋到0.2mg/mL。在稀釋的60分鐘內給予劑量。對戊二酰-C-Mel進行稱量并溶解于3.0eq的1.0MNaHCO3中。用渦旋混合器(vortex)將溶液混勻，并以5％蔗糖水溶液稀釋到30mg/mL的終濃度。使用PBS將溶液進一步稀釋到20mg/mL，并在冰袋上保存直到施用。研究設計如表11中所概括。70只雌性小鼠被植入源于腫瘤的TLS174T細胞，所述植入是通過皮下注射懸于DMEM中的2×107個細胞/mL的TLS174T細胞進行。通過異氟烷吸入法對動物進行麻醉，通過皮下注射100μL細胞懸液(約2×106個細胞/小鼠)將細胞植入。當腫瘤達到約≥250mm3，根據腫瘤尺寸和生長速率選擇50只小鼠并分成5組。每組10只小鼠不給予任何物質；或給予CAB1.11i(1或0.25mg/kg)；或給予CAB1.13i(1mg/kg)，隨后在CAB給予后24小時給予戊二酰-C-Mel(150mg/kg)。將CAB配成0.05mg/mL和/或0.2mg/mL，戊二酰-C-Mel配制成30mg/mL。所有的測試物都在稀釋和配制的60分鐘內注射。注射約為100μL/小鼠，經由尾靜脈給藥。表11研究設計1CAB給藥后24小時進行給藥腫瘤植入以后，至少每天對動物進行觀察，并對瀕死的和痛苦的動物實施無痛處死。每周對腫瘤進行兩次測量，每周記錄體重。當腫瘤達到≥250mm3時，將動物分成組。在給藥的當天對小鼠進行稱重，劑量是基于所有動物的平均重量。用熱燈和加熱墊溫暖小鼠，并將其置于限制器中。用70％的酒精擦拭尾巴，并通過尾靜脈的快速靜脈注射給予劑量藥物。平均腫瘤體積超過2000mm3的治療組被無痛處死，腫瘤過大和/或壞死的個體動物被無痛處死。如果研究中剩下的動物少于6個，將治療組無痛處死，除非欲監測獲得針對腫瘤再生長的完全響應(completeresponse)的個體動物。處死瀕死的或痛苦的小鼠。在第45天，剩下的小鼠通過CO2吸入被無痛處死，并對其進行尸體解剖。將異常的組織或者器官，以福爾馬林進行固定，用于組織病理學。從所有的動物收集腫瘤，并置于福爾馬林中，用以進行組織病理學研究。計算了所有治療組的體重和中值腫瘤體積±SD，并繪圖以進行分析(體重減輕百分數和腫瘤攻擊后天數對腫瘤體積)。結果如圖23中所示。實施例14Ropo2抗體的構建BLA的一種特異性抗體，即Ropo2，其被按照如下所述予以構建。將BLA懸于PBS緩沖液(1mg/ml)中，通過與等體積的完全弗氏佐劑(CompleteFreund′sAdjuvant)(總體積0.6ml)混合而被乳化，并且注射進入3到4個皮下背側部位中，用以進行初次免疫。隨后的免疫是使用不完全弗氏佐劑進行的，劑量為200μg/兔。收集時，從關節動脈對動物進行放血。使血液凝結，并通過離心收集血清。在-20℃下貯藏血清。實施例15腫瘤系列免疫組織化學法(tumorpanelIHC)以評價靶抗原分布和結合特異性本研究中使用的冷凍組織樣品，是從Ardais’BIGRLibrary(Ardais)獲得的。Genencor提供CAB以及兔多克隆的抗-BLA抗體Ropo2的制品。使用IHC分析，并使用細胞角蛋白抗體(DakoCytomation)作為陽性對照。請參見表12。表12將冷凍樣品在-80℃下移出并在-20℃下放置2小時。恒冷切片機(cryostat)設置為-20℃，切片樣品在被切成5μm的厚度。將切片置于PlusSlides上，并在切片時貯存在置于干冰上的顯微鏡載玻片盒中。在室溫下將切片風干30分鐘。將切片置于丙酮中，在室溫下放置10分鐘。在室溫下，以洗滌緩沖液(WashBuffer)(DakoCytomation，編號#S3006，批次#044312)對切片進行2-3×5min的沖洗。在Dako自動染色器上進行IHC。用抗體稀釋劑(AntibodyDiluent)(DakoCytomation，編號#S0809，批次#123113)將抗體稀釋到如下的濃度CAB抗體稀釋到0.2μg/ml，Ropo2抗體稀釋到0.1μg/ml。在室溫下以大約～200μl過氧化物酶封閉劑(PeroxidaseBlock)對樣品進行5分鐘的溫育。以洗滌緩沖液對抗體進行2×5min的沖洗。在室溫下將約～200μl蛋白封閉劑(ProteinBlock)(DakoCytomation，編號#X0909，批次103183)與樣品一同溫育10分鐘。加入～200μlCAB抗體，室溫下持續30分鐘。以洗滌緩沖液對樣品進行2×5分鐘的沖洗。室溫下加入約～200μlRopo2抗體，并室溫下溫育30分鐘。以洗滌緩沖液(WashBuffer)對樣品進行2×5分鐘的漂洗。加入～200μl來自檢測系統(DetectionSystem)的第二抗體(SecondaryAntibody)，溫育30分鐘。用沖洗緩沖液對樣品進行2×5分鐘的漂洗。將樣品在～200μlChromagen(DetectionSystem(Envision+System，HRP(DAB)Rabbit)中提供的DAB+——DakoCytomation，編號#K4011，批次#11367))中溫育5分鐘。用蒸餾水洗滌樣品5分鐘。用蘇木素(Hematoxylin)(RichardAllen，編號#7211，批次#35053)對樣品復染30秒鐘，其中蘇木素提供藍色核染色。將樣品漂洗5分鐘。將樣品在上藍劑(BluingReagent)(RichardAllen，編號#7301，批次#19540)中浸兩次。將樣品用蒸餾水漂洗5分鐘。用95％乙醇2×2分鐘、100％乙醇2×2分鐘對樣品進行脫水，并在二甲苯中使其透明。帶著培養基(Medium)(RichardAllen，編號#4111，批次#18071)將樣品放在載玻片上，并加上蓋玻片。在這個免疫組織化學(IHC)研究中，四種CAB抗體CAB1.2i，15聚體接頭；CAB1.2i，30聚體接頭；CAB1.11i和CAB1.4i被針對組織系列進行分析，其中組織系列由5個肺腫瘤樣品、3個結腸腫瘤樣品和5個胰腫瘤樣品組成。圖26顯示本研究的全部結果。第一列詳細說明病例診斷；第二列詳細說明組織來源和發現部位；第四列顯示以抗人細胞角蛋白AE1/AE3染色，第五列到第八列顯示針對四種抗體具有15聚體接頭的CAB1.2i，具有30聚體接頭的CAB1.2i，CAB1.11i和CAB1.14i的染色。四種抗體在所有的被測腫瘤樣品中顯示出強免疫染色(強度為2-3+)，并且它們的染色圖案非常相似，如果說不是相同的話。除了一個例外，即CI000005496-FF5以外，所有的樣品顯示存在的腫瘤細胞中超過75％發生染色。在基質細胞中也觀察到最小的、淺的(1-2+)染色，這在采用冰凍組織切片時有時會觀察到，其中基質細胞包括成纖維細胞和偶爾混入的炎癥細胞。壞死細胞和肺泡內巨噬細胞(在肺組織的樣品中觀測到)一致顯示出陽性染色。樣品中存在的鄰近正常組織主要是陰性的，在正常的肺組織或胰組織中沒有觀察到陽性染色。樣品CI0000008475是一個結腸癌轉移到肝中的病例，其中所見的正常肝組織顯示出淺的染色，染色被局限在具有三種抗體(CAB1.2i15聚體接頭，CAB1.11i，和CAB1.2i30聚體接頭)的竇狀區域。第四種抗體(CAB1.14i)顯示出更強的、更加彌散的染色，90％正常肝實質(parenchyma)被染色。對四種被測抗體的染色特征進行了比較，只觀察到了最小限度的變化性。在四種被測抗體中，CAB1.14i顯示出稍微深一些的背景染色。細胞角蛋白抗體，其被用于選定的樣品，以確保組織抗原被適當地保存；對上皮細胞顯示出強陽性染色。在“無-初次抗體(no-primaryantibody)”的對照中，沒有看到染色。實施例16在腫瘤源TLS174T荷瘤雌性無胸腺小鼠中合并隨后施用GC-Mel時，CAB1.2i15聚體，CAB1.2i30聚體，CAB1.14i和CAB1.11i的抗腫瘤活性配制給藥溶液在給藥當天配制，在60分鐘內給藥。每個配制的給藥溶液的等分試樣，在分析前都保持和貯藏在-70℃下。對CAB，分析蛋白質濃度和BLA活性。對GC-Mel和Mel的化合物濃度進行分析。GC-Mel的制備對大塊藥進行稱量，并溶解在3.0eq(當量)的1.0MNaHCO3中。用渦旋混合器(vortex)將溶液混合均勻，并以5％的蔗糖水溶液將溶液稀釋到30mg/mL的終濃度，如上所述。動物接受100μL配制的給藥溶液。Mel的制備對大塊藥進行稱量，并溶解在含有20％DMSO的酸化PBS(pH4.0)中，形成終濃度為2mg/mL。每只動物接受100μL配制的給藥溶液。物種/品系/年齡/數量/來源150只雌性Ncr無胸腺小鼠，18-22g，約6-8周齡，來自TaconicLabs，被植入TLS174T人結腸直腸腫瘤。基于腫瘤大小和生長速率，選擇出100只動物用以劑量給藥。研究設計表13中概括了研究設計。小鼠被植入TLS174T細胞(在研究的第0天)；當腫瘤達到約≥250mm3時，根據腫瘤大小和生長速率選擇100只動物，并將其分成10組，使得組間的中值腫瘤大小相近。每組10只小鼠被給予CAB1.2i，15聚體，CAB1.14i或CAB1.11i(1或0.25mg/kg)或CAB1.2i，30聚體(0.25mg/ml)，然后在CAB給藥后的24小時時給予GC-Mel(150mg/kg)。10只小鼠被給予載體(vehicle)，Mel(10mg/kg)或GC-Mel(150mg/kg)。表131五只動物將被給予20mM檸檬酸鈉，150mMNaCl的1∶10稀釋度的PBS稀釋液，pH6.0；五只動物被給予含有20％DMSO的酸化PBS(pH4.0)2CAB給藥24小時后給予GC-Mel腫瘤植入將TLS174T細胞植入到150只雌性小鼠中，是通過皮下注射懸于DMEM中的、2×107細胞/mL的TLS174T細胞進行。通過吸入異氟烷，將動物麻醉，通過皮下注射100μl細胞懸液(約2×106細胞/小鼠)植入細胞。植入的當天被稱作研究的第0天。給藥、觀察和樣品收集腫瘤植入以后，至少每天對動物進行觀察；并對瀕死的和痛苦的動物實施無痛致死術。每周對腫瘤進行兩次測量，每周對體重進行記錄。當腫瘤達到≥250mm3時，將動物分成組。在給藥的當天對小鼠進行稱重，劑量是基于所有動物的平均重量。用熱燈和加熱墊溫暖小鼠，并將其置于限制器中。用70％的酒精擦拭尾巴，并通過尾靜脈的快速靜脈注射給予劑量藥物。平均腫瘤體積超過1500mm3的治療組被無痛處死，腫瘤過大和/或壞死的個體動物被無痛處死。如果研究中剩下的動物少于6個，將治療組無痛處死，除非要監測達到針對腫瘤再生長完全響應(completeresponse)的個體動物。在第45天，剩下的小鼠通過CO2吸入被無痛處死并對其進行尸體解剖。將異常的組織或者器官以福爾馬林進行固定，用于組織病理學。從所有的動物收集腫瘤并置于福爾馬林中，用以進行組織病理學研究。結果如圖27所示。給予CAB，隨后給予前藥的，顯示出腫瘤體積的下降。然而，該同一組顯示出某種程度的體重減輕。實施例17在荷異種移植TLS174T的NCR裸鼠中，CAB1.14i或CAB1.2i，15聚體給藥之后，GC-Mel的24小時間隔的藥動學和組織分布配制給藥溶液在給藥的當天配制，并在配制的兩個小時內使用。劑量濃度基于所有小鼠的平均體重，并配制成以100μL/鼠遞送。物種/品系/年齡/數量/來源Ncr無胸腺小鼠，年齡約為8-10周齡，來自TaconicLabs，它們被種植TLS174T人直腸結腸腫瘤。TLS174T是一種細胞系，是從通過小鼠傳代的LS174T建立的。LS174T細胞系最初是從ATCC購買的。對TLS174T細胞進行例行的支原體污染檢查，結果為陰性。根據腫瘤大小和生長速率，選擇126只動物給予劑量。研究設計表14中概括了研究設計。對動物不進行給藥，或者通過靜脈注射給予CAB1.14i(1mg/kg)或1.2i，15聚體(1mg/kg)。在CAB給藥后的24小時、48小時、72小時或96小時時，動物接受單次推注劑量的GC-Mel(100mg/kg)。GC-Mel給藥后的60分鐘期間，收集血漿、腫瘤、肝和腎，用以分析GC-Mel濃度。表14研究設計1CAB1.2i15-聚體或CAB1.14i給藥之后的給藥時間2GC-Mel給藥后收集腫瘤植入小鼠通過皮下注射植入TLS174T細胞，TLS174T細胞懸浮于DMEM中、為2×107細胞/mL。通過吸入異氟烷對動物進行麻醉，通過注射100μL細胞懸液(約2×106細胞/小鼠)植入細胞。給藥、觀察和樣品收集腫瘤植入以后，至少每天對動物進行觀察，瀕死的和痛苦的動物被無痛處死。每周對腫瘤進行兩次測量，每周記錄體重。當腫瘤達到約200-400mm3，將動物分成組。在給藥的當天對小鼠進行稱重，劑量是基于所有動物的平均重量。用熱燈和加熱墊溫暖小鼠，將其置于限制中，并通過尾靜脈的快速靜脈注射給予劑量。在收集樣品之時，所有的小鼠通過異氟烷吸入法被麻醉。通過心臟穿刺將血液收集到裝有EDTA的管中，并置于冰上。在13,000RPM下對管離心2分鐘。將血漿部分移到事先標記的微量離心管中，并置于干冰上。進行分析之前，所有的血漿樣品都貯藏在-70℃下。用LC/MS/MS對血漿樣品的血漿GC-Mel濃度進行檢測。結果如圖28-30所示。已經對本發明的優選實施方案進行了描述，對本領域普通技術人員顯而易見的是可以對已公開的實施方案進行各種各樣的修改，這些修改被意圖包括在本發明的范圍之內。本領域技術人員容易想到，本發明可以被充分調整以實現提到的目標和取得所提到的結果和益處，以及其固有的那些目標、結果和益處。在此描述的分子復合物和方法、過程、治療、分子、具體的化合物是目前有代表性的優選實施方案，它們是示范性的，并不意圖對本發明的范圍進行限制。本領域技術人員會容易想到，可以對在此公開的本發明做出不同的替代和修改而不背離本發明的范圍和精神。在本說明書中提到的所有專利和公開代表了本發明所屬領域技術人員的水平。在此引入所有的專利和公開作為參考，到達如此同一的程度如同每個單獨的公開被特別地和獨立地引入作為參考。特別地，在此引入作為參考的AttorneyDocketNumber(s)839etseq(如839-2P)，是以其完整形式引入，包括任何圖。在此示范性地適當描述的本發明，可以在缺乏任何未在此特別公開的一個或多個要素，一個或多個限制下而被實施。使用的術語和措辭是用于描述而不是用于限制，并不意圖使用這些術語和措辭排除顯示和描述的特征的任何等價特征，或者它們組成部分，但應該認識到在本發明所要求的范圍內，多種修改是可能的。從而，應該理解，盡管通過優選實施方案和任選的特征具體地公開了本發明，本領域技術人員可以對在此公開的構思采取修改和變化，這些修改和變化被認為屬于本發明的范圍，其中本發明的范圍由附帶的權利要求書限定。在此寬泛地和一般性地對本發明進行了描述。每個落入一般性公開的更窄的種類和亞類分組也是本發明的組成部分。這包括本發明的這樣的一般性描述其具有限制性條款或負限制，所述限制性條款或負限制從本類中除去任何對象物質，不管被去除的材料是否在此被特別地提出。權利要求1.CAB分子，其包括氨基酸序列，該氨基酸序列具有SEQIDNO1中說明的序列。2.CAB分子，其包括氨基酸序列，該氨基酸序列是從SEQIDNO1闡明的氨基酸序列修飾而來，其中所述修飾是從下述的位置中選出的至少一個位置第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位，其中位置編號根據圖1所示的SEQIDNO1。3.根據權利要求2的CAB分子，其中所述修飾是在第100位、第184位和第226位。4.根據權利要求2的CAB分子，其中所述修飾是在第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位。5.根據權利要求2的CAB分子，其中所述修飾是從下面各項選出的至少一個修飾T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，S163A，S165Y，Y166A，S184D和S226D。6.根據權利要求5的CAB分子，其中所述CAB分子包括下面的修飾T100L，S184D和S226D。7.CAB分子，所述CAB分子包括氨基酸序列，該氨基酸序列具有圖2所示的SEQIDNO2中說明的序列。8.根據權利要求7的CAB分子，進一步包括選自下面各項的至少一個修飾3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置編號根據圖2所示的SEQIDNO2。9.根據權利要求8的CAB分子，進一步包括選自下面各項的至少一個修飾K3Q，R13K，T16G，L37V，T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，M146V，S163A，S165Y，Y166A，W181V，S184D，S226D，K265A和S568A。10.根據權利要求9的CAB分子，進一步包括SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9或SEQIDNO10。11.根據權利要求9的CAB分子，進一步包括SEQIDNO7中說明的序列。12.根據權利要求9的CAB分子，進一步包括SEQIDNO8中說明的序列。13.根據權利要求9的CAB分子，進一步包括SEQIDNO9中說明的序列。14.根據權利要求9的CAB分子，進一步包括SEQIDNO10中說明的序列。15.編碼CAB分子的核酸，其中所述CAB分子包括氨基酸序列，所述氨基酸序列含有SEQIDNO1中說明的序列。16.編碼CAB分子的核酸，其中所述CAB分子具有從SEQIDNO1中所說明的氨基酸序列修飾而來的氨基酸序列，其中所述修飾是在選自下面各項的至少一個位置上第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位，其中位置編號根據圖1所示的SEQIDNO1。17.根據權利要求16的核酸，其中所述修飾是在第100位、第184位和第226位。18.根據權利要求16的核酸，其中所述修飾是在第100位、第102位、第104位、第105位、第107位、第163位、第165位、第166位、第184位和第226位。19.根據權利要求18的核酸，其中所述修飾是從下面各項選出的至少一個T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，S163A，S165Y，Y166A，S184D和S226D。20.根據權利要求19的核酸，其中所述CAB分子包括下面的修飾T100L，S184D和S226D。21.編碼CAB分子的核酸，其中所述CAB分子包含氨基酸序列，該氨基酸序列具有SEQIDNO2中列出的序列。22.根據權利要求21的核酸，進一步包括選自下面各項的至少一個修飾3，13，16，37，100，102，104，105，107，146，163，165，166，181，184，226，265和568，其中位置編號根據SEQIDNO2，如圖2中所示。23.根據權利要求22的核酸，進一步包括選自下面各項的至少一個修飾K3Q，R13K，T16G，L37V，T100L，T102L，P104A，Y105I，F107N，M146V，S163A，S165Y，Y166A，W181V，S184D，S226D，K265A和S568A。24.根據權利要求23的核酸，進一步包括SEQIDNO7，SEQIDNO8，SEQIDNO9或SEQIDNO10。25.根據權利要求23的核酸，進一步包括在SEQIDNO7中列出的序列。26.根據權利要求23的核酸，進一步包括在SEQIDNO8中列出的序列。27.根據權利要求23的核酸，進一步包括在SEQIDNO9中列出的序列。28.根據權利要求23的核酸，進一步包括在SEQIDNO10中列出的序列。全文摘要本發明涉及CAB分子、針對CEA的ADEPT構建物，以及它們在診斷和治療中的用途。文檔編號C07H17/00GK1913913SQ200480041551公開日2007年2月14日申請日期2004年12月10日優先權日2003年12月12日發明者J·A·福克斯,F·A·哈丁,V·舍倫貝格爾申請人:金克克國際有限公司