專利名稱：：TNF-α結合肽和TNFR1封閉肽及其在治療TNF相關疾病中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術，特別涉及能拮抗腫瘤壞死因子-a(TNF-a)生物學活性的TNF結合肽、TNFR1封閉肽等小分子多肽及TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白。
背景技術：
：TNF-a是一類重要的促炎癥細胞因子，是促炎細胞因子瀑布反應中的起始因子，可促進一系列促炎細胞因子(如IL-l、IL-6、IL-8等)的釋放。臨床研究證實在多種感染或非感染性炎癥及其并發癥(如類風濕性關節炎等自身免疫病、內毒素休克、急性肝壞死、Crohn's病等)的發生和發展中，全身或炎癥局部TNF-a產生增加起著關鍵作用；體內TNF-a水平過高，往往預示病人預后不良。在動物實驗中，單一應用大劑量TNF-a即可直接導致內毒素樣休克，而用抗TNF抗體則可減輕及阻止內毒素性休克的發生。轉TNF-a基因小鼠易患慢性關節炎；最近報道給大鼠輸入TNF-a可誘導胰島素抵抗，此為II型糖尿病發生的重要機制。(WilliamsR0，MethodsMolecularBiology,2006，361:265-284;YanoY等，DiabetesCare，2004，27(3):844-845。)與TNF發病相關的疾病的發病率在國內外呈大幅度上升的趨勢。例如，全球II型糖尿病患者總人數已超過1.5億人，預計到2025年將達到3億人；在我國大城市中，20歲以上人群的II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病)發病率達到10%，另有10%為糖調節異常，即每5個成年人中就有一個糖代謝異常。在我國，目前已有類風濕性關節炎患者400萬以上，患病率達總人口的0.32-0.34X，Crohn's病(人群潰瘍性結腸炎)、銀屑病、強直性脊柱炎以及系統性紅斑狼瘡等的與TNF發病相關的疾病的發病率在我國正在逐年上升。由于TNF-a在多種疾病中有重要的致病作用，因此，以TNF-a或TNF受體為靶點設計藥物，有效阻斷上述病理過程，治療TNF相關疾病，成為國際藥學界研究開發的熱點(SteedPaulM等，Science,2003，301，18951898;ScottD.L.等，TheNewEnglandJournalofMedicine,2006，355:704-712)。目前，國際上已獲FDA和EMEA(EuropeanMedicinesEvaluationAgency)正式批準，在美國和歐洲已進入臨床試用階段的抗TNF-a試劑主要有抗TNF抗體鼠人嵌合單克隆抗體(IgGl)，商品名為infliximab、cA2、Remicade或Centocor，(Centocor，Inc，Malvern，PA，FDAlicensed.#1242，8/24/1998)靜脈注射，人源化抗TNF抗體adalimumab(商業名Humira，CDP571License12/2002)，全人源化抗體(D2E7)也已問世。可溶性TNF受體TNFR1-Fc融合蛋白(Etanerc印t、Enbrel或Immunex)(Imm皿exCorp，Seattle,WA，License#1132，6/6/2000)。上述商品化的抗TNF-a試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)雖然已取得較好的臨床治療作用，但仍然存在一系列問題，如存在潛在的副作用、來源受到限制、生物穩定差、價格昂貴等。目前，臨床試驗已發現上述抗TNF-a試劑(抗TNF抗體、可溶性TNF受體)存在導致紅細胞和血小板減少、結核感染、上呼吸道、尿路感染、皮疹、發熱、低/高血壓等副作用，嚴重者有可引發腫瘤。目前，研究開發安全性好、毒副作用小、成本低的小分子TNF-a拮抗劑已受到人們的關注。(SteedPaulM.等，Science,2003，301，18951898;Gonzale-ReyE等，ProcNatlAcadSciUSA，2006，103(11)4228-4233。)噬菌體表面呈現技術(phagedisplaytechniques,PDT)是九十年代初發展起來的一項新興技術(LowmanH.B.等.An皿.Rev.Biophys.BiomolStruct1997;26:401-24)，是研究蛋白質分子之間相互作用的一個有效工具。PDT所得到的肽均是來源于噬菌體肽庫，氨基酸序列分析得到肽的序列，人工合成進行機制研究。隨著肽庫構建及篩選技術的不斷發展、完善，使其對研究蛋白質識別機制、確定抗原決定簇、藥物設計、疫苗研制等方面提供了全新的思路與先進的手段。現有的噬菌體隨機肽文庫主要有兩種非限制性肽庫(線性肽庫)和限制性肽庫(例如半胱氨酸環限制的肽庫、引入a-螺旋等二級結構的突變庫等)。一般研究所選用的噬菌體隨機肽庫都是線性的。
發明內容本發明一方面選擇噬菌體12線肽庫，以rhTNFRl為誘佴，從中釣取出一條線性的12肽，該肽可與TNFR1結合，競爭性抑制TNF-a與TNFR1的結合，從而拮抗TNF-a的生物學效應，我們將此肽命名為"TNFR1封閉肽"。但人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內的半衰期較短，從而制約其臨床應用。為了克服這些缺陷，本發明又在此工作的基礎上，構建TNFR1封閉肽一Fc融合蛋白表達載體pIG/3C-TNFRlBP，并借助可高表達外源蛋白的真核細胞C0S7成功表達TNFRlBP/hFc融合蛋白。體外實驗證實這種融合蛋白也能有效地競爭性抑制TNF-a與TNFR1結合，從而發揮拮抗TNF-a生物學活性的作用；體內實驗也證實這種融合蛋白能預防和治療高脂高糖誘導的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型。另一方面，由于與線肽庫相比噬菌體隨機環肽庫具有以下優點(l)由于環肽固定了兩個半胱氨酸殘基，附加二硫鍵的限制可以幫助維持肽的折疊結構。因此，環肽庫比線性肽庫更可能篩選到高親和力、高特異性的肽。因為它經歷了構象的選擇，使之盡可能與靶分子表面和內部結合。(2)環肽由于其構象的復雜性，故其降解速度較線肽慢，使之半壽期明顯延長。(3)由于受到轉化效率的影響，噬菌體肽庫不可能達到完全的隨機化，各種肽庫的多樣性就存在差異。因此，本發明又選擇噬菌體C7C環肽庫，分別以rhTNF-a和rhTNFRl為誘餌，從該環肽庫中篩選TNF結合肽和TNFR1封閉肽。通過體外實驗證實這兩種環肽能抑制TNF-a介導的生物學效應；體內實驗證實這兩種環肽抑制三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的大鼠潰瘍性結腸炎。本發明的目的在于提供一種TNFR1封閉肽(線12肽)和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白。本發明的目的還在于提供編碼所述TNFR1封閉肽和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白的核酸分子。本發明目的還在于提供制備本發明融合蛋白的方法。本發明的目的還在于提供一種TNF結合肽(環9肽)與一條TNFR1封閉肽(環9肽)。本發明的目的還在于提供上述TNF結合肽(環9肽)與TNFR1封閉肽(環9肽)的核酸分子。本發明的目的還在于將上述TNF結合肽(環9肽)和TNFR1封閉肽(環9肽)應4用于治療潰瘍性結腸炎；將TNF-a受體1封閉肽用于治療關節炎；將TNFR1封閉肽_Fc融合蛋白用于治療II型糖尿病。本發明技術方案內容如下—、TNFR1封閉肽(12線肽)和TNFR1封閉肽_Fc融合蛋白1.借助噬菌體展示技術，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與TNFR1結合的含12個氨基酸的線肽(TNFR1封閉肽)；2.體外實驗證實人工合成的該封閉肽可以完全封閉大鼠腹腔巨噬細胞的呼吸爆發(何亞萍等，中國免疫學雜志，2003，19(6):385-387);3.體內實驗證實該封閉肽可有效減輕佐劑性關節炎大鼠模型的局部關節腫脹及炎癥細胞的浸潤，并可抑制促炎癥細胞因子的產生，顯示具有較好的治療作用(何亞萍等，藥學學報，2003，38(12):889-892)。4.構建TNF封閉肽-IgFc融合蛋白(1)借助DNA合成技術，構建該封閉肽的編碼DNA片段(并含內切酶位點)；(2)借助分子克隆技術將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達載體中，構建TNFR1I封閉肽-IgFc的重組體，其技術路線見圖36。(3)將此重組體瞬時轉染C0S7細胞使之成功表達TNFRl封閉肽-hFc融合蛋白；利用間接免疫熒光、流式細胞技術、胞毒抑制實驗證實此融合蛋白可與細胞表面TNFR1結合，從而抑制TNF-a的生物學活性；用RT-PCR及激光共聚焦顯微鏡檢測證實此融合蛋白可明顯抑制TNF誘導的單核細胞NF-KB核轉位，從而抑制促炎細胞因子IL_1PmRNA和IL_8mRNA的轉錄。(4)將重組體轉染CH0-K1和BHK-21細胞并建立穩定表達的細胞株，對其分泌的肽-IgFc融合蛋白進行純化并檢測其穩定性和生物學效應；5.融和蛋白的主要藥效研究，如體外對炎性細胞活化的影響以及體內對高脂喂養大鼠引起的II型糖尿病的預防和治療作用。二、TNF結合肽(環9肽)與TNFR1封閉肽(環9肽)1.采用噬菌體隨機環9肽庫展示技術分別以hrTNF-a和hrTNFRl為誘餌進行親和篩選及生物學效應鑒定得到分別能與TNF-a和TNFR1特異性結合的TNF結合肽(環9肽)與TNFR1封閉肽(環9肽)。(尹丙姣等，華中科技大學學報醫學版，2005，34(6)670-677)2.外實驗證實人工合成的TNF結合肽與TNFR1封閉肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細胞膜上TNFR1結合；非變性聚丙烯凝膠電泳證明TNF結合肽與TNFR1封閉肽之間不互為配體和受體而相互結合；TNF結合肽與TNFR1封閉肽對TNF-a的細胞毒效應均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，二者聯用的效果更好；TNF結合肽與TNFR1封閉肽聯用能有效抑制TNF-a和IFN-Y誘導的單核細胞呼吸爆發強度，抑制TNF-a誘導的IL-IP、IL-8mRNA轉錄。(尹丙姣等，細胞與分子免疫學雜，2007，已校對，待發表)3.體內實驗證實人工合成的TNF結合肽與TNFRl封閉肽聯用可顯著減輕TNBS誘導大鼠實驗性潰瘍性結腸炎的病理損傷，改善癥狀，有效抑制大鼠血清和結腸組織中NO含量以及結腸組織中MPO活性的活性，抑制大鼠腹腔巨噬細胞中、IL-8的mRNA轉錄和結腸組織中TNF-a蛋白的表達，對TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎具有治療作用。(尹丙姣5等，免疫學雜志，2007，已投稿)通過以上所述并結合后文實施方式，本領域技術人員不難看出本發明的特征和優點。制作用)一、圖1至圖22:TNFR1封閉肽(12線肽)和TNFR1封閉肽-Fc融合蛋白圖1TNFR1封閉肽(12線肽)對TNF-a誘導的大鼠腹腔M①呼吸爆發的影響(抑圖2.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導大鼠腹腔M①IL-1PmRNA的影響圖3.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導大鼠腹腔MOTNF-amRNA的影響圖4.TNFR1封閉肽對TNF-a誘導大鼠腹腔MONF-kBp65核轉位的影響圖5.TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關節炎踝關節病理改變的影響(X200)圖6.TNFR1封閉肽對佐劑性關節炎大鼠腹腔MOIL-1PmRNA的影響圖7.TNFR封閉肽對佐劑性關節炎大鼠腹腔MOTNF-amRNA的影響圖8.重組表達載體pIG/3C-TNFRBP的酶切鑒定圖譜圖9.融合蛋白TNFRI-hlgGFc的表達濃度與轉染時間的關系圖10.融合蛋白TNFRI-IgGFc的Western-Blotting鑒定圖11.間接免疫熒實驗檢測融合蛋白與TNFR的結合圖12.流式細胞術檢測TNFR封閉肽-hlgGFc融合蛋白與TNFR的結合能力圖13.胞毒實驗檢測融合蛋白對TNF-a胞毒效應的拮抗作用圖14.融合蛋白對TNF-a誘導人單核細胞IL-113mRNA轉錄的影響圖15.融合蛋白對TNF-a誘導人單核細胞IL-8mRNA轉錄的影響圖16.融合蛋白對TNF-a誘導單核細胞NF-kB核轉位的影響圖17.高脂高糖誘導大鼠肥胖和胰島素抵抗圖18.融合蛋白可抵抗高脂高糖誘導的大鼠肥胖圖19.融合蛋白對肥胖大鼠糖耐量的影響圖20.融合蛋白能提高胰島素的敏感性圖21.融合蛋白抑制TNF-a的產生圖22.融合蛋白促進組織中胰島素剌激的IRS-1酪氨酸磷酸化二、圖23至35:TNF結合肽(環9肽)與TNFR1封閉肽(環9肽)圖23.不同噬菌體克隆對TNF-a誘導U937細胞毒效應的抑制率作用圖24.噬菌體聯用對TNF-a誘導U937細胞毒效應的抑制作用圖25.各噬菌體與靶蛋白結合的特異性圖26.TNFR封閉噬菌體對TNF-a誘導IL-1PmRNA水平的抑制作用，圖中1.陰性對照；2.TNF-a;3.TNF-a+pha.X2;4.TNF-a+pha.X4;5.pha.X2;6.pha.X4;M.Marker圖27.TBP和TRBP對GFP-TNF融合蛋白與L929細胞TNF受體結合的影響，圖中A:GFP-TNFB:GFP_TNF+無關肽C:GFP-TNF+p印.38+X4圖28.TBP和TRBP的非變性聚丙烯凝膠電泳圖，圖中1:p印.382:p印.X43:6p印.38+X4圖29.TBP和TRBP對TNF_a介導的U937細胞毒效應抑制作用的劑量反應關系圖30.TBP和TRBP對TNF-a禾PIFN-Y誘導單核細胞呼吸爆發的影響圖31.TBP和TRBP對TNF-a誘導Mo的IL-1P、IL_8mRNA的抑制作用，圖中1:正常對照2:TNFa對照3:TNF-a十p印.X4;4:TNF—a+pep.385:TNF-a+pep.38+X4圖32.各種治療對潰瘍性結腸炎大鼠結腸病理改變的影響圖33.各實驗組大鼠結腸組織病理改變(10X)，圖中A.正常對照組；B.模型組；C.無關肽對照組D.聯合多肽治療組；E.抗體治療組F.5-氨基水楊酸治療組圖34.各種治療對結腸炎大鼠腹腔M小中1L-1P和IL-8mRNA水平的影響，圖中1.生理鹽水對照組2.模型組3.多肽治療組4.無關肽對照組5.抗體治療組6.5-氨基水楊酸治療組圖35.各種治療對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TNF-a蛋白表達的影響(40X)，圖中A.正常對照組；B.模型組；C.無關肽對照組D.多肽治療組；D.抗體治療組E.5-氨基水楊酸治療組三、圖36.借助分子克隆技術將目的基因插入含有人免疫球蛋白Fc段的真核表達載體中，構建TNFR1封閉肽-IgFc重組體的技術路線圖。具體實施例方式—、TNFRl封閉肽(12線肽)和TNFRl封閉肽_Fc融合蛋白實施例1TNFR1封閉肽的篩選及其特異性鑒定借助噬菌體展示技術，以hrTNFRl蛋白為誘餌從噬菌體12線肽庫中篩選到可與TNFRl結合的含12個氨基酸的線肽(TNFRl封閉肽)，其具體篩選過程同下述實施例7之7.1。實施例2TNF受體封閉肽(12線肽)對大鼠腹腔巨噬細胞功能的影響以下TNFRl封閉肽(12線肽)粉劑均由由第三軍醫大學合成。2.lTNF受體封閉肽對TNF-a誘導的大鼠腹腔M①呼吸爆發的影響采用NBT法檢測常規分離大鼠腹腔巨噬細，向3X105/ml大鼠腹腔巨噬細胞加入TNF-a(5ng/ml)100ill禾P/或TNFRl封閉肽(10yg/ml)100y1，每組設3個復孔；然后加入100y1/孔NBT(2mg/ml)，放37°CC02培養箱中45分鐘；再加入70%甲醇溶液100y1/孔，固定5min;棄上清，用70%甲醇溶液洗3次；空氣干燥，最后加入120ii/孔2M的K0H溶液和140y1/孔的DMSO，立即混勻，在波長630nm下測其OD值。結果如圖1:外源性TNF2a可明顯增強M小的呼吸爆發，約為對照組的3倍(P〈0.05)，而TNF受體封閉肽則能完全阻斷TNF-a誘導的M小呼吸爆發，其值幾乎接近于其基礎值，提示該肽可競爭性抑制TNF-a誘導的M小呼吸爆發。2.2TNFR1封閉肽對大鼠腹腔M①IL-1P、TNF-amRNA的影響采用RT-PCR檢測IL-iPmRNA和TNF-amRNA:常規分離大鼠腹腔巨噬細，用TRIzolRNA分離試劑盒提取細胞總RNA，逆轉錄按照BoerhingerMannheim公司逆轉錄試劑盒說明書進行。取2iU上述逆轉錄產物作模板，分別用IL-IP特異性引物(P1-GATAACCTGCTGGTGTGTGA;P2-CTTGTGAGGTGCTGATGTAC)、TNF-a特異性引物(Pl-GCGGATCATGGTCAGATCATCTTCTCGAA;P2-CCCAAGCTTCAGGGCAATGATCCCAAAGTA)、P-actin特異性引(Pl-AACGGCTCCGGCATGTGCAA;P2-CTTCTGACCCATGCCCACCA)進行PCR擴增，IL-1的PCR循環為94°C30s，62。Clmin，72°Clmin，26個循環，74。ClOmin;TNF-a的PCR循環如下94。C30s，58。C30s，72。Clmin，28個循環，74t:10min。取5iUPCR產物加入liU6X上樣緩沖液混合，在80伏恒壓下進行2%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，在短波紫外燈下觀察結果并照相。結果如圖2所示對照組M小未見IL-1PPCR產物出現(泳道4)，TNF-a剌激3h后的M小可見明顯的IL-1PcDNA特異性條帶(泳道2)，而TNF受體封閉肽則可顯著抑制TNF-a誘導的IL_1PmRNA的表達(泳道3)，因為其PCR產物條帶明顯減弱，通過密度掃描進行相對定量，證實TNFR1封閉肽的抑制率達50X以上，提示TNFR1封閉肽可有效抑制活化的M小表達IL_1PmRNA。同時，結果還顯示(如圖3)，未受剌激的M小不表達TNF-amRNA(泳道4)，TNF-a可誘導M小強表達TNF-amRNA，因為圖中可見一條強的特異性PCR產物條帶(泳道2)，而用TNFR1封閉肽則可使TNF-a的PCR產物條帶明顯減弱(泳道3)，其抑制率約為50%，提示TNFR1封閉肽可部分阻斷TNF-a的正反饋作用。2.3TNFR1封閉肽對TNF-a誘導大鼠腹腔M①NF-kBp65核轉位的影響NF_kBp65核轉位的檢測取用TNFa(5ng/ml)和/或TNFRl封閉肽(lOyg/ml)剌激lh后的大鼠腹腔巨噬細胞(lX107)，用冷PBS洗滌，12000r/min，lmin離心，收集細胞；加入400ii1細胞膜裂解液重懸細胞；冰上腫脹10min加入0.5XNP240至終濃度為0.1%0.125X;振蕩10s，12000r/min，lmin離心；加入10y1核膜裂解液重懸沉淀物；冰上放置30min，12000r/min，lmin離心，收集上清，按常規方法做Westernblot。免疫染色的抗體為兔抗人IgGNF-kBp65多克隆抗體和HRP標記的羊抗兔IgG抗體，均購自北京中山生物技術有限公司。結果如圖4所示。未加任何剌激的對照組無條帶出現，提示在正常情況下腹腔巨噬細胞核內無NF-kBp65存在(泳道1)，單獨給予TNF-a剌激lh后，大量NF-kBp65向細胞核內轉位，因為出現明顯的NF-KB特異性條帶(泳道3);用TNFRl封閉肽后，則使TNF-a誘導的NF-KB條帶明顯減弱(泳道2)，提示TNFR1封閉肽能部分抑制TNF-a誘導的NF-kBp65核轉位。實施例3TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關節炎的影響3.l大鼠佐劑性關節炎的建立Wistar大鼠，$，體重150200g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供。弗氏完全佐劑。實驗分組對照組注射生理鹽水O.lml/只；模型組在大鼠右足墊部皮內注射弗氏完全佐劑(F5881，購自美國Sigma公司)0.lml/只；治療1組注射佐劑后，立即注射TNFR1封閉肽0.lml/只，劑量分別為0.5和1.Omg/kg體重，qd，每個劑量4只，連續治療10d，治療2組方法與劑量同治療組l，連續治療20d后用游標卡尺測量大鼠踝關節腫脹度(cm)并取關節組織按常規做組織切片，HE染色。注射佐劑后，大鼠煩躁不安，右腳不敢著地行走，18h后出現右后肢踝關節明顯紅腫，走路緩慢，進食減少等臨床表現；d3右后肢踝關節腫脹減輕，但d8紅腫再度加重(表l);在接種1018d后，形成多發性關節炎，表現為未注射佐劑一側(左后肢)的踝關節輕度紅腫(結果未顯示)，與人類RA的發病過程極為相似。而注射TNF受體封閉肽后數天，大鼠情緒穩定，行走基本自如，踝關節腫脹有所減輕等。病理切片顯示，大鼠佐劑性關節炎的踝關節滑膜組織中有大量的炎性細胞、漿細胞的浸潤，血管翳形成并伸向關節表面，關節腔腔隙縮小，關節軟骨發生破壞(如圖5)。說明大鼠佐劑性關節炎模型建立成功。3.2TNF受體封閉肽對大鼠佐劑性關節炎關節腫脹的影響用游標卡尺測量大鼠踝關節腫脹度(cm)。結果(表1)顯示大鼠踝關節注射佐劑后18h明顯腫脹，但d3則有所減輕，dlO腫脹再度明顯，此后腫脹程度隨時間延長而加重；用TNF受體封閉肽(lmg/kg體重)后，前3d無明顯療效，但10d后，治療組踝關節腫脹基本消退，與未注射佐劑對照組相似。所用兩種藥物劑量組之間的療效無顯著性差異。3.3TNF受體封閉肽對佐劑性關節炎病理變化的影響按常規做組織切片，HE染色。結果顯示經每日lmg/kg體重的TNF受體封閉肽持續治療20d后，與未用藥的佐劑性關節炎大鼠相比，其踝關節滑膜細胞層增生程度減小，滑膜組織充血、水腫好轉，關節腔內炎性細胞浸潤明顯減少以及關節軟骨破壞程度減輕等。但與正常大鼠的踝關節切片相比，治療組尚未完全恢復正常(如圖5)。表1.TNFR1封閉肽對大鼠佐劑性關節炎踝關節腫脹程度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>*模型組與正常組相比P<0.001**治療組與模型組相比P<0.0013.4TNF受體封閉肽對佐劑性關節炎大鼠腹腔巨噬細胞IL_1PmRNA的影響取對照組、模型組與治療20d的大鼠腹腔巨噬細胞5X107ml，RT-PCR分析方法同實施例1.2。結果如圖6所示正常大鼠腹腔巨噬細胞沒有IL-113mRNA的轉錄，因為未檢測到RT-PCR產物；注射佐劑后的模型組大鼠的腹腔M①出現一條強的IL-113cDNA特異性條帶(泳道4)，而用TNF受體封閉肽治療后的大鼠腹腔M①的IL-iPcDNA條帶則明顯減弱(泳道2)，通過密度掃描進行相對定量，證實TNF受體封閉肽的抑制效率為50%。同樣的方法測得結果如圖7所示正常大鼠腹腔M①未檢測到TNF-a的RT-PCR產物(泳道3)，佐劑性關節炎組大鼠的腹腔M小有明顯TNF-a特異性RT-PCR產物條帶出現(泳道2)，而經TNF受體封閉肽治療大鼠的腹腔M①的TNF-a條帶則明顯減弱(泳道4)。通過密度掃描進行相對定量，證實TNF受體封閉肽的抑制率達30%以上。實施例4TNFRl封閉肽-hlgGFc真核表達載體(PIG/3C_TNFR1BP)構建和鑒定經上述體內外實驗證實此條TNFRl封閉肽(線12肽)能抑制TNF_a的生物學活性，并對大鼠佐劑性關節炎有較好的治療作用。但是，由于人工合成短肽的成本昂貴，且短肽在人體內的半衰期較短，從而制約其臨床應用，因此本發明通過人工合成編碼TNFRl封閉肽的寡核苷酸，將其插入真核細胞Fc表達載體pIG/3C，從而成功構建TNFRl封閉肽-人Fc表達載體pIG/3C-TNFRlBP，并在真核細胞C0S7中成功表達TNFRl封閉肽-Fc融合蛋白(TNFRlBP/hlgFc)。具體實施方案如下4.1合成TNFRl封閉肽基因TNFRl封閉肽基因片段由美國PE公司391型DNA自動合成儀合成(上海生物工程技術有限公司)，在封閉肽寡核苷酸正負鏈5'端和3'端分別引入Kpnl酶切粘性末端序列和BamHI酶切后粘性末端序列。4.2TNFR1封閉肽單鏈DNA的復性由于經DNA合成儀合成的TNFRl封閉肽基因為正負兩條DNA單鏈，為使其形成雙鏈DNA分子構像和完整的限制性酶BamHI和Kpnl酶切后粘性末端序列，需將正負兩鏈在一定條件下進行復性。復性方法如下將合成的TNFRII封閉肽基因的正負鏈分別溶于10mmol/LTris-HCl(pH8.5)溶液內，使兩鏈的終濃度均為10iimol/L。取正負鏈各20iil，置同一1.5ml離心管內，加4.4ii110XPCRbuffer,IO(TC煮沸3min，置室溫自然冷卻，即得復性的雙鏈TNFRl封閉肽基因。4.3質粒pIG/3C的轉化、擴增及大量提取主要方法均參照盧圣棟主編的《現代分子生物學實驗技術》(第2版)(精)一書進行。4.4TNFR1封閉肽-hlgG真核表達載體(PIG/3C-TNFR1BP)構建將提取的質粒pIG/3C經BamHI和Kpnl酶切后以低熔點瓊脂糖電泳回收目的片段。利用合成的TNFR1封閉肽基因兩端的酶切粘性末端序列，與pIG/3C經BamHI和Kpnl酶切回收產物進行連接反應。取連接反應液轉化感受態Mcl061，挑選6個氨芐和四環素抗性的菌落，小量法提取質粒，酶切產物行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，長波紫外燈下觀察。結果圖8所示3號克隆酶切產物在泳道上可見一大小約為90bp的酶切片段，其分子量與插入的目的基因片段大小相符(泳道3)。4.5重組載體pIG/3C-TNFRlBP導入C0S7細胞采用Lipofectin2000介導的轉染技術(參閱其產品說明書)。取對數生長期的C0S7細胞，使90X長滿。實驗前，在12X75mm無菌玻璃管內制備下列溶液SolutionA:10ng質粒DNA(pIG/3C、pIG/3C-TNFRlBP)溶于50ii1的OPTI-MEMI無血清培養基中；SolutionB:2ii1Lipofectin加入50ii1OPTI-MEMI培養基中，充分混勻，室溫放置5min;合并SolutionA和SolutionB，混勻，室溫下放置20min，以便形成DNA-脂質體復合物。棄細胞培養液，加脂質體-DNA混合液。5%C02，37°C培養；分別在轉染24h、48h、72h、96h和120h收集細胞培養上清檢測。4.6ELISA檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc的表達以羊抗人IgG(2ug/ml，100ul)包被酶標板，4t:24小時，分別加入不同稀釋濃度的IgG標準品、PIG/3C-TNFR1BP轉染各時段收集上清、未轉染C0S7細胞培養上清，4t:過夜，PBS-T洗板X3，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgGFc抗體(1:2000)，37°Clh，PBS-T洗板X3，然后加入顯色液，室溫5min，2mol/LH2S04終止反應，酶標儀測定D490。結果表明重組質粒pIG/3C-TNFRlBP轉染上清中可見人IgG蛋白表達；而未轉染上清中IgG表達為陰性。提示轉染pIG/3C-TNFRlBP的真核細胞表達TNFR11封閉肽-hlgGFc融合蛋白。根據IgG標準曲線計算的結果圖9，可見在各組重組體轉染上清中均有一定量融合蛋白表達，其中轉染48h上清中融合蛋白表達量最高(8.6g/ml)，后續實驗中收集轉染上清時間均為轉染后48小時。4.7Western印跡鑒定融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFcSDS-PAGE采用垂直板不連續凝膠電泳法。常規灌制12X分離膠和5X濃縮膠，取重組載體轉染上清和未轉染C0S7細胞培養上清和蛋白分子量標準以每孔20ul加樣，80v電泳至分離膠，120V繼續電泳6小時，考馬斯亮藍染色。Western印記SDS-PAGE電泳結束后，取下凝膠，將蛋白質轉印至PVDF膜(200mA，4°C，1小時)，3%脫脂奶粉-吐溫封閉過夜，PBS-T漂洗X3，每次10分鐘，加入HRP-羊抗人IgG抗體(1:5000稀釋)，37t:30分鐘，顯影。結果見圖10。實施例5融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc生物學活性鑒定5.1間接免疫熒光法檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc與TNFR1的結合在預先鋪入六孔板中每孔加入L929細胞1X106個，371:，5%C02培養箱培養過夜，使細胞均勻貼壁。分別加入融合蛋白上清、空載體轉染上清和合成TNFR1封閉肽37t:作用2小時，經固定、封閉后加入兔抗人抗TNFR1—抗(1:100)，4t:過夜，加入FITC標記羊抗兔二抗(i:100)，37t:避光孵育ih，再以甘油封片熒光顯微鏡下觀察并照相。結果見圖ii所示陽性對照組即只加入一抗(兔抗人TNFR1抗體)和二抗(FITC-羊抗兔IgG)作用，L929細胞表面TNFR1與相應抗體結合，表現為強熒光(圖llb)，而加入含融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc的細胞培養上清、合成TNFR11封閉肽則表現為熒光著色的細胞明顯減少(圖llc和d)，僅加入pIG/3C轉染空載體上清的則未見任何抑制性效應(圖lle)。此結果提示融合蛋白、合成TNFR11封閉肽能夠特異性識別L929細胞上表達的TNFR1，從而競爭性抑制抗TNFR1抗體與該細胞上的TNFR1結合。5.2流式細胞術檢測融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc與TNFR1的結合將分別以融合蛋白上清、空載體轉染上清和合成TNFR1封閉肽作用后的L929細胞以常規方法先后加入加入兔抗人TNFR1—抗(1:100)和FITC標記羊抗兔二抗(1:IOO)，流式細胞儀檢測各組細胞熒光表達情況。結果如圖12所示與只加入FITC標記二抗空白對照組圖12a相比，加入轉染空載體上清的熒光陽性細胞率顯著增高至99.12%，提示其無受體拮抗作用；但加入轉染融合蛋白重組載體上清和合成受體封閉肽的熒光陽性細胞率均明顯降低，其中融合蛋白拮抗率為77.74%;合成TNFR1封閉肽拮抗率為69.75%。提示兩種封閉肽均可競爭性抑制抗TNFR1抗體與TNFR1的結合，從而使熒光陽性細胞率下降。5.3細胞毒抑制實驗檢測融合蛋白對TNF-a胞毒效應的抑制作用以L929為靶細胞，先分別加入融合蛋白、合成TNFR1封閉肽及轉染空載體的細胞培養上清37t:作用2h，再加入sTNF，并設一組只加sTNF標準品作為參照。sTNF標準品的含量為15u/孔，細胞數為2X104/孔/100ii1DMEM培養基，10yg/yl放線菌素D(ACT-D)10y1/孔，每個樣品設3復孔。5%C02，37。C培養24h后，加5mg/mlMTT10y1/孔，繼續培養4h，每孔100ylDMSO溶解結晶，酶標儀測0D570nm值。結果如圖13所示融合蛋白、合成TNFR1封閉肽均可抑制TNF-a的胞毒效應，且在一定范圍內呈劑量依賴性。其中，合成TNFR1封閉肽的胞毒抑制率可達62.63%(圖13a)，在50X抑制率時的濃度為約liig/ml(圖13c);而融合蛋白的抑制率最高為73.51%(圖13c)，在50%抑制率時的濃度為0.47iig/ml(圖13c)。5.4融合蛋白對TNF-a誘導人單核細胞促炎細胞因子mRNA水平的影響采用TR-PCR方法檢測促炎細胞因子IL-113、IL-8mRNA水平，具體方法同實施例2.2。IL_8的引物Pl:5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAA-3，，P2:5'-TGAATTCTCAGCCCTCTTCAA_3，，擴增片段長約250bp。結果如圖14a所示TNF-a剌激的單核細胞可見一條強的IL_1PcDNA特異性條帶(600bp)(泳道2);而靜止單核細胞則有少量IL-113mRNA表達(泳道2)，應用融合蛋白(泳道3)、合成封閉肽(泳道4)所出現的IL-iPcDNA條帶明顯減弱，加入轉染空載體上清的單核細胞IL-113PCR產物條帶的亮度與TNF剌激組相似(泳道5)。通過密度掃描進行相對定量(圖13b)，證實融合蛋白的抑制率為70.9%;合成封閉肽的抑制率為59.26%。提示兩種封閉肽均可有效阻斷TNF誘導單核細胞表達IL-113mRNA。與IL_1PRT-PCR結果相似，各組封閉肽作用后，IL-8RT-PCR電泳條帶與陽性對照(TNF-a剌激組，圖15a泳道1)相比明顯減弱，通過密度掃描進行相對定量(圖15b);融合蛋白的抑制率為68.67%;合成封閉肽的抑制率為58.47%。提示兩種封閉肽也可有效抑制TNF誘導單核細胞表達IL_8mRNA。5.5激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對TNF-a誘導人單核細胞NF_kB核轉位的影響分離人單核細胞分別加入融合蛋白(8.6iig/ml)、合成封閉肽(8.6iig/ml)、于37°C、5%C02培養箱內作用2h;加入TNF-a(150u/ml)繼續作用30min;70%冰乙醇-2(TC固定24h，加入100ill含2iig的兔抗人NF-kB抗體，室溫孵育2h，加入100y1羊抗兔FITC標記的二抗，室溫避光孵育30min;加入10illPI(50yg/ml)，室溫避光孵育30min;置于載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。PI將胞核染為紅色，FITC標記的抗體可將NF-kB染為綠色。結果見圖16所示TNF-a可誘導單核細胞NF-kB從胞漿轉位至胞核，因為胞核區出現黃色斑點(圖16a)，空質粒轉染上清組亦見明顯NF-kB轉位(圖16d);合成短肽(圖16b)和TNFRlBP/hlgFc融合蛋白(圖16c)處理的單核細胞胞漿呈綠色，而胞核呈紅色，胞核邊緣有少量黃色斑點，提示兩種封閉肽可有效抑制TNF誘導的NF-kB核轉位。實施例6融合蛋白TNFR1封閉肽-hlgGFc對高脂高糖誘導的大鼠II型糖尿病的治療作用6.1大鼠肥胖和胰島素抵抗模型的制備和、實驗分組和樣品的采集雄性Wistar大鼠，4周齡，體重110130g，首先隨機分為正常飲食(normaldiet,ND)組和高脂高糖飲食(highfatandsucrose,HFS)組。HFS中含而20%重量/重量的豬油(33%的能量)，24.5%重量/重量的蔗糖(20%的能量)。飼養16周后，將HFS組再隨機分為3組，共4組，在繼續給予原來的飼料基礎上，每組8只，分別經尾靜脈給予0.lml的生理鹽水或O.lml的生理鹽水中含500iig的融合蛋白或含500iig的Fc蛋白，即ND組、HFS組、HFS+融合蛋白組和HFS+Fc蛋白組等共4組。每周給藥2次，連續4周。總體重、空腹血糖和胰島素的檢測均在禁食16h后進行。實驗結束后(共飼養20周)，在麻醉下經眼眶后靜脈叢采血，并收集肝臟、腎臟、胰腺、股四頭肌和附睪的脂肪墊等，所有器官和組織分裝后凍存于液氮中。6.2高脂高糖誘導大鼠肥胖和胰島素抵抗糖耐量和胰島素耐量試驗都在大鼠禁食24h后清醒狀態下進行。經腹腔注射3.Og/kg體重的糖或1IU/kg豬胰島素(Sigma)后，在不同時間點剪尾巴采血，用One-TouchProfile血糖計測血糖(Lifescan，Inc.，Milpitas，CA);血清的胰島素和C反應蛋白水平采用雙抗體包被試管RIA試劑盒檢測(chemclin，Inc.，Beijing,China)。其具體操作按試劑盒說明書進行。抗人的胰島素抗體和C反應蛋白抗體都與大鼠有交叉反應。胰島素抵抗采用穩態模型指數(HomoeostasisModel12Assessmentlndex，HOMA-IR)進行評價，其計算公式為HOMA-IR=空腹胰島素(PIU/ml)X空腹血糖(mrno1/1)/22.5。血漿甘油三酯和總膽固醇采用commerciallyavailablecolorenzymaticassays檢測(SigmaandWakoPureChemicalindustriesLtd.，Richmond,VA)。結果顯示HFS喂養4周后大鼠體重開始以每月增長1.4倍的速度增加，與同期的生理鹽水組比較體重增加18%(如圖17A)(P<0.05)，同時，血漿的胰島素水平顯著增加，并且隨HFS喂養的時間延長而增加(如圖17C)以便維持正常的血糖水平(如圖17B)，然而，HOMA-IR在給予HFS喂養8周后就顯著高于AD組(如圖17D)，提示HFS能誘導大鼠肥胖相關的胰島素抵抗。6.3融合蛋白能抑制高糖和高脂誘導的大鼠肥胖給HFS喂養的大鼠經尾靜脈注射融合蛋白TNFR1-Fc治療4周后，可使其體重較NS處理的大鼠(HFS組)下降26X，而Fc蛋白處理并不影響其體重(如圖18A);HFS+融合蛋白組的附睪脂肪墊重量較HFS組顯著減少(P<0.05)(圖18B)，但HFS組的附睪脂肪墊重量較HFS+Fc組低；同樣地，脂肪組織HE染色也顯示HFS+融合蛋白組的脂肪細胞大小明顯小于HFS組，HFS組和HFS+Fc組的脂肪細胞大小顯著大于正常組(圖18C);另外，其他組織如肝臟、腎臟和胰腺等器官的重量無改變(結果未顯示)。提示融合蛋白能減少脂肪的沉積、減輕體重。采用commerciallyavailablecolorenzymaticassays(SigmaandWakoPureChemicalindustriesLtd.,Richmond,VA)檢測大鼠血漿甘油三酯和總膽固醇，結果顯示HFS+融合蛋白組的甘油三酯顯著低于HFS組和HFS+Fc組(圖18D)，但血漿總膽固醇水平在各組之間無顯著差異(結果未顯示)。6.4融合蛋白能提高外周胰島素敏感性因為肥胖與胰島素抵抗密切相關，而脂肪組織中的TNF-a是影響胰島素活性的主要因素，因此我們進一步研究了在肥胖狀態下TNF-a對糖耐量和全身胰島素。結果發現在整個實驗過程中各實驗組大鼠空腹血糖在均基本保持在正常水平(圖19A)。相反，HFS組和HFS+Fc組的空腹胰島素水平(圖19B)和C反應蛋白(圖19C)在HFS飲食喂養20周后較正常ND組增加達2倍(p<0.01)，胰島也代償性肥大(圖19E);而融合蛋白能抑制HFS飲食誘導的空腹胰島素水平和C反應蛋白增高，其抑制率達50%(p〈0.05)，也能使胰島保持在中等大小。這種在血糖水平正常的情況下血清胰島素水平升高的現象是因為肥胖誘導的胰島素抵抗的一個代償性反應，因此，HFS+融合蛋白的HOMA-IR較HFS組和HFS+Fc組的顯著降低(圖19D)，提示融合蛋白能有效抑制肥胖相關的胰島素抵抗。為了檢測融合蛋白是否直接抑制胰島素抵抗，我們進行了腹膜內糖耐受和胰島素耐受試驗。結果各組大鼠的血糖在注射30min后能達到最高水平，然后緩慢下降。其中，HFS組在30-120min之間的血糖水平較ND組顯著增高(圖20A)，同樣地，對胰島素的低血糖反應較ND組顯著降低(圖20B)，但與Fc蛋白相比，融合蛋白在給予胰島素后能顯著加強低血糖對胰島素的反應(P<0.05)，注射葡萄糖后能較快地降低血糖水平(p<0.05)，提示融合蛋白能增加胰島素的敏感性。6.5融合蛋白對局部和全身TNF-a產生的影響為了進一步研究融合蛋白對TNF-a的影響，我們首先采用ELISA方法檢測了大鼠血液中的TNF-a，結果發現HFS飼養的大鼠血清中TNF-a的含量較較ND組高2.4倍，但融合蛋白能逆轉血清中TNF-a水平，使之接近于正常ND組水平(圖21D)。有趣的是在脂肪組織局部TNF-a的含量顯著高于全身。采用免疫組織化學檢測附睪的脂肪組織和胰腺組織里TNF-a的表達情況，其具體步驟為將上述組織用4%的多聚甲醛固定后行石蠟切，然后將石蠟切片脫蠟至水后與1:200兔抗大鼠TNF-a多克隆抗體(一抗)(北京中山生物技術公司)在室溫孵育lh，用PBS洗滌5次，然后與生物素標記的二抗(1:200)在室溫孵育lh，再用PBS洗3次后與辣根過氧化物酶標記的親和素孵育0.5h，洗滌，然后加底物DAB顯色5min，洗滌鏡檢。結果顯示棕色顆粒主要分布在胰腺的胰島(圖21A)和脂肪組織的脂肪細胞膜上(圖21B)，其中HFS組大鼠的胰島和脂肪細胞中TNF-a的表達量顯著高于ND組；另外，HFS組的附睪脂肪組織墊的組織勻漿上清中的TNF-a也顯著高于ND組(圖21C)，與Fc蛋白相比，融合蛋白處理后幾乎可以完全抑制胰島和脂肪組織中TNF-a的表達。6.6融合蛋白對IRS酪氨酸磷酸化的影響IRS-1的酪氨酸磷酸化是其激活下游信號通路的一個關鍵環節，而TNF-a就是通過干擾胰島素受體的信號參與胰島素抵的。為了研究融合蛋白增加胰島素敏感性的機制，我們采用免疫共沉淀-Westernblotting方法檢測了IRS-1中酪氨酸的磷酸化水平。其簡單步驟為禁食一晚上后，腹腔注射1IU/kg豬胰島素或等體積的生理鹽水，30min后，麻醉大鼠，取其股四頭肌、肝臟、附睪脂肪組織，在4。C條件下用組織勻漿緩沖液(1%TritonX_100，10mMEDTA，lOOmMsodiumfluoride,10mMsodiumvanadate，lOOmMsodiumpyrophosphate,50mMH印es，pH7.4，ImMphenylmethylsulfonylfluoride，0.Olmg/mlleup印tinand0.Olmg/ml即rotinin)制成組織勻漿，12，000g離心15min，收集上清，測定其蛋白質含量。取lmg的抽提蛋白與lmg/ml的兔抗鼠胰島素受體底物_1(i固linrec印torsubstrate1，IRS-l)抗體(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz.CA)在4"C孵育過夜，然后再向此免疫復合物中加入50蛋白A-瓊脂糖凝膠CL-4B珠子(AmershamPharmaciaBiotech)，繼續在4。C孵育lh后，用RIPA緩沖液(0.15MNaCl/10mMphosphatebuffer,pH7.0，1%NonidetP_40，l%sodiumdeoxycholate，O.1%SDS)洗35次，加上上樣緩沖液，煮沸后上樣進行8%SDS-PAGE凝膠電泳，然后將凝膠中的蛋白質經電泳轉移至PVDF膜上。將此膜用TBS(20mMTris-Hcl，pH8.00.15MNacl)配制的5%無脂奶粉于4。C封閉過夜后，用1:1000稀釋的抗磷酸化酪氨酸激酶p-Tyr單抗(PY99)(SantaCruzBiotechnology,SantaCruz.CA)，或用l:1000稀釋的抗IRS-1的多克隆抗體于4t:與膜孵育過夜，TBST(TBSwith0.05%Tween-20)洗滌3次，然后用辣根過氧化物酶標記的二抗(1:10000)(北京中山生物技術公司)孵育30min后，用增強化學發光劑現示測定蛋白質的條，并用激光密度測定儀進行蛋白質條帶的定量。結果發現在沒有用胰島素剌激時，各實驗組所有組織中都檢測不到IRS-1的酪氨酸的磷酸化，一旦用胰島素剌激后30min，正常ND組的肌肉、脂肪和肝臟組織中的IRS-1的酪氨酸磷酸化水平迅速而明顯升高(圖22A)，而HFS組和HFS+Fc組的酪氨酸磷酸化水平顯著被抑制，與ND相比，其抑制率在脂肪組織中約為80%、肌肉組織中約68%、肝臟中約為32%(圖22B)。用融合蛋白阻斷TNF-a和TNFR1的作用后能顯著促進胰島素剌激的IRS-1酪氨酸的磷酸化，與ND相比，肌肉組織的磷酸化水平可提高了84.7%，在脂肪組織中提高了92.7%，但在肝臟組織的變化不明顯。二、TNF結合肽(環9肽)與TNFR1封閉肽(環9肽)實施例7TNF結合肽和TNFR1封閉肽的篩選及其特異性鑒定7.1噬菌體肽庫的篩選:參照NewEnglandBiolandBiolabs說明書，分別以0.1MNaHC03(pH8.6)包被液稀釋人重組TNF-a和人重組TNFR1I蛋白為誘餌包被30X15mm塑料培養皿，同時設空白對照，4°C過夜，0.5%BSA封閉，4°C2h，加肽庫(2.0X1011個噬菌體克隆/10iU)，室溫作用lh，洗去未結合的噬菌體(此噬菌體稱為無關噬菌體，作為后續實驗的陰性對照)，用0.2M甘氨酸-鹽酸洗脫液解離已經與誘餌蛋白結合的噬菌體，侵染ER2738菌，擴增并用PEG提取噬菌體，用于下一輪篩選。共進行三輪篩選，逐輪降低誘餌蛋白的濃度及其與肽庫作用時間，增加洗滌緩沖液中Tween-20濃度，以便得到親和力高、特異性強的噬菌體克隆。經三輪篩選后隨機挑選噬菌體單斑擴增，PEG/NaCl沉淀，最后用200ii1TE溶解噬菌體，分別得到能與TNF-a結合的"TNF-a結合噬菌體"和能與TNFR1I結合的"TNF受體封閉噬菌體"。結果，經三輪篩選后，噬菌體的回收率均能逐步上升，說明篩選所得到的特異性噬菌體克隆有較高程度的富集，最后第三輪洗脫下的噬菌體比第一輪篩選得到的產量均高出100多倍(表略)。7.2細胞毒抑制實驗取上述三輪篩選后隨機挑選并擴增的噬菌體克隆，借助其能否抑制S-TNF-a殺傷L929細胞或/和U937細胞的"細胞毒抑制實驗"進行篩選。基本方法取對數生長期的L929細胞或U937細胞(5X104)為靶細胞，加入96孔培養板中，同時加入噬菌體克隆，每孔終體積均為100iil，置37t:、5^C02細胞培養箱中培養1618h后，每孔加入MTT10ul(終濃度為0.5mg/ml)，繼續培養4h后，離心1000rpm，10min，棄上清，每孔加入100iilDMSO，待甲月替完全溶解(室溫放置15min)后，用酶標儀測其OD570nm值(630nm校準)。實驗分組①TNF結合噬菌體組TNF結合噬菌體(終濃度為106pfu/10ul)預先與TNF-a(終濃度為50U/ml)混合，37。C孵育30min后加入到靶細胞懸液中；②TNFR1封閉噬菌體組TNFR1封閉噬菌體(終濃度為1012pfu/10ul)預先與U937細胞混合，37t:孵育30min后加入TNF-a(終濃度為50U/ml)。③聯合噬菌體組將上述兩種噬菌體各減半量，分別與TNF-a和耙細胞孵育30min后再混合培養；同時，設空白組、TNF-a組(陽性對照組)及無關噬菌體組作陰性對照。細胞死亡率=(對照組OD-實驗組OD)/(對照組OD-空白組OD)X100%細胞毒抑制率=[1-噬菌體/TNF組細胞殺傷率/TNF組細胞殺傷率]X100%結果以TNF-a為靶蛋白，從第三輪篩選的洗脫物中隨機挑選并擴增39個克隆，以小鼠成纖維細胞株L929為TNF-a的靶細胞，并設無關噬菌體克隆為陰性對照，根據噬菌體是否能抑制TNF-a細胞毒效應(即細胞毒抑制實驗)，粗步篩選到5個具有拮抗TNF-a作用的噬菌體克隆(其編號為5、6、7、32及38)，并稱之為"TNF結合噬菌體";用細胞毒效應篩選TNFR1封閉噬菌體以TNFR1為耙蛋白，從第三輪篩選的洗脫物中隨機挑選并擴增37個噬菌體克隆，分別觀察它們對TNF-a細胞毒效應的影響。結果顯示有2個克隆不僅對靶細胞無細胞毒作用，而且能明顯抑制TNF-a誘導的細胞毒效應，即為"TNFR1封閉噬菌體"，其編號為X2、X4(圖23)。然后，以同樣的方法選擇人單核細胞株U937作為TNF-a的靶細胞，進一步觀察上述各TNF結合噬菌體和各TNFR1封閉噬菌體對不同濃度TNF-a介導的細胞毒效應的影響。結果顯示，滴度為106pfu/ii1的TNF結合噬菌體和滴度為1012pfu/1y1的TNFR1封閉噬菌體幾乎可完全阻斷50U/ml的TNF-a(殺傷率約為20%)對U937的胞毒效應；當TNF-a濃度增加到100U/ml(殺傷率約為30%)時，各個噬菌體克隆的細胞毒抑制率雖然較前者顯著下降(P<0.01)，但仍然有50%左右的抑制率；當TNF-a濃度增加到200U/ml(殺傷率約55X)時，各個噬菌體克隆的細胞毒抑制率進一步顯著下降(P<0.01)，只有6、7、32、38及X4號還有10%左右的抑制率。提示TNF結合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體的競爭性抑制效果隨著TNF-a濃度的增高而減弱(圖24)為了進一步觀察TNF結合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體是否具有協同作用，將其滴度減半，觀察兩種噬菌體聯用對100U/ml的TNF-a(殺傷率約為30%)的影響。結果顯示X4與32號、X4號與38號聯用的細胞毒抑制效應均較其單獨作用的效果好，但其中X4與38號聯用的抑制率達85.3%，顯著高于各自單獨的抑制作用(P〈0.01)，也顯著高于X4與32號噬菌體聯用的抑制率(P<0.01)。提示TNF結合噬菌體(38號)和TNFR1封閉噬菌體(X4號)聯用具有協同抑制作用。7.3ELISA鑒定噬菌體克隆的特異性。分別取含50yg/ml人重組TNF-a蛋白和TNFR11蛋白的包被液包板，0.5%BSA封閉，分別加入上述TNF結合噬菌體和TNF受體封閉噬菌體(4倍倍比稀釋噬菌體10122X105)，室溫孵育2h;加入HRP標記的抗-M13抗體(1:5000)室溫孵育lh后用底物四甲基聯苯胺(TMB)顯色，在波長405-415nm下讀取0D值。用無關噬菌體做陰性對照。結果5個TNF結合噬菌體克隆和2個TNFR1封閉噬菌體克隆分別能與hrTNF重組蛋白和hrTNFRl重組蛋白特異性結合而顯色，而無關噬菌體克隆(陰性對照)與空白對照則不顯色，提示TNF結合噬菌體和TNFR1封閉噬菌體分別具有結合TNF-a和TNFR1的特異性(圖25)7.4RT-PCR檢測TNFR1封閉噬菌體對TNF-a誘導U937細胞IL-1PmRNA水平的影響，具體方法同實施例2.2。結果顯示X2、X4本身不能促進IL-iPmRNA轉錄，但能抑制TNF-a誘導IL-1PmRNA的轉錄，其中X4的抑制率達50%。提示TNFR1封閉噬菌體與U937細胞膜表面的TNFR1結合后，本身無受體激活作用，但能有效阻止TNF-a與TNFR1結合，從而阻斷其生物學效應。因此，TNFR1封閉噬菌體展示的環肽可能為較理想的TNFR1拮抗劑。(圖26)7.5DNA序列分析和多肽合成根據上述實驗結果，挑取TNF結合噬菌體克隆5、6、7、32、38號和TNFR1封閉噬菌體克隆X2、X4號及無關噬菌體克隆進行DNA測序。結果顯示5個TNF結合噬菌體展示肽和2個TNFR1封閉噬菌體展示肽的氨基酸序列與天然的TNF-a和TNFR1的氨基酸序列均無同源性。選擇對TNF-a生物學功能具有較強抑制效應的32、38和X4號噬菌體克隆，根據其展示肽的序列合成環肽實施例8TNF結合肽和TNFR1封閉肽的生物學特性及功能檢測以下TNF結合肽(TBP)與TNFR1封閉肽(TRBP)均由西安美聯合成并環化(即環9肽)。8.1GFP-TNF融合蛋白競爭結合實驗檢測TBP和TRBP的特異性取無菌蓋玻片置于6孔細胞培養板中，加入1X106/ml對數生長期的L929細胞，置37°C，5%C02細胞培養箱中培養過夜，制作細胞爬片，用1%多聚甲醛固定細胞30min，PBS洗細胞；同時加入GFP-TNF融合蛋白(3yg/ml)和TBP或TRBP(3yg/ml)，置4°C過夜；用PBS沖洗玻片，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。另外，取lX106/ml對數生長期的U937細胞用1%多聚甲醛固定后，加入GFP-TNF蛋白和合成環肽(3iig/ml)，置4t:過夜上流式細胞儀檢測熒光。結果顯示合成多肽能抑制GFP-TNF融合蛋白與細胞膜上TNFR1結合。其中，TBP(P印.38)與TRBP(p印.X4)聯用的抑制效果最好，能使U937細胞結合GFP-TNF熒光蛋白的陽性細胞率降低50%，也能顯著減少L929細胞膜上的熒光強度(圖27)。提示人工合成的TBP和TRBP仍具有結合TNF-a和TNFR1的特異性。8.2非變性聚丙烯凝膠電泳檢測TBP與TRBP二者的互補結合性質譜分析的結果顯示TBP(p印.38)與TRBP(p印.X4)的分子量分別為1102.21和1203.96。理論上，如果二者能互補結合，其分子量應為2300以上，在20%的非變性聚丙烯凝膠中其蛋白條帶應在二者單獨電泳的條帶之后。非變性聚丙烯凝膠電泳與變性的聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)的過程完全相同，所不同的是上樣緩沖液中不加巰基乙醇、其他工作液中均不加十二烷基磺酸鈉(SDS)。本實驗使用的是20%分離膠和3.75%濃縮膠。取細胞培養液RPMI1640溶解TBP(p印.38)與TRBP(p印.X4)(2mg/ml)，將p印.38和p印.X4等體積混合后，置37。C溫箱中孵育3045min后取出，加入等體積的2X上樣緩沖液，混勻，取15ul上樣電泳，同時設p印.38和p印.X4對照。電泳完畢后取出凝膠用考馬斯亮藍染色4h，再用脫色液脫色2h，脫色過程中隨時觀察蛋白條帶顏色深淺的變化，并拍照。結果顯示無論p印.38和p印.X4單獨電泳還是二者混合孵育后電泳，三者條帶均在同一直線上，并無任何滯后條帶出現，提示二者混合不會發生互補結合。(圖28)8.3TBP與TRBP對TNF-a胞毒效應的抑制作用為了檢測人工合成環肽是否象噬菌體展示環肽一樣有效，故觀察TBP和TRBP能否抑制TNF-a對U937細胞的胞毒效應。方法同實施例7.2。實驗分組①TBP組各種濃度的TBP預先與TNF-a(終濃度為50U/ml)混合，37t:孵育30min后加入到靶細胞懸液中；②TRBP組各種濃度的TRBP預先與U937細胞混合，37t:孵育30min后加入TNF-a(終濃度為50U/ml)。③聯合多肽組將上述兩種多肽各減半量，分別與TNF-a和靶細胞孵育30min后再混合培養；同時，設空白組、TNF-a組(陽性對照組)及無關多肽組作陰性對照。結果顯示為了檢測人工合成環肽是否象噬菌體展示環肽一樣有效，故觀察TBP和TRBP能否抑制TNF-a對U937細胞的胞毒效應(圖3)。結果顯示TBP與TRBP對TNF-a的細胞毒效應均有抑制作用，且隨著劑量的增加而增強，當劑量增加到10yg/ml時，抑制效果最好。此外，將TBP與TRBP聯用(即p印.38+X4)，其各個劑量的細胞毒抑制率均顯著高于各自單獨作用的抑制率(P<0.01)。(圖29)8.4NBT還原法檢測TBP與TRBP對外周血單核細胞的影響方法同實施例2.1。TNF-a由活化的單核/巨噬細胞產生，又能參與巨噬細胞的激活，促進單核/巨噬細胞對IFN-y的敏感性，增強其呼吸爆發，促進其吞噬功能，誘導炎性細胞因子如IL-l、IL-8等產生。故本發明首先觀察TBP和TRBP在體外對TNF-a誘導人外周血單核細胞活化的影響。結果發現同時給予外源性IFN-y和TNF-a(各5ng/ml，5U/ml)較之二者單獨作用更能明顯激活單核細胞，表現為呼吸爆發功能顯著增強。TBP和TRBP聯用能有效抑制TNF-a和IFN-y誘導的單核細胞呼吸爆發強度，使反應體系中NBT還原能力減弱，OD值顯著降低(其抑制率為56.25%)(圖30)。8.5RT-PCR檢測TBP和TRBP對TNF-a誘導U937細胞IL-1PmRNA水平的影響，具體方法同實施例2。RT-PCR產物條帶掃描顯示其對IL-IP和IL-8mRNA轉錄抑制率為55.10%和52.53%。這些結果表明TBP和TRBP可通過競爭性抑制TNF-a與TNFR1的結合，降低單核細胞對IFN-y的敏感性，從而抑制單核細胞的活化(圖31)。實施例9TBP和TRBP對TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用9.l大鼠潰瘍性結腸炎模型制備、動物分組及取材取wistar大鼠，術前禁食24h，自由飲水，乙醚輕微麻醉后，用硬膜外麻醉導管經肛門輕緩地插入8cm，深達結腸，然后注射TNBS(50mg/kg體重)乙醇溶液(5%TNBS溶液與等體積無水乙醇混合)。本實驗36只大鼠隨機分為6組，各實驗組TNBS乙醇溶液灌腸后12h內經灌胃給藥，1ml/只/天，連續6天。具體分組①正常對照組，僅生理鹽水處理；②模型組(非用藥組)組；③無關多肽組，取無關環肽(2.5mg/kg/次)對照處理；④聯合多肽治療組，取等量混合的TNF結合環肽和TNFR1封閉環肽(總劑量2.5mg/kg/次)治療；⑤抗TNF抗體治療組取抗TNF多克隆抗體(10mg/kg/次)治療；5-氨基水楊酸治療組TNBS取Pentasa(100mg/kg/次)治療。實驗前后稱量大鼠體重，處理6天后，摘眼球取血，隨后解剖，取肛門至盲腸腸管(約8-10cm)，沿腸系膜縱軸剪開，用冷生理鹽水沖洗干凈后進行肉眼大體形態學評分，然后，一部分結腸標本放入10%的甲醛溶液中固定24h進行常規石蠟組織切片、HE染色、顯微鏡下進行組織學觀察評分；另一部分標本置-8(TC凍存，用以檢測生化指標及促炎細胞因子表達。結果，SD雄性大鼠經肛門灌腸給藥12h后，大鼠出現腹瀉、吶差、飲水量增加、毛發粗造等癥狀，一周后大鼠體重明顯下降，大體解剖可見距肛門810cm處結腸粘膜充血水腫、潰瘍形成，粘膜增厚、腸腔狹窄，結腸組織與周圍組織粘連。病理組織學檢查發現，大多數大鼠的結腸組織病變累及腸壁全層，以黏膜和黏膜下層為重，淋巴管、血管擴張，腸壁水腫，并見大量的中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞浸潤，有兩處或多處黏膜上皮壞死脫落，形成潰瘍，有的潰瘍深達黏膜肌層(如圖32)。此結果與文獻報導的一致，說明大鼠潰瘍性結腸炎模型制備成功。9.2聯合多肽對潰瘍性結腸炎大鼠體重、結腸組織病理損傷的影響結腸組織損傷大體形態評分標準為無潰瘍，無炎癥計O分；無潰瘍，局部水腫計1分；有潰瘍，無水腫計2分；僅一處有潰瘍與炎癥計3分；兩處或更多地方有潰瘍與炎癥計4分；潰瘍大于2cm計5分。結腸組織切片的病理損傷評分標準為無淋巴細胞浸潤，計O分；低水平的淋巴細胞浸潤計1分；中等水平的淋巴細胞浸潤計2分；高密度血管，腸壁增厚計3分；全層淋巴細胞浸潤，杯狀細胞消失，腸壁增厚計4分。本發明的結果顯示聯合多肽對潰瘍性結腸炎大鼠體重、結腸組織病理損傷的影響各實驗組大鼠實驗前后稱量體重，結果(表3)顯示正常對照組實驗后較實驗前顯著增加(p<0.01);模型組體重實驗后較實驗前顯著下降，但多肽治療組和抗體治療、5-氨基水楊酸組一樣，其體重雖然較正常組實驗后低(P<O.Ol)，但是顯著高于模型組實驗后的體重(p<0.01)。由于TNBS誘導的大鼠潰瘍性結腸炎模型的主要癥狀是腹瀉，脫水，導致大鼠體重下降，因此，此結果表明聯合多肽能改善潰瘍性結腸炎癥狀。各組大鼠實驗前后的體重變化情況見表4，它顯示正常對照組大鼠的體重較實驗前顯著增長(P<0.05)，模型組和無關肽對照組實驗后的體重均有所下降，而聯合多肽治療組與抗體治療組、水楊酸組的結果一致，未見下降，其體重顯著高于模型組及無關肽對照組(P<0.05)。由于此模型為急性結腸炎，其主要癥狀為嚴重的腹瀉，多肽治療組實驗后的體重較模型組和無關肽組的高，提示其腹瀉癥狀較輕，炎癥損傷較輕。大體解剖結果顯示大鼠大體解剖結果模型組和無關肽組的大鼠結腸表現為粘膜充血水腫、潰瘍形成、粘膜增厚、腸腔狹窄、可見近端腸腔擴張。聯合給予TNF結合肽和TNFR1封閉肽與用抗TNF抗體及5-氨基水楊酸一樣能明顯改善大鼠結腸炎癥狀，使結腸黏膜水腫和潰瘍明顯減輕。病理學檢查的結果(見圖33)顯示大鼠結腸組織病理學檢查發現模型組和無關肽組大鼠的結腸組織病變累及腸壁全層，淋巴管、血管擴張，腸壁水腫，大量中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞浸潤，局部黏膜上皮壞死脫落，形成潰瘍，而聯合應用TNF結合肽和TNFR1封閉肽與用抗TNF抗體及5-氨基水楊酸一樣能顯著18減輕大鼠結腸組織病理損傷，潰瘍較輕，炎性細胞浸潤較少。根據文獻報道的潰瘍性結腸炎病理損傷程度評分標準進行大體標本形態學評分及組織學評分，結果(見表3)上述三個治療組的大體標本形態學評分及組織學評分均顯著低于無關肽組和潰瘍性結腸炎對照組(P<0.05)，而三個治療組之間無顯著性差異(P>0.01)。表2.各種治療對潰瘍性結腸炎大鼠體重變化的影響(X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3.各組大鼠結腸大體形態和組織學損傷評分(X±SD)分組大體形態評;組織學評分<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表4.各種治療對潰瘍性結腸炎大鼠血清中NO活性及活性氧的影響分組NO活性(uM)抗活性氧(u/ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>aP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組和無關肽組；eP<0.01VS生理鹽水表5.各種治療對結腸炎大鼠結腸組織中MPO活性、NO含量及活性氧的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>aP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組和無關肽組；eP<0.01VS生理鹽水9.3聯合多肽對結腸炎大鼠血清及結腸組織中N0、活性氧和MP0的影響為了進一步研究聯合多肽減輕潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織病例損傷的機制，本發明檢測了各組大鼠血清和結腸組織NO含量、活性氧和結腸組織中MP0活性(檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供)。表4和表5顯示潰瘍性結腸炎大鼠血清和結腸組織NO含量和結腸組織中MPO活性均明顯升高，多肽治療組與抗體治療組、水楊酸治療組一樣，可有效抑制潰瘍性結腸炎大鼠產生N0，因為其血清和結腸組織中NO的含量雖然仍高于正常對照組但較模型組和無關肽顯著下降(P<0.01);此外，三種治療也可明顯抑制潰瘍性結腸炎結腸組織中MPO的活性(P<0.01)，但對活性氧的產生卻無明顯影響(P>0.05)。9.4聯合多肽對結腸炎大鼠腹腔M小中TNF-a、IL_1P及IL_8的影響借助RT-PCR技術檢測聯合多肽對潰瘍性結腸炎大鼠腹腔M小中mRNA轉錄水平的影響，方法同實施例？。結果見圖34。IL-IP約為600bp，IL-8約250bp，內參照P-actin約400bp。生理鹽水對照組大鼠腹腔巨噬細胞呈現微弱的IL-IP及IL-8RT-PCR產物條帶(泳道1)，潰瘍性結腸炎組的IL-113及IL-8條帶明顯增粗和增亮(泳道2)，多肽治療組(泳道4)、抗體治療組(泳道5)和水楊酸組(泳道6)—樣可顯著抑制潰瘍性結腸炎大鼠腹腔巨噬細胞IL-113及IL-8mRNA的水平，因為三種治療組的細胞因子RT-PCR產物條帶灰度掃描值都明顯減弱，與模型組和無關肽組比較具有顯著差異(P<0.01)。借助免疫組化方法檢測各組大鼠結腸組織中TNF-a蛋白質表達水平。取石蠟切片(4um)常規脫蠟、水化，置0.051檸檬酸緩沖液中進行微波抗原修復，涼至室溫；3%11202孵育10min以消除內源性過氧化物酶活性，滴加10%正常血清封閉非特異性抗原；傾去血清，滴加l:100稀釋的TNF-a抗體；4t:放置過夜，PBS沖洗3X5min，滴加生物素化二抗；37t:孵育10min，PBS沖洗3X5min;滴加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，37。C孵育15min;DAB顯色，蘇木素復染，中性樹脂封片。采用圖象分析系統計數陽性細胞，并進行灰度掃描，每張切片隨機選取5個高倍視野(400倍)計數200個細胞。結果(圖35)顯示生理鹽水組大鼠結腸組織基本無TNF-a表達，而模型組及無關肽組可見結腸組織有明顯褐色著色，TNF-a主要表達于炎癥部位浸潤的巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞的胞漿和胞膜上。圖象分析結果(表6)表明，模型組大鼠結腸組織TNF-a表達的陽性密度和陽性細胞率比對照組明顯增加，多肽治療組與抗體治療組和水楊酸組一樣可使潰瘍性結腸炎結腸組織TNF-a表達明顯下降(P<0.01)。提示合成多肽不但能拮抗TNF-a的致炎作用，20還能抑制TNF-a本身的表達。表6.各種治療對潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中TNF-a蛋白表達的影響分組TNF-a表達的陽性密度TNF-cx表達的陽性細胞率生理鹽水組0.0561±0.03875.58±5.19模型組0.2252±0.0399a39.43±5.29a多肽治療組0.1491±0.0543b27.54±9.03無關肽對照組0.2682±0,048944.61±5.94b抗體治療組0.1129±0.0356b21.87±6.40b5-氨基水楊酸治療組0.1386±0.0445b26.14±7.55baP<0.05VS生理鹽水；bP<0.01VS模型組。序列表〈110〉華中科技大學〈120>TNF_a結合肽和TNFRl封閉肽及其在治療TNF相關疾病中的應用〈130>1〈160>11〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>12〈212>PRT〈213>人工序列〈400>1AspHisArgProLeuTrpGlyGluSerMetValTrp1510〈210>2〈211>9〈212>PRT〈213>人工序列〈400>2CysLysHisGinTrpHisLysHisCys15〈210>3〈211>9〈212>PRT〈213>人工序列〈400>3CysLysHisAlaLeuHisArgHisCys1521〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4gataacctgctggtgtgtga<210〉5〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉5cttgtgaggtgctgatgtac〈210〉6〈211〉29〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉6gcggatcatggtcagatcatcttctcgaa〈210〉7〈211〉30〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉7cccaagcttcagggcaatgatcccaaagta<210〉8〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉8aacggctccggcatgtgcaa〈210〉9〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉9cttctgacccatgcccacca〈210〉10〈211>21〈212〉DNA20/21頁202029302020〈213〉人工序列〈400>10attt.ctgcag'ctctgtgtgaa〈210>11〈211>21〈212>DNA<213>人工序列〈400>11tgaattctcagccctcttcaa權利要求一種人腫瘤壞死因子TNF-α受體1封閉肽，該TNF-α受體1封閉肽為12線肽，其氨基酸序列為Asp-His-Arg-Pro-leu-Trp-Gly-Glu-Ser-Met-Val-Trp。2.—種融合蛋白，包含權利要求l所述的人TNF-a受體l封閉肽和人Fc段。3.—種編碼權利要求l所述的人TNF-a受體l封閉肽核酸分子，包含其簡并的核苷酸序列。4.一種編碼權利要求2所述的融合蛋白的核酸分子。5.—種表達載體，包含權利要求3或權利要求4所述序列和與之操作性連接的表達調控序列。6.—種宿主細胞，含有權利要求5所述的表達載體。7.根據權利要求6所述的宿主細胞，其特征在于它是C0S7。8.權利要求l所述的TNF-a受體l封閉肽在制備用于治療關節炎的藥物中的應用。9.權利要求2所述的融合蛋白在制備用于治療II型糖尿病的藥物中的應用。10.—種TNF結合肽(環9肽)，其氨基酸序列為Cys-Lys-His-Gln-Trp-His-lys-His-Cys。11.一種編碼權利要求10所述的TNF結合肽(環9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。12.—種TNFRl封閉肽(環9肽)，其氨基酸序列為Cys-lys-His-Ala-Leu-His-Arg-His-Cys。13.—種編碼權利要求12所述的TNF結合肽(環9肽)的核酸分子，包含其簡并的核酸序列。14.權利要求10所述的TNF結合肽或/和權利要求12所述的TNFRl封閉肽在制備用于治療潰瘍性結腸炎的藥物中的應用。全文摘要本發明涉及一條TNFR1封閉肽及其與人IgG1Fc段基因重組后形成的TNFR1-Fc融合蛋白。該TNFR1封閉肽為12線肽；本發明還涉及一條TNF結合環肽和一條TNFR1封閉環肽，二者均為環9肽(即C7C)；該TNFR1封閉肽、TNFR1-Fc融合蛋白、TNF結合環肽和TNFR1封閉環肽等無論在體內還是在體外均能競爭性抑制TNF-α與TNFR1結合，從而拮抗TNF-α的生物學功能，并分別在佐劑性關節炎大鼠模型、高脂高糖誘導的肥胖和胰島素抵抗大鼠模型及TNBS誘導的實驗性潰瘍性結腸炎大鼠模型中取得較好的療效。文檔編號C07K7/00GK101747414SQ20081023689公開日2010年6月23日申請日期2008年12月19日優先權日2008年12月19日發明者何亞萍,尹丙姣,李卓婭,梁慧芳,王晶,黃麗霞申請人:華中科技大學