專利名稱：草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法
技術領域：
本發明涉及到生物基因克隆表達技術領域，特別涉及到草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋 白(VP7)原核表達載體構建及多克隆抗體的制備方法。
背景技術：
草魚出血病是我國淡水魚類中傳染性高、致死性的病毒性魚病，其病原為草魚呼 腸孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)。自從1979年Meyers分離出第一株水產類病毒 以來，已有60多種水產類病毒被證實，其中很多病毒不會引起大規模發病或對水產養殖影 響較小，而GCRV被認為是致病性最高的水產類病毒。因此GCRV可以作為研究水產類病毒 復制和發病機理的模型，這對研究水產類病毒性疾病有重大意義。草魚呼腸孤病毒為水生呼腸孤病毒屬(Aquare0ViruS，ARV)，呈二十面體對稱的球 形，其基因組由11條分段的dsRNA片段組成。由于水生呼腸孤病毒至今尚未建立標準血清 型，目前該屬亞型的劃分是以RNA =RNA雜交為依據進行歸類。ARV分為七個亞型(A-G)，G 亞型代表草魚呼腸孤病毒。草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)分子量約為34KD，含1個鋅 指序列調節基因表達。該蛋白具有協同其他蛋白通過構象變化行使膜穿透功能，還可能在 病毒識別和進入宿主細胞的過程中起著識別接受器的作用。
發明內容
本發明的目的是將草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因克隆至原核表達質粒 中，并在大腸桿菌中大量表達和純化，經免疫小鼠，以得到特異性好，濃度高的抗體，從而能 大量制備出廉價的、高質量的抗草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)的抗體。為達到上述目的，本發明的具體技術方案為草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法至 少包括病毒RNA提取、PCR擴增、酶切、連接、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因測序 及原核表達載體構建、感受態細胞的制備與重組質粒的轉換、重組克隆的篩選及酶切鑒定。草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法的具體步 驟如下1、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA ；2、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7) 基因，PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產物；3、將pET_32a(+)質粒和回收產物雙酶切，分別回收pET_32a(+)載體片段和草魚 呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段；4、將pET_32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16 25 °C過夜連接；
5、用連接產物轉化BL21 (DE3)感受態細胞；
6、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28 37°C 震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒分別進行酶切鑒定和 PCR鑒定；7、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37°C培養過夜，菌落PCR鑒定陽 性克隆。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28 37°C 200r/minl搖菌培 養過夜，按1 100比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，28 370C 200r/min至OD600 值達到0. 5，在28 42°C條件下，使用不同IPTG濃度(0. 1 2mol/L)和不同的誘導時間 (1 24h)進行誘導表達；8、將誘導過的重組菌株于4°C 4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心 20-60分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100 200 μ 1 PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE 上樣緩沖液100 200ul (含β巰基乙醇)，煮沸5 10分鐘后取10 μ 1進行SDS-PAGE ；
9、純化重組蛋白；10、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/ c小鼠，20天后加強免疫，取重組蛋白稀釋于碳酸緩沖液，包被抗原，經封閉后將Balb/c小 鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，孵育，用含吐溫20的PBS洗，力口 入酶標二抗，孵育，PBS洗，加入0PD，待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果 (OD492)。草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法的具體步 驟中的步驟2中PCR反應條件為1、95 °C預變性5分鐘；2、94°C變性45秒，55 °C退火45秒，72 °C延伸1分鐘為一個循環，共進行30個循 環；3、72°C延伸 8-10 分鐘。本發明的積極效果為1、構建的草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因的原核表達載體BL21能高效的 表達目的蛋白，并滿足相關實驗的需要；2、用重組蛋白免疫小鼠所制備的鼠抗草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)血清帝 都高，特異性能好；3、該抗體能特異性識別草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)，抗體效價大于 1 20000 ；4、本發明為免疫試劑的制備和免疫保護實驗奠定了基礎。
具體實施例方式下面結合實施例進一步說明本發明的
具體實施例方式實施例一1、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA。2、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7) 基因。PCR反應條件是95°C預變性5分鐘后進入PCR循環，94°C變性45秒，55°C退火45 秒，72°C延伸1分鐘，30個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產物。 3、將pET_32a (+)質粒和回收產物用BamH I和Hind III雙酶切，分別回收 pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段。4、將pET32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16°C過 夜連接，得到了草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體。 5、用連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞。6、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5mL LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)， 37°C震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒。對重組質粒分別進行酶切鑒 定和PCR鑒定。7、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37°C培養過夜，菌落PCR鑒定陽 性克隆。挑取單菌落接種于LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)，37°C 200r/minl搖菌培養 過夜。按1 100的比例接種到新鮮液體LB培養基中(含50 μ g/mL Amp)，37°C 200r/min 至OD6tltl值達到0. 5，在28°C條件下，使用IPTG濃度2mol/L，16小時誘導表達。8、將誘導過的重組菌株于4°C 4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心20 分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100 μ 1 PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液 IOOul (含β巰基乙醇)，煮沸10分鐘后取10 μ 1進行SDS-PAGE。9、純化重組蛋白。10、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/c 小鼠，用量如下重組蛋白20微克/只、CpG-200620微克/只、氫氧化鋁1毫克/只。20天 后加強免疫，操作同上。取重組蛋白稀釋于0. 01碳酸緩沖液，5微克/ml包被抗原，經封閉 后將Balb/c小鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，37度孵育，用含 0. 05%吐溫20的PBS洗，加入酶標二抗，37度孵育，PBS (含0. 05%吐溫20)洗，加入0PD， 待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果(OD492)。得到草魚呼腸孤病毒外衣殼 蛋白(VP7)多克隆抗體，并檢測出抗血清滴度。實施例二1、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA。2、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7) 基因。PCR反應條件是95°C預變性5分鐘后進入PCR循環，94°C變性45秒，55°C退火45 秒，72°C延伸1分鐘，30個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電 泳分析，并回收產物。3、將pET_32a (+)質粒和回收產物用BamH I和Hind III雙酶切，分別回收 pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段。4、將pET32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16°C過 夜連接，得到了草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體。5、用連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞。6、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5mL LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)， 37°C震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒。對重組質粒分別進行酶切鑒 定和PCR鑒定。7、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37°C培養過夜，菌落PCR鑒定陽性克隆。挑取單菌落接種于LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)，37°C 200r/minl搖菌培養 過夜。按1 100的比例接種到新鮮液體LB培養基中(含50 μ g/mL Amp)，37°C 200r/min 至OD6tltl值達到0. 5，在37°C條件下，使用IPTG濃度2mol/L，4小時誘導表達。8、將誘導過的重組菌株于4°C 4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心20 分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100 μ 1 PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液 IOOul (含β巰基乙醇)，煮沸10分鐘后取10 μ 1進行SDS-PAGE。
9、純化重組蛋白。10、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/c 小鼠，用量如下重組蛋白20微克/只、CpG-200620微克/只、氫氧化鋁1毫克/只。20天 后加強免疫，操作同上。取重組蛋白稀釋于0. 01碳酸緩沖液，5微克/ml包被抗原，經封閉 后將Balb/c小鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，37度孵育，用含 0. 05%吐溫20的PBS洗，加入酶標二抗，37度孵育，PBS (含0. 05%吐溫20)洗，加入0PD， 待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果(OD492)。得到草魚呼腸孤病毒外衣殼 蛋白(VP7)多克隆抗體，并檢測出抗血清滴度。實施例三1、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA。2、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7) 基因。PCR反應條件是95°C預變性5分鐘后進入PCR循環，94°C變性45秒，55°C退火45 秒，72°C延伸1分鐘，30個循環，最后72°C延伸10分鐘。PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電 泳分析，并回收產物。3、將pET_32a (+)質粒和回收產物用BamH I和Hind III雙酶切，分別回收 pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段。4、將pET32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16°C過 夜連接，得到了草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體。5、用連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞。6、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于5mL LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)， 37°C震蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒。對重組質粒分別進行酶切鑒 定和PCR鑒定。7、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37°C培養過夜，菌落PCR鑒定陽 性克隆。挑取單菌落接種于LB液體培養基中(含50 μ g/mLAmp)，37°C 200r/minl搖菌培養 過夜。按1 100的比例接種到新鮮液體LB培養基中(含50 μ g/mL Amp)，37°C 200r/min 至OD6tltl值達到0. 5，在42°C條件下，使用IPTG濃度2mol/L，8小時誘導表達。8、將誘導過的重組菌株于4°C 4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心20 分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100 μ 1 PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE上樣緩沖液 IOOul (含β巰基乙醇)，煮沸10分鐘后取10 μ 1進行SDS-PAGE。9、純化重組蛋白。10、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/c 小鼠，用量如下重組蛋白20微克/只、CpG-200620微克/只、氫氧化鋁1毫克/只。20天 后加強免疫，操作同上。取重組蛋白稀釋于0. 01碳酸緩沖液，5微克/ml包被抗原，經封閉后將Balb/c小鼠血清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，37度孵育，用含 0. 05%吐溫20的PBS洗，加入酶標二抗，37度孵育，PBS (含0. 05%吐溫20)洗，加入OPD， 待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果(OD492)。得到草魚呼腸孤病毒外衣殼 蛋白(VP7)多克隆抗體，并檢測出抗血清滴度。
實例檢測結果制備的多克隆抗體抗血清的效價(或滴度)大于1 20000。 Western blot結果顯示純化后蛋白處理樣在約52kDa處有特異性顯色反應，無雜帶出現， 病毒蛋白處理樣在約34kDa處有特異性顯色反應，無雜帶出現，表明制備的多克隆抗體能 與重組蛋白和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)結合，并具有較強的特異性。以上所述僅是本發明的非限定實施方式，對于本領域的普通技術人員來說，在不 脫離本發明創造構思和不作出創造性勞動的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都 屬于本發明的保護范圍。
權利要求
一種草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法，其特征在于草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法至少包括病毒RNA提取、PCR擴增、酶切、連接、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因測序及原核表達載體構建、感受態細胞的制備與重組質粒的轉換、重組克隆的篩選及酶切鑒定、蛋白的表達純化，注射小鼠，血清的采集。
2.根據權利要求1所述的草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗 體制備方法，其特征在于，該表達載體構建制備方法的具體步驟如下(1)、用Trizol提取感染過草魚呼腸孤病毒的CIK細胞總RNA；(2)、通過逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基 因，PCR產物進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分析，并回收產物；(3)、將pET-32a(+)質粒和回收產物雙酶切，分別回收pET_32a(+)載體片段和草魚呼 腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段；(4)、將pET-32a(+)載體片段和草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因片段于16 25 °C過夜連接；(5)、用連接產物轉化BL21(DE3)感受態細胞；(6)、從LB瓊脂平板上挑取菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28 37°C震 蕩培養過夜，使用質粒DNA小量提取試劑盒提取質粒，對重組質粒分別進行酶切鑒定和PCR 鑒定；(7)、將轉化過重組質粒的BL21涂布于LB固體平板，37°C培養過夜，菌落PCR鑒定陽性 克隆。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養基中，28 37°C 200r/minl搖菌培 養過夜，按1 100比例接種到含氨芐青霉素的LB培養基中，28 370C 200r/min至OD600 值達到0. 5，在28 42°C條件下，使用不同IPTG濃度(0. 1 2mol/L)和不同的誘導時間 (1 24h)進行誘導表達；(8)、將誘導過的重組菌株于4°C4000r/min離心5分鐘，取上清12000r/min離心 20-60分鐘，棄上清，將兩次離心沉淀用100 200 μ 1 PBS懸浮，重懸浮液中加入SDS-PAGE 上樣緩沖液100 200ul (含β巰基乙醇)，煮沸5 10分鐘后取10 μ 1進行SDS-PAGE ；(9)、純化重組蛋白；(10)、將重組蛋白、CpG-2006、氫氧化鋁混勻配制疫苗，經腿部肌肉注射免疫Balb/c小 鼠，20天后加強免疫，取重組蛋白稀釋于碳酸緩沖液，包被抗原，經封閉后將Balb/c小鼠血 清(尾靜脈采血)依次加入板中，設1陰性血清對照，孵育，用含吐溫20的PBS洗，加入酶標 二抗，孵育，PBS洗，加入0PD，待充分顯色后加入2M硫酸終止，置于酶標儀讀取結果(OD492)。
3.根據權利要求1和2所述的草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆 抗體制備方法的具體步驟，其特征在于，上述步驟(2)中PCR反應條件為(1)、95°C預變性5分鐘；(2)、94°C變性45秒，55°C退火45秒，72°C延伸1分鐘為一個循環，共進行30個循環；(3)、72°C延伸 8-10 分鐘。
全文摘要
本發明提供了一種草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白原核表達載體構建及多克隆抗體制備方法，該原核表達載體構建制備方法至少包括病毒RNA提取、PCR擴增、酶切、連接、草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因測序及原核表達載體構建、感受態細胞的制備與重組質粒的轉換、重組克隆的篩選及酶切鑒定、蛋白的表達純化，注射小鼠，血清的采集。本發明將草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)基因克隆至原核表達質粒中，并在大腸桿菌中大量表達和純化，經免疫小鼠，以得到特異性好，濃度高的抗體，從而能大量制備出廉價的、高質量的抗草魚呼腸孤病毒外衣殼蛋白(VP7)的抗體，為免疫試劑的制備和免疫保護實驗奠定了基礎。
文檔編號C07K16/10GK101864447SQ201010173210
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月10日 優先權日2010年5月10日
發明者周勇, 徐進, 曾令兵, 肖藝, 范玉頂, 馬杰 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所