重組靈芝免疫調節蛋白與人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及生物制藥領域，重點涉及利用基因工程技術手段對靈芝免疫調節蛋白融合蛋白制備與應用，經過一系列實驗表明，融合蛋白的體內半衰期延長的效果與rLZ-8比較極其顯著，生物活性方面融合蛋白較rLZ-8提升作用及其明顯，特別是在治療白細胞減少癥和抗腫瘤方面融合蛋白較rLZ-8增強白細胞數量和抗腫瘤的作用極其顯著。
【專利說明】重組靈芝免疫調節蛋白與人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及重組融合蛋白的構建、表達、純化與應用，具體涉及用于治療化療導致的白細胞較少癥和腫瘤等癥的重組靈芝免疫調節蛋白與人血清白蛋白融合蛋白的制備及其應用。
【背景技術】
[0002]靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)源自于松杉靈芝的菌絲體，其結構特征如下:包括一個N端的形成二聚體所需的重要結構域和一個C端的FNIII結構域，rLZ-8的N-端結構域由一個a-helix和一個β-strand組成,LZ-8單體上的N端a-helix和β-strand與另一單體上相同的結構域通過空間交換形成了重要的二聚體結合結構域，呈啞鈴狀。已有文獻報道LZ-8具有免疫調節(專利申請號201110222012.5)和殺傷腫瘤細胞(專利ZL200810050206.X)的生物學活性。
[0003]目前，造成蛋白類藥物半衰期較短的原因主要有:①蛋白質水解是絕大多數蛋白質的代謝方式之一，機體組織中蛋白水解酶的存在會使蛋白質藥物活性降低；②腎臟是小分子蛋白質分解代謝過程中最重要的器官，相對分子質量小于69000Da的絕大多數蛋白質分子都能通過腎小球濾過作用而被排出體外肝臟在蛋白質藥物代謝過程中也具有重要作用，藥物通過擴散和載體轉運等形式被轉運至肝細胞中，然后再被微粒體酶P450、胞液中的蛋白酶或溶酶體所降解；而對于更大分子的肽和蛋白質則是通過受體介導的內吞作用被肝細胞攝取后被降解。由于靈芝免疫調節蛋白二聚體分子量不足26kDa，可能造成體內清除率高，藥代動力學參數難以滿足其新藥開發的要求，因此，通過基因水平融合等技術手段延長LZ-8在體內的作用時間，為其在臨床治療中的應用奠定堅實的基礎。為了延長蛋白類藥物的半衰期，近幾年各國學者主要從蛋白類藥物的白蛋白融合、化學修飾、微囊化、構建突變體、糖基化等方面進行研究。`隨著研究的不斷深入和進展，長效蛋白藥物的新品種不斷涌現。
[0004]基因融合技術是將不同的基因連接起來從而表達具有復合功能的融合蛋白，通過基因融合技術增加多肽和蛋白藥物分子量或改變藥物與受體的親和性等原理可以延長藥物的半衰期。構建融合蛋白的原則為:將一個蛋白的編碼基因的終止密碼子去除，然后連接上帶有終止密碼子的另一個蛋白的編碼基因，即實現兩種蛋白的編碼基因的融合，進而同時表達兩種蛋白。融合蛋白基因穩定性高，可調控表達且制備簡單，產物均一，對蛋白、多肽藥物活性影響小等是目前研究長效多肽、蛋白藥物的一種良好的途徑。
[0005]目前研究的較為廣泛的融合基因有人血清白蛋白基因、人免疫球蛋白(IgGl、IgG4)基因等。人血清白蛋白(Human Serum Albumin,簡稱HSA)是人血衆中的蛋白質,其非糖基化的單鏈多肽包含585個氨基酸，分子量為66kDa。在血漿中其濃度為42g/L，約占血漿總蛋白的60%。在體液中人血清白蛋白可以運輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等；同時維持血液正常的滲透壓。在臨床上人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補充因手術、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑。
[0006]人免疫球蛋白(IgG)是人體血液中最豐富的蛋白，其半衰期可達21天。已有報道顯示將IgG的Fe片段與其他蛋白融合，可顯著增加其他蛋白在體內的生物活性和半衰期，其中大多數實驗者選擇IgGl、IgG4這兩種亞型的Fe段作為融合對象，這種方法已經廣泛應用于一些臨床上很重要的細胞因子和可溶性受體，如sTNF- a R、LFA3、CTLA-4、IL_2、IFN- α等，并獲得了成功。
[0007]鑒于上述【背景技術】，本發明采用了基因重組技術將靈芝免疫調節蛋白分別與人血清白蛋白、人免疫球蛋白IgG的Fe段進行融合，構建真核表達體系，經過表達、純化得到目的蛋白，并對目的蛋 白進行了相關生物學活性與藥學研究，結果表明靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)與HSA融合蛋白在藥學與生物學活性以及病理應用方面有明顯差異。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供重組靈芝免疫調節蛋白與人血清白蛋白融合蛋白及其制備方法，探討其在治療化療藥所致白細胞減少癥等癥及在抗腫瘤藥物中的應用。
[0009]融合蛋白序列:本發明的靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)與HSA融合蛋白rLZ-8-HSA，其特征在于包含靈芝免疫調節蛋白和HSA ;其氨基酸序列為:SDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNL GVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGSSMKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLF⑶KLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID N0.1)，其中靈芝免疫調節蛋白多肽的C端與人血清白蛋白多肽之間連接肽的氨基酸序列為GGGGSS ；
本發明提供的靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)與人IgGlFc段的rLZ-8- Fcl融合蛋白，特征在于包含靈芝免疫調節蛋白和IgGlFc段；其氨基酸序列為:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWNGGGGS SEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID N0.2)，其中靈芝免疫調節蛋白多肽的C端與人血清白蛋白多肽之間連接肽的氨基酸序列為GGGGSS ；
本發明提供的靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)與人IgG4Fc段的rLZ-8-Fc4融合蛋白，特征在于包含靈芝免疫調節蛋白和IgG4Fc段；其氨基酸序列為:
RPSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSG RNLGVKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQffNGGGGS SYTQRFKDKAKLTAVTSANTAYMELSSLTNEDSAVYYCSIIYFDYADFIMDYWGQGTTVTVSTASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQXSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLXGKEYKCKVSXKGLPSSIEKTISXAXGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSXWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID N0.3)，其中靈芝免疫調節蛋白多肽的C端與人血清白蛋白多肽之間連接肽的氨基酸序列為GGGGSS ；
工程菌株的構建與目的蛋白表達及純化:分別構建了 LZ-8融合蛋白的核苷酸序列的載體；采用電轉化技術得到以畢赤酵母作為融合蛋白胞外表達的宿主細胞；優化了畢赤酵母發酵條件提高了融合蛋白的表達量；采用重力柱親和層析、分子篩、固定化金屬鰲合親和層析(IMAC)法、疏水層析(HIC)、陰離子交換層析等方法純化目的產物，得到不同融合蛋白的純度均達到99%以上，為后續的藥學實驗提供了原料藥。
[0010]藥學實驗方面:將不同的融合蛋白與rLZ-8作對照進行活性檢查實驗，經過ELISA法檢測得出結論，結果說明融合蛋白rLZ-8-HSA的生物學活性較融合前rLZ_8生物學活性高，有顯著差異，具有統計學意義；而rLZ-8- Fcl與rLZ-8-Fc4的生物學活性沒有達到融合前rLZ-8活性指標，具有顯著差異；將不同的融合蛋白與rLZ-8作對照進行體內半衰期實驗，經過ELISA法檢測得出不同的融合蛋白的體內半衰期均得到顯著提高，約為rLZ-8的3倍；同時將不同的融合蛋白與rLZ-8作對照進行治療白細胞減少癥實驗，經過動物全血細胞分析儀檢測白細胞數，結果表明不同的融合蛋白和rLZ-8在治療白細胞減少癥療效明顯差異；其中，在同一劑 量下，融合蛋白rLZ-8-HSA促進白細胞生長周期更短，在同一治療周期下，融合蛋白rLZ-8-HSA促進白細胞生長數量更多；說明HSA更適合作為rLZ_8的融合對象，能夠明顯增強LZ-8 在治療白細胞減少癥方面的應用；通過融合蛋白rLZ-8-HSA抑制黑色素瘤細胞生長實驗表明，在同一劑量(以LZ-8量計)下，融合蛋白rLZ-8-HSA有效抑制黑色素瘤細胞的生長，與融合前rLZ-8治療效果比較具有明顯差異；同時在融合蛋白rLZ-8-HSA抑制肝癌細胞生長的實施例中可以看到，在同一治療周期內，融合蛋白rLZ-8-HSA治愈率有明顯的提高，是發明人始料未及的；本發明還提供融合蛋白rLZ-8-HSA對治療血小板減少癥的實施例，從中可以看出，與模型組比較，在給藥初期rLZ-8-HSA藥物組已明顯刺激小鼠血小板增生，差異極其顯著，在給藥中期時恢復到正常水平，在治療由注射抗血小板血清導致的血小板減少癥實驗動物模型也取得了很好的效果。
[0011]本發明有益效果如下:本發明中提供的融合蛋白，其體內半衰期的較rLZ-8出現顯著延長；由于基因融合技術構建融合蛋白，會產生蛋白融合后影響目的蛋白的生物活性，而本發明構建的融合蛋白rLZ-8-HSA的生物活性經過試驗證明其生物活性明顯優于融合前的rLZ-8 ;且本發明構建的rLZ-8-HSA融合蛋白畢赤酵母工程菌種發酵工藝簡單，產量高，表達產物單一，易純化，為工業化生產提供了有利條件；由于采用畢赤酵母表達系統存在表達產物在發酵液中易降解等問題，本發明通過控制發酵工藝條件，大大減少了畢赤酵母發酵表達過程中對目的產物的降解，提高了產率；本發明采用體內試驗證明體內半衰期較融合前rLZ-8出現顯著延長的同時在治療白細胞減少癥研究中的最低給藥劑量和起效時間均優于融合前rLZ-8 ;采用黑色素瘤與肝癌作為抗腫瘤研究的代表，分別開展了體內和體外實驗，在黑色素瘤與肝癌實施例中可以看到兩種實驗方式的治療效果均明顯優于融合前rLZ-8，這是發明人始料未及的；在治療血小板減少癥的實施例中可以看出，與模型組比較，在給藥初期rLZ-8-HSA藥物組已明顯刺激小鼠的血小板增生，差異極其顯著，在給藥中期時恢復到正常水平，這也是目前發現的rLZ-8融合蛋白所能達到的最佳效果。
[0012]
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1誘導表達66h與72h各融合蛋白表達情況
圖注:泳道I樣品為蛋白Marker ;泳道2樣品為HSA標準品；泳道3樣品為rLZ_8 ;泳道4樣品為誘導72h rLZ-8-HSA上清液；泳道5樣品為誘導66h rLZ-8-HSA上清液；泳道6樣品為誘導72h rLZ-8- Fcl上清液；泳道7樣品為誘導66h rLZ-8-Fcl上清液；泳道8樣品為誘導72h rLZ-8-Fc4上清液；泳道9樣品為誘導66h rLZ-8_Fc4上清液。
[0014]圖2不同融合蛋白Western Bolt鑒定圖譜
圖注:泳道I樣品為蛋白Marker ;泳道2樣品為rLZ_8 ;泳道3樣品為rLZ_8_HSA ;泳道4樣品為rLZ-8- Fcl ;泳道5樣品為rLZ-8_Fc4。
[0015]圖3 rLZ-8-HSA融合蛋白分子篩純化色譜圖 圖4不同融合蛋白與rLZ-8蛋白體內半衰期對比
【具體實施方式】
[0016]實施例1 rLZ-8融合蛋白工程菌株構建與表達
構建部分:根據酵母密碼子`偏好性分別合成了目的片段rLZ8-HSA、rLZ8_Fcl、rLZ8-Fc4序列，存于puc57質粒中。設計包含酶切位點StuI和KpnI的引物。引物合成如下:
⑴ LZ-8-HSA:5’ CATAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3’
5’ CGGGGTACCGAATTCCTATTACA 3’
⑵ LZ-8-Fcl:5’ GTTAGGCCTTCTGATACTGCTTTGA 3’
5’ TAGGGTACCTCATTTACCAGGGG 3’
⑶ LZ-8-Fc4:5’ CCGAGGCCTTCTGATACTGCTT 3’
5’ GATGGTACCTCACGGAGCATGAG 3’
通過PCR得到目的片段，PCR條件為:開始95 V 30s，然后95 V 30s, 58 V 30s，72°C 2min，共 30 個循環，最后 72°C IOmin 16°C，待機。
[0017]1%瓊脂糖電泳鑒定目的片段分別在在2184bp(LZ-8-HSA)、1064bp(LZ- 8_Fcl)、774bp (LZ-8-Fc4)。將 pPICZ α A 載體和目的片段按照 GENEART Seamless Cloning andAssembly Kit試劑盒說明書操作，載體和目的片段摩爾比是1: 3，與5X緩沖液，IOX酶混合液反應30分鐘。取IOul連接產物轉化到大腸桿菌感受態DH5 alpha中，37°C培養I小時后，涂博來霉素抗性的LB平板。挑取單菌落37°C搖床培養過夜。菌液12000g離心棄上清，質粒小提試劑盒提取重組質粒，測序。用雙酶切和電泳鑒定轉化子是否正確，最后用5’A0X和3’ AOX引物證實序列的正確性。
[0018]取重組質粒用SacI酶線性化，37°C，I小時左右。X33畢赤酵母接種到YPD培養中30°C，300rpm搖床培養過夜。擴大培養到5OOmL，OD6c?達到1.3左右，制備酵母感受態，冰浴30min后至冰浴無菌水重懸，40C，1500g離心5min，重復2次。換冰浴IM山梨醇重懸，4°C，1500g離心5min,分裝每管80ul酵母感受態,加入IOug的線性化質粒。冰浴5分鐘。轉移到電轉杯中，1.5kV，50 μ F，25mA條件電轉化。30°C搖床培養2小時，涂博來霉素Zeocin抗性的YPDS平板，30°C培養3天。
[0019]篩選部分:無菌條件下在博來霉素Zeocin抗性的YPDS平板上分別挑選每種融合蛋白工程菌20個單克隆，挑菌置于IOmL YPD液體培養基中于30°C，300rpm搖瓶培養12小時，1500g, 5min離心棄上清，換BMGY培養基于30°C，300rpm搖瓶培養18小時，1500g, 5min離心棄上清，換BMMY (1%甲醇)培養基，每24小時補加1%甲醇，誘導表達72小時。1500g，5min離心，_20°C保存上清，經SDS電泳及Western Bolt鑒定定量與定性說明目的蛋白的表達，以此篩選高表達工程菌株。
[0020]實施例2融合蛋白純化工藝
由于融合蛋白有公共的LZ-8結構，所以以該結構的特點和性質，分別摸索了重力柱親和層析、分子篩、固定化金屬鰲合親和層析(IMAC)法、疏水層析(HIC)、陰離子交換層析等方法純化，具體方法如下:
rLZ-8-FcUrLZ-8-Fc4 純化方法:
微濾:將發酵液10000轉/分離心得到上清，再用孔徑大小為IOOKd的中空纖維柱純化(微濾)，除去小分子的鹽類和糖類，得到8L含色素、核酸、蛋白的黃色澄清液。
[0021]rProtein A Gravi Trap重力柱親和層析:配制緩沖液A相:0.22M磷酸鹽緩沖液，pH 7.7,0.15M氯化鈉，配制緩沖液B相:0.1M檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.0,0.22 μ m抽濾，超聲脫氣；采用A相磷酸鹽緩沖液平衡色譜柱，體積10ml。分別將預處理的rLZ-8-Fcl、rLZ-8-Fc4發酵液IOml上樣`，反復結合兩次。(樣品處理:90ml發酵液+IOml IOX磷酸鹽緩沖液，0.22 μ m過濾除菌保存)，采用A相磷酸鹽緩沖液沖色譜柱，洗脫未結合。B相檸檬酸鹽緩沖液洗脫樣品，體積10ml。放置2min，棄掉Iml的色譜柱內體積，用1.5ml離心管接收樣品，保留檢測。使用5次之后，需要再生，加入5ml 6M鹽酸胍，放置2min，再用A相沖洗色譜柱。
[0022]分子篩層析:用Superdex 75填料填裝柱(GE公司，XK16/70型，即內徑16mm，高度70cm)，填料高度60cm。用100 μ Ll%丙酮進樣檢測，測定柱效為10000左右。蛋白按照流速2mg/mL濃度5mL上樣，然后用pH7.5, NaH2PO4 -Na2HPO4 (50mM)緩沖液進行洗脫(如圖3)，收集峰進行取樣，進行電泳和HPLC檢測。
[0023]實驗結論:經過精細純化后，蛋白HPLC檢測純度為99%以上，SDS-PAGE電泳一條帶。
[0024]rLZ-8-HSA 的純化方法:
步驟(1):用固定化金屬鰲合親和層析(IMAC)法純化rLZ-8-HSA填料IMAC Sepharose6Fast Flow I升購自于GE公司，裝填XK50/30柱子，填料高度15cm，用純化水置換保存液，用I倍柱體積的0.1M硫酸銅溶液過柱，用4倍體積純化水沖掉未被吸附的銅離子。然后使用緩沖液A:20mmol/L磷酸鹽、0.6mol/L氯化鈉、pH7.3,平衡層析柱。把含人血白蛋白的發酵上清液加入磷酸鹽、氯化鈉、使之的達到20mmol/L磷酸鹽、0.6mol/L氯化鈉、pH7.3。然后使用AKTA? Purify層析系統上樣，流速50ml/min。上樣后，用緩沖液A洗漆，至吸收值達到基點。用緩沖液B:20mmol/L磷酸鹽、0.6mol/L氯化鈉、0.3M咪唑、pH7.5來洗脫目標蛋白，收集緩沖溶液B的洗脫峰。
[0025]步驟⑵:用疏水層析(HIC)進行純化，對步驟⑴收集的B緩沖溶液洗脫峰進行疏水層析純化。用苯基疏水層析介質Phenyl Sepharose? 6Fast Flow (high sub)(GE公司)來裝填直徑5cm的層析柱，柱高15cm。介質在使用前需用3倍柱體積的緩沖液C:50mmol/L磷酸鹽、0.5M氯化鈉、pH6.5平衡。向步驟(1)得到含目標蛋白的B緩沖溶液的洗脫液中加入去離子水，稀釋至0.5M NaCI的濃度，用磷酸調pH值至6.5。用AKTA?Purify層析系統上樣，流速50ml/min，上樣結束后，用2倍柱體積的緩沖液C: 50mmol/L磷酸鹽、
0.5M氯化鈉、pH6.5繼續洗脫。收集流穿峰和用緩沖液C的洗脫峰。與疏水層析柱結合的部分，用2倍柱體積的去離子水洗脫，流出液丟棄。將疏水層析柱收集液，加入終濃度為0.1M的四硼酸鈉和氯化鈣溶液，調節pH至9.0，處理0.5-24小時，然后1000Orpm離心20min，取上清液，用MILLIP0RE公司的IOK超濾膜脫鹽。
[0026]步驟(3):陰離子交換層析精制樣品,裝Q Sepharose?High Preformance填料于一根直徑2.6cm、高15cm的層析柱子中，填料體積80毫升。用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液E (50mMPB,pH7.0)平衡。上樣后使用2個柱體積的緩沖液E洗滌。然后用0-0.5M NaCI經10倍柱體積梯度洗脫，收集主峰。
[0027]實驗結論:經過精細純化后，蛋白HPLC檢測純度為99%以上，SDS-PAGE電泳一條帶。
[0028]實施例3不同融合蛋白促小鼠脾細胞增值比較
采用WST-1方法檢測融合蛋 白對小鼠脾細胞增值作用的影響，反映出其生物學活性的強弱，本發明采用BALB/C雌性小鼠，體重在20-22g，拉頸處死小鼠，無菌條件下取脾臟，置于預先加入5ml含10%小牛血清的DMEM的平皿中；用鑷子分別將脾搗碎，并用紗布過濾組織懸液以除去組織塊，制備脾細胞細胞懸液；取100微升細胞懸液加入900微升2%冰醋酸溶液于顯微鏡下計數。用含2%小牛血清的DMEM調整細胞濃度為5X 106/ml ;分別配制相同摩爾濃度梯度的融合蛋白和rLZ-8，設3個梯度濃度，每個濃度設置9個孔，100微升/孔。加細胞濃度為5X 106/ml的細胞懸液100微升/孔。振蕩混勻后放入37°C、5% CO2孵箱孵育24h ;孵育后加入WST-1，20微升/孔。放入37°C、5%C02孵箱繼續孵育3小時后，測OD450(BIO-RAD酶標儀)。實驗結果見表1。
[0029]表1.不同融合蛋白促細胞增值生物活性(X土s n=9)
AZ 8Allfel.1LZ-8-Fe4
5Am4mdJi ojiSttflji a jiiiflji ijsma-- us_jf
1.197iflji ojiiiaji olmmo? utoaji*
is.pxio^iii, isrnmnl? 械 jiftgiatomijtmjs*
注:與 rLZ-8 組比較，*/7 <0.05。
[0030]由表1可以看出，隨著蛋白濃度的增加，融合蛋白對脾細胞增值作用也在增加，在同一蛋白濃度下，不同融合蛋白與rLZ-8增值作用比較可以看出，rLZ-8-HSA的促脾細胞增值作用高于rLZ-8組，有顯著差異具有統計學意義。而融合蛋白rLZ-8-Fcl與rLZ-8-Fc4對小鼠脾細胞的增值作用明顯減弱；實驗結果說明，LZ-8與HSA融合后的活性位點沒有受到融合的影響，而LZ-8與IgG- Fcl和IgG-Fc4的融合后，蛋白活性受到了影響，阻礙了 LZ-8活性的發揮。
[0031]實施例4.不同融合蛋白半衰期檢測
采用體重在18-22g左右的BALB/c小鼠作為實驗鼠，每組10只小鼠，以融合蛋白100g/kg (LZ-8量計)的劑量靜脈注射給藥，設計時間段為2、4、6、8、10小時后在不同時間段進行采血檢測，得出結果，做出藥物濃度與時間的曲線圖(圖4)由實驗結果可以看出，隨著藥物進入小鼠體內時間的延長，血液中藥物濃度出現不同程度的下降，其中，可以看到融合后蛋白的半衰期與融合前rLZ-8的半衰期比較有極其顯著的增加O°〈0.0001)，大大延長了血液中的藥物濃度，提高rLZ-8在小鼠體內的半衰期。
[0032]實施例5.融合蛋白rLZ-8-HSA治療白細胞減少癥的研究
采用Wistar大鼠作為實驗動物，共18只，體重100g左右。試劑配制方法如下:rLZ_8用無菌生理鹽水配制。分為60 μ g/kg>30 μ g/kg>15 μ g/kg劑量組；rLZ-8_HSA融合蛋白用無菌生理鹽水配制。分為60 μ g/kg、30 μ g/kg、15 μ g/kg (以LZ_8量計)劑量組；金嘉賽強【重組人粒細胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)】，生產批號:20130403 ;75μ8/支，用無菌生理鹽水配制成13.5 μ g/mL，0.1mL/只，注射用環磷酰胺(CP)，生產批號13020225 ；200mg/支。用無菌生理鹽水配制:20mg/mL,0.1mL/只，即20mg/kg。
[0033]正常對照組，rLZ-8低劑量組，rLZ-8中劑量組，rLZ-8高劑量組，rLZ-8-HSA融合蛋白的低中高劑量組 ，陽性對照組(金磊賽強)。除正常對照組(給予等量生理鹽水)外，每組大鼠均給予環磷酰胺尾靜脈注射，20mg/mL，0.1mL/只，連續3天。于第三天，大鼠尾靜脈取血，細胞分析儀檢測白細胞數。造模成功后按上述分組分別給予相應劑量rLZ-8、三種融合蛋白、陽性藥(金磊賽強)治療，正常對照組和CP組給予等量生理鹽水，于治療第I天，第3天和第7天分別大鼠尾靜脈取血，檢測白細胞數。對比治療前后白細胞數變化，分析藥物療效。
[0034]表2.rLZ-8對白細胞低下大鼠模型的影響(n=10)
【權利要求】
1.重組靈芝免疫調節蛋白與人血清白蛋白融合蛋白(rLZ-8-HSA)，其特征在于靈芝免疫調節蛋白的C末端與人血清白蛋白之間由連接肽連接，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所/Jn ο
2.如權利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制備治療化療藥所致白細胞減少癥藥物中的應用。
3.如權利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制備治療抗黑色素瘤、肝癌藥物中的應用。
4.如權利要求1所述的融合蛋白rLZ-8-HSA在制備治療血小板減少癥藥物中的應用。
5.如權利要求2、3、4所述藥物，其特征在于該藥物制劑核心成分是由權利要求1所述的融合蛋白和任選的藥學可接受的輔劑組成。
6.如權利要求5所述的藥物制劑給藥途徑為口服和非腸道給藥，其中，口服包括口服液，片劑，丸劑和膠囊；非·腸道給藥包括外用藥和注射劑。
【文檔編號】C07K19/00GK103524628SQ201310479016
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月15日 優先權日:2013年10月15日
【發明者】孫非, 梁重陽, 張喜田 申請人:張喜田, 孫非