專利名稱：光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法
技術領域：
本發明涉及光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法。
背景技術：
生物材料可以定義為直接和生理環境相接觸的材料。在應用中，生物材料不可避免的與人體內的各種細胞、組織和器官相接觸，因此要求材料具有良好的細胞相容性。生物材料的細胞相容性主要是指生物材料與組織接觸時不會對組織中的細胞產生毒害作用，并要求材料表面有利于細胞的粘附，并有促進細胞的鋪展，遷移、分化、并維持細胞正常的表型和細胞正常生理功能(如軟骨細胞的分泌蛋白多糖和II型膠原的功能)的作用。
人工合成的聚合物材料由于具有良好的物理機械性能和可加工性已被廣泛地應用于生物醫用領域如人造器官、組織工程，骨組織修復、外科整形以及藥物控釋等。例如利用可降解聚合物材料聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)或其共聚物(PLGA)做成的三維多孔支架材料已被應用于骨組織工程和軟骨組織工程。其作用是為細胞提供一個賴以生存的三維立體環境。然而絕大多數人工合成的聚合物材料都具有較強的疏水性，其表面也都是化學惰性的，導致這些聚合物材料的生物相容性尤其是細胞相容性不理想。例如聚乳酸，有研究表明由于其較高的疏水性使得細胞在其表面的粘附率很低，細胞在三維支架內較難貼壁和鋪展，大大限制了其作為可降解組織工程支架材料的應用前景。
發明內容
本發明的目的是為了提高人工合成聚合物材料的細胞相容性，提出光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法。
本發明提出的制備細胞相容性生物材料的方法包括首先在紫外光輻照下，將聚合物材料在過氧化氫溶液中氧化，以在聚合物材料表面引入大分子過氧化氫基團，然后利用氧化后的聚合物材料表面的大分子過氧化氫基團作為引發劑，引發含有活性官能團的乙烯基單體在聚合物材料表面的自由基接枝聚合反應，將活性官能團引入到材料表面，再與生物活性因子反應，將生物活性因子共價健合于聚合物材料表面，賦于聚合物材料表面良好的細胞相容性和生物活性。
本發明提出的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法包括以下步驟1)將聚合物材料放入濃度為10～40％的過氧化氫溶液中，在紫外光輻照下氧化，氧化溫度20～80℃，時間0.1～10小時，在聚合物材料表面引入大分子過氧化氫基團，去離子水沖洗，除去游離的過氧化氫分子；2)將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％含活性官能團的乙烯基單體溶液中，然后除氧充氮，在紫外光輻照下，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，反應溫度20～50℃，時間20～80min；或者將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％的含活性官能團的乙烯基單體溶液中，除氧充氮，在亞鐵離子存在條件下，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，單體中亞鐵離子的濃度為0.01～0.1M，反應溫度20～50℃，時間20～80min；或者將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％的含活性官能團的乙烯基單體溶液中，將單體預先吸附在材料表面，然后將材料取出，除氧充氮，在紫外光輻照下，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，反應溫度20～50℃，時間20～80min；3)采用甲基磺酰氯法或碳化二亞胺脫水縮合法將生物活性因子共價健合于上述步驟2)所得材料表面。
發明中所說的聚合物材料是聚氨酯、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸、聚己內酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯和聚氯乙烯的二維膜和三維多孔支架。
發明中所說的含活性官能團的乙烯基單體是含有酰氨基團的丙烯酰氨和甲基丙烯酰胺，含有羧基的丙烯酸和甲基丙烯酸，含有羥基的甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、丙烯醇、烯丙氧基乙醇，含有磺酸基團的苯乙烯磺酸及其鈉鹽、鉀鹽、銨鹽等。
發明中所說的生物活性因子是指具有良好生物相容性的膠原、明膠、殼聚糖、硫酸軟骨素；具有抗凝血功能的肝素和水蛭素；具有促進細胞粘附和增值功能的纖維粘連蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列肽段、多聚賴氨酸、層粘連蛋白，具有促進細胞分化的分化誘導因子骨形態發生蛋白。
本發明中將生物活性因子共價健合于經接枝聚合反應的材料表面，即生物活性因子固定化可采用甲基磺酰氯法實現或采用碳化二亞胺脫水縮合法實現。
甲基磺酰氯法包括先將經接枝聚合反應后，表面引入羥基的聚合物浸于甲基磺酰氯的乙醚溶液中，甲基磺酰氯的體積濃度為1～20％，反應溫度10～30℃，時間0.5～20小時，利用甲基磺酰氯與聚合物材料表面的羥基反應使羥基活化，然后再浸入含生物活性因子的水溶液中，使活化后的羥基與生物活性因子中的氨基反應，生物活性因子的濃度為1～100mg/ml，反應溫度0～50℃，反應時間1～24小時。
碳化二亞胺脫水縮合法包括先將經接枝聚合反應后，表面引入羧基的聚合物浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDAC)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中進行。反應溫度為0～400C，反應時間為1～24小時。利用水溶性的碳化二亞胺將羧基活化，然后再浸入含生物活性因子的水溶液中，使活化的羧基與生物活性因子中的氨基反應，生物活性因子的濃度為1～100mg/ml，反應溫度0～50℃，反應時間1～24小時。
本發明的方法，通過對材料表面的化學改性，可在原本呈化學惰性的聚合物表面引入化學活性基團，使聚合物材料表面具有良好的化學活性，進一步將一些具有良好細胞相容性或特定功能的生物活性因子引入材料表面，從而賦予材料表面良好的細胞相容性或特定的生物活性，同時本發明對聚合物材料本體的良好的物理機械性能沒有影響。
圖1表面接枝聚甲基丙烯酸的PU平面膜(a)和其表面進一步固定明膠后的PU膜(b)的XPS譜圖中的C1s和N1s峰。明膠的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖2人體血管內皮細胞在PU膜(a)和表面固定明膠后的PU膜(b，c，d)以及聚苯乙烯培養板(e)上的增殖率，其中固定明膠后的PU膜表面的N1s/C1s面積比分別為(b)5.58％，(c)6.55％，(d)7.89％細胞接種密度為15×104/ml。培養時間為4天。明膠的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖3人體血管內皮細胞在表面固定明膠后的PU膜上的形態。其中膜表面的N1s/C1s面積比分別為(a)5.58％，(b)6.55％，(c)7.89％細胞接種密度為15×104/ml。培養時間為4天。明膠的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖4表面接枝聚甲基丙烯酸的PU平面膜(a)和其表面進一步固定RGD后的PU膜(b)的XPS譜圖中的C1s和N1s峰。RGD的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖5人體血管內皮細胞在表面固定RGD后的PU膜上的形態。細胞接種密度為15×104/ml。培養時間為4天。RGD的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖6表面固定不同生物活性因子前后PLLA膜的ATR譜圖。其中a為未改性PLLA膜，b為表面固定明膠的PLLA膜，c為表面固定膠原的PLLA膜，d為表面固定殼聚糖的PLLA膜。I-酰氨I；II-酰氨II。生物活性因子的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖7表面固定不同生物活性因子前后PLLA膜XPS譜圖中的C1S峰。其中a為未改性PLLA膜，b為表面固定明膠的PLLA膜，c為表面固定膠原的PLLA膜，d為表面固定殼聚糖的PLLA膜。(I)C-C；(II)C-O；(III)C(＝O)-NH；(IV)C(＝O)-O。生物活性因子的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖8a軟骨細胞在未改性PLLA膜上的激光共聚焦顯微鏡照片。FDA染色。
圖8b軟骨細胞在固定膠原后的PLLA膜上的激光共聚焦顯微鏡照片。FDA染色。膠原的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖9PLLA膜表面固定不同的生物活性因子前后軟骨細胞在其表面的粘附率、增殖率和細胞活性。其中a為聚苯乙烯培養板，b為未改性PLLA膜，c為表面固定明膠的PLLA膜，d為表面固定膠原的PLLA膜，e為表面固定殼聚糖的PLLA膜。生物活性因子的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法。
圖10表面固定明膠后PLLA膜的XPS譜圖。明膠的固定采用甲基磺酰氯法。
具體實施例方式
實施例1將聚氨酯(PU)平面膜于過氧化氫溶液(30v％)中氧化8小時，溫度為50℃，氧化在紫外光下進行，紫外光由250W的高壓汞燈提供。將氧化后的PU平面膜用大量去離子水沖洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸(MAA)水溶液(10v％)的試管中放置2小時，將MAA預先吸附于PU平面膜表面。將膜取出，放置于石英聚合管中，除氧充氮后由紫外光引發MAA在PU膜表面的接枝聚合反應，紫外光仍然由250W的高壓汞燈提供，接枝時間為1小時，溫度為50℃。然后將PU平面膜浸于含有10mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDAC)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，反應在0℃下進行4小時，反應后PU平面膜表面的羧基被活化。再將PU平面膜與明膠的磷酸鹽緩沖液溶液(10mg/ml)反應，反應在0℃下進行24小時。明膠被共價鍵合于材料表面。改性前后XPS譜圖中的C1S和N1S峰的變化證明了PU膜表面明膠的存在(見表1和圖1)。細胞培養結果表明表面固定明膠后的PU膜對人體血管內皮細胞的相容性明顯提高(見圖2和圖3)表1表面接枝聚甲基丙烯酸(PMAA)的聚氨酯(PU)平面膜(PU-g-PMAA)和表面進一步固定明膠后的PU膜(PU-g-PMAA-b-Gelatin)表面的N1s/C1s面積比。明膠的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法表1接枝密度(×10-2mg/cm2)4.9714.2921.56N1s/C1s面積比(％，PU-g-PMAA)2.452.22 2.05N1s/C1s面積比(％，PU-g-PMAA-g-Gelatin) 5.586.55 7.89實施例2按照實施例1的方法，將明膠溶液換成含有10mg/ml精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(RGD)的磷酸鹽緩沖液，其它條件不變，將RGD共價鍵和于PU平面膜表面。改性前后XPS譜圖中的C1S和N1S峰的變化證明了PU膜表面RGD的存在(見表2和圖4)。細胞培養結果表明表面固定RGD后的PU膜對人體血管內皮細胞的相容性明顯提高(見表3和圖5)表2表面接枝PMAA的PU膜(PU-g-PMAA)和其表面進一步固定RGD后的PU膜(PU-g-PMAA-g-RGD)表面的N1s/C1s面積比。RGD的固定采用碳化二亞胺脫水縮合法表2樣品 PU-g-PMAA PU-g-PMAA-g-RGDN1s/C1s面積比(％) 2.05 5.49表3人體血管內皮細胞在PU-g-PMAA-RGD和對照PU表面的粘附率和細胞活性(相對于組織培養級聚苯乙烯)。細胞接種密度15×104/ml。分別培養12小時和4天后測定細胞粘附率和增值率。
表3樣品PUPU-g-RGD細胞粘附率 54.8±5.0125.0±3.5細胞活性(％)31.5±4.0115.2±5.0實施例3將PLLA平面膜在過氧化氫溶液(30v％)中氧化40分鐘，溫度為50℃，氧化在紫外光下進行，紫外光由250W的高壓汞提供。將氧化后的PLLA膜用大量去離子水沖洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸(MAA)水溶液(10v％)的石英聚合管中，除氧充氮，由紫外光引發MAA在PLLA膜表面的接枝聚合反應。接枝時間為1小時，溫度為50℃，紫外光仍然由250W的高壓汞提供。然后，將平面膜浸于含有10mg/ml EDAC的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，反應在0℃下進行4小時，反應后PLLA平面膜表面的羧基被活化。再將PLLA平面膜與含有4mg/ml膠原的醋酸溶液(pH＝3)反應，反應在0℃下進行24小時。膠原大分子被共價鍵合于材料表面。材料表面被物理涂附的膠原與被共價鍵合于材料表面的膠原之間有較強的相互作用，因而也能夠在材料表面穩定存在，大大提高了材料表面的膠原含量。改性前后的ATR譜圖和XPS譜圖中C1S峰的變化證明了PLLA膜表面膠原的存在(見圖6和圖7)。細胞培養結果表明該方法改性后的PLLA平面膜對軟骨細胞的相容性明顯提高(見圖8a，圖8b，圖9)。利用同樣的方法也可將明膠和殼聚糖固定在PLLA膜表面，提高其對軟骨細胞的相容性(見圖6和圖7和圖9)實施例4將PLLA平面膜在過氧化氫溶液(30v％)中氧化40分鐘，溫度為50℃，氧化在紫外光下進行，紫外光由250W的高壓汞提供。將氧化后的PLLA膜用大量去離子水沖洗，真空干燥后浸于盛有甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA)水溶液(5v％)的石英聚合管中，除氧充氮后由紫外光引發HEMA在PLLA膜表面的接枝聚合反應。接枝時間為1小時，溫度為50℃，紫外光仍然由250W的高壓汞提供。然后，將接枝PHEMA后的PLLA膜浸于含有10mg/ml甲基磺酰氯的乙醚中，25℃下反應2小時，PLLA平面膜表面的羥基被活化。然后將PLLA平面膜與含有4mg/ml明膠的磷酸鹽緩沖液反應，反應在30℃下進行24小時。明膠被共價鍵和于PLLA平面膜表面。改性后XPS譜圖中N1S峰的出現證明了明膠在PLLA膜表面的存在(見圖10)。
權利要求
1.光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于包括以下步驟1)將聚合物材料放入濃度為10～40％的過氧化氫溶液中，在紫外光輻照下氧化，氧化溫度20～80℃，時間0.1～10小時，在聚合物材料表面引入大分子過氧化氫基團，去離子水沖洗，除去游離的過氧化氫分子；2)將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％含活性官能團的乙烯基單體溶液中，然后除氧充氮，在紫外光輻照下，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，反應溫度20～50℃，時間20～80min；或者將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％的含活性官能團的乙烯基單體溶液中，除氧充氮，在亞鐵離子存在條件下，單體中亞鐵離子的濃度為0.01～0.1M，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，反應溫度20～50℃，時間20～80min；或者將氧化后的聚合物材料浸于濃度為1～20％的含活性官能團的乙烯基單體溶液中保持1～10小時，將單體預先吸附在材料表面，然后將材料取出，除氧充氮，在紫外光輻照下，引發乙烯基單體在聚合物材料表面的接枝聚合反應，反應溫度20～50℃，時間20～80min；3)采用甲基磺酰氯法或碳化二亞胺脫水縮合法將生物活性因子共價健合于上述步驟2)所得材料表面。
2.按權利要求1所述的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于所說的聚合物材料是聚氨酯、聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乳酸-羥基乙酸、聚己內酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯和聚氯乙烯的二維膜和三維多孔支架。
3.按權利要求1所述的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于所說的含活性官能團的乙烯基單體是含有酰氨基團的丙烯酰氨和甲基丙烯酰胺，含有羧基的丙烯酸和甲基丙烯酸，含有羥基的甲基丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥乙酯、丙烯酸羥丙酯、丙烯醇、烯丙氧基乙醇，含有磺酸基團的苯乙烯磺酸及其鈉鹽、鉀鹽、銨鹽等。
4.按權利要求1所述的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于所說的生物活性因子是指具有良好生物相容性的膠原、明膠、殼聚糖、硫酸軟骨素；具有抗凝血功能的肝素和水蛭素，具有促進細胞粘附和增殖功能的纖維粘連蛋白、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列肽段、多聚賴氨酸、層粘連蛋白，具有促進細胞分化的分化誘導因子骨形態發生蛋白等。
5.按權利要求1所述的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于所說的甲基磺酰氯法包括先將經接枝聚合反應后表面引入羥基的聚合物浸于甲基磺酰氯的乙醚溶液中，甲基磺酰氯的體積濃度為1～20％，反應溫度10～30℃，時間0.5～20小時，然后浸入含生物活性因子的水溶液中，生物活性因子的濃度為1～100mg/ml，反應溫度0～50℃，反應時間1～24小時。
6.按權利要求1所述的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法，其特征在于所說的碳化二亞胺脫水縮合法包括先將經接枝聚合反應后表面引入羧基的聚合物浸于含有1～50mg/ml的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亞胺(EDAC)的磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)中，反應溫度為0～40℃，反應時間為1～24小時，然后浸入含生物活性因子的水溶液中，生物活性因子的濃度為1～100mg/ml，反應溫度0～50℃，反應時間1～24小時。
全文摘要
本發明公開的光氧化接枝與生物活性因子固定化制備細胞相容性生物材料的方法包括首先在紫外光輻照下,將聚合物材料在過氧化氫溶液中氧化,以在聚合物材料表面引入大分子過氧化氫基團,然后利用氧化后的聚合物材料表面的大分子過氧化氫基團作為引發劑,引發含有活性官能團的乙烯基單體在聚合物材料表面的自由基接枝聚合反應,將活性官能團引入到材料表面,再與生物活性因子反應,將生物活性因子共價健合于聚合物材料表面,賦于聚合物材料表面良好的細胞相容性和生物活性。
文檔編號C08F259/00GK1389481SQ0213603
公開日2003年1月8日 申請日期2002年7月12日 優先權日2002年7月12日
發明者高長有, 馬祖偉, 管建均, 龔逸鴻, 計劍, 沈家驄 申請人:浙江大學