專利名稱：一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合及其確定方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥生產技術，具體地說是一種提取猴頭菇菌絲體胞內多 糖的工藝組合及其確定方法。
背景技術：
猴頭菇是著名的藥食兼用菌，用子實體入藥，性平味甘，具有助消化、利 五臟的功能，是治療慢性胃炎、十二指腸潰瘍、胃悶脹、胃潰瘍等多種消化道 疾病的良藥。它是"高蛋白，低脂肪"食品，是一種很好的保健真菌。
猴頭菇多糖廣泛應用在醫藥、食品等領域，市場需求量與日俱增，但目前 猴頭菇多糖的生產幾乎都是從子實體中提取，猴頭菇野生資源缺乏，人工栽培 的周期長，占地面積大，又受季節限制，從而影響了猴頭菇的充分利用。利用 深層發酵技術生產猴頭菇菌絲體多糖，其生物功效和猴頭菇子實體多糖幾乎相 同，而其生產周期短、成本低、產量大，具有工業化的生產前景。
在深層發酵中形成的猴頭菇菌絲體多糖分胞外多糖和胞內多糖兩部分，而
胞內多糖占了60-90%，是猴頭菇多糖菌絲體多糖的主要來源。常用的提取多糖 方式有熱水浸提法、酸浸提取法、堿提取法、酶提取法等。由于菌絲體細胞壁 的存在，細胞內的組分難以順利釋放到胞外，細胞內外的果膠質和蛋白質等非 多糖物質也使多糖的提取效率和純度受到影響，傳統的一些提取多糖方式致使 猴頭菇多糖的提取過程耗時長、提取率低、提取物中多糖含量相對較低，或者 因化學試劑的反應而破壞了多糖的分子活性構像。因此，尋找高效的多糖提取 方法是發展猴頭菇菌絲體多糖是這一領域的關鍵。
天然藥用成分大多為細胞內產物，提取時多需進行細胞破碎，而現有的機械和化學方法有時難于取得理想的破碎效果。將超聲波技術應用于猴頭菇菌絲 體多糖的提取，是利用超聲波產生的強烈振動、高加速度、強烈的空化效應、攪 拌等作用，加速有效成分進入溶劑，從而提高浸出率，縮短提取時間，同時可 避免對提出成分的影響。此技術在中藥有效成分提取、分離與制備工藝中已被 廣泛應用。
在菌絲體多糖的提取過程中，還可利用合適的酶，在較溫和的條件下將細 胞組織分解，加速有效成分的釋放，從而提高多糖得率。將纖維素酶、果膠酶 及蛋白酶組成的復合酶用于多糖的提取，以除去細胞壁胞和細膜上的果膠、纖 維素及蛋白質等成分，使得菌絲體細胞順利破裂,有利于促進胞內多糖的溶出， 以達到提高提取率、縮短提取時間、減少能耗和有效保存多糖生物活性的目的。 但由于加酶提取會提高生產成本，同時也給產物的分離帶來困難，在添加量上要 嚴格控制。
發明內容
本發明的目的在于，利用超聲波作為輔助手段對猴頭菇菌絲體組織進行處 理，同時以纖維素酶、果膠酶及蛋白酶組成的復合酶對猴頭菇菌絲體水浸液酶 解獲得猴頭菇多糖，提供一種具有比常規方法更佳的提取效果，以較低的成本 提取猴頭菇菌絲體胞內多糖工藝及其確定方法。
本發明的技術方案是 一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合，料液 比按質量比為l: 10~ 1: 60，復合酶加入量在原料質量的0.5%—5.0%之間，超 聲波功率范圍值為100 W 一 500 W之間，酶解時間范圍值為40 min - 100 min之 間，酶解溫度范圍值為30°060 'C之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。
所述的一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合的確定方法是
51) 選定優質的猴頭菇菌絲體深層發酵所得的菌絲體干粉
2) 確定料液比
將步驟1)選定的菌絲體干粉充分溶入水中，猴頭菇菌絲體合理料液比在
1: 10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之間。在該料液比條件下，進行熱水浸提多糖實 驗，控制浸提溫度為50 95 。C、浸提pH值4. 0 7. 5、浸提時間40min 120 min 范圍內。浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離 心后去除十.清液，真空干燥至恒重，稱量。通過比較，確定熱水浸提獲得的猴 頭菇菌絲體胞內多糖提取率最高的料液比，就是本品種的最佳料液比。
3)確定復合酶的添加量
根據上面歩驟2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的復合 酶量，范圍在浸提液原料質量的0.5%—5.0%之間。在合適的酶解條件下，進行 單因素實驗，確定最適的復合酶的添加量。在該復合酶的添加量條件下，控制 浸提溫度為40 65 °C、浸提pH值4. 0 6.5、浸提吋間40min 80min范圍內。 浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除 上清液，真空干燥至恒重，稱量。通過比較，確定猴頭菇菌絲體胞內多糖提取 率最高的復合酶的添加量，既為本品種的最佳復合酶的添加量。
4)確定超聲波-復合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合 在超聲波輔助作用下進行猴頭菇發酵菌絲體多糖的復合酶解提取。在步驟 2)和3)的料液比和復合酶添加量的條件下，以超聲波功率(因素A)、酶解 時間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值(因素C)為分析對象，進行4 l大l素3水平正交實驗，獲得最佳提取工藝組合。根據前期實驗結果，因素A的實 驗范W值為IOO W - 500 W之間，因素B的實驗范圍值為40 min - 100 rain之間，因素C 的實驗范圍值為3(TC-60 'C之間，因素D的實驗范圍值為4.0-8.0之間。在該提 取組合工藝條件下，進行菌絲體多糖提取，浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4 倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量。 通過比較，確定猴頭菇菌絲體胞內多糖提取率最高的工藝組合，既為本菌絲體 干粉的最佳提取工藝組合。
本發明與現有技術相比，具有以下優點
1、 利用超聲波產生的強烈振動、超高的速度、強烈的空化效應，可加速藥 物有效成分進入溶劑。
2、 復合酶的加入，有效地分解了這些非多糖組分，在超聲波機制的協同作 用下，可更加徹底地提高多糖的得率，縮短提取時間，節約溶劑，有利于保護 多糖有效成分。
3、 技術在猴頭菇菌絲體多糖的提取工藝改造中，可顯著降低生產成本，提 高分離效率，并適合在工業化生產中推廣應用。
具體實施例方式
浙江省慶元縣方格藥用菌有限公司生產的猴頭菇菌絲體干粉多糖提取工
藝組合，其組成是料液比按質量比為l: 30,復合酶加入量為2%，超聲波功率
為200W ，酶解時間50min,酶解溫度55'C，酶解pH侑5.0。
所述的一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖工藝組合的確定方法為
1) 選定浙江省慶元縣方格藥用菌公司生產的猴頭菇菌絲體干粉作為提取原料。
2) 確定料液比通過熱水浸提法提取多糖。選取歩驟1)的菌絲體干粉100g，以加水倍數
為分析因素，設置IO、 20、 30、 40、 50、 60倍(質量倍數)，加熱至90。C維持3 小時，過濾。將濾液在旋轉蒸發器濃縮至100ml，冷卻至常溫。力B400ml的95。/o乙 醇于濃縮液中，同時用玻璃棒攪拌10分鐘，將混合液1000rmp離心2分鐘，去除 h清液，得菌絲體多糖沉淀，真空干燥至恒重后稱量。發現加入30倍重量(3000g) 的水后，再增加水的倍數提取獲得多糖量變化不人，故確定料液比為l: 30。 3)確定復合酶的添加量
通過復合酶解法提取多糖。以復合酶制劑添加量為實驗因素，在料液比為l: 30，溫度45'C， pH6. 5，酶解時間80min的條件下，復合酶添加量設置為O. 5%、 1.0%、 1.5%、 2.0%、 2.5%、 3.0%、 3.5% (相對菌絲體干粉的質量百分比)，酶 解時間80min后，95"C加熱滅酶5min， 8(TC熱水繼續浸提60min，過濾后濾液處理 歩驟同l，獲得的猴頭菇菌絲體胞內多糖，稱量。發現復合酶添加量設置為2.0% 以后，再增加復合酶添加量，酶解浸提獲得的猴頭菇菌菌絲體胞內多糖變化不 大，故確定復合酶添加量為2.0%。
4)確定本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合
通過超聲波-復合酶解法提取多糖。在料液比為l: 30，加酶量2.0%的條件下， 以超聲波功率(因素A)、酶解時間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值 (因素C)為分析對象，進行4因素3水平正交實驗，正交因素水平表如下影響因素
酶解時間(B) 酶解溫度(C)
水平l ■W 50min
35'C
5.0
水平2 200W 70min 45 °C 6.0
水平3 300W 90min 55 °C 7.0
在各個正交組合條件下的超聲波-復合酶解法操作后，酶解時間95"C加熱滅 酶5min， 8(TC熱水繼續浸提60min，過濾后濾液處理步驟同l，獲得的猴頭燕菌菌 絲體胞內多糖，稱量。
試驗結果表明，在A2B,CA的工藝組合條件下，菌絲體胞內多糖提取率最高， 即當料液比為l: 30，加酶量2.0%條件下，超聲波功率為200W ，酶解時間50min， 酶解溫度55。C，酶解pH值5.0時，菌絲體胞內多糖提取率最高。
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權利要求
1、一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合，其特征在于各組分為料液比按質量比為1∶10-1∶60，復合酶加入量在原料質量的0.5％-5.0％之間，超聲波功率范圍值為100W-500W之間，酶解時間范圍值為40min-100min之間，酶解溫度范圍值為30℃-60℃之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。
2、 按照權利要求l所述的一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合的確定方法，其特征在于1) 選定優質的菌絲體深層發酵所得的菌絲體干粉2) 確定料液比將步驟1)選定的菌絲體干粉充分溶入水中，猴頭菇菌絲體合理料液比在1: 10 (g:g) — 1: 60 (g:g)之間，在該料液比條件下，進行熱水浸提多糖實驗，控制浸提溫度為50 95 'C、浸提pH值4.0 7.5、浸提時間40min 120min范圍內，浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量，通過比較，確定熱水浸提獲得的猴頭菇菌絲體胞內多糖提取率最高的料液比，就是本品種的最佳料液比；3)確定復合酶的添加量根據上面步驟2)中的最佳料液比配成的浸提液原料中，加入合理的復合酶量，范圍在浸提液原料質量的0.5%—5.0%之間，在合適的酶解條件下，進行單因素實驗，確定最適的復合酶的添加量，在該復合酶的添加量條件下，控制浸提溫度為40 65 。C、浸提pH值4,0 6.5、浸提時間40min 80min范圍內。浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000r卿離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量，通過比較，確定猴頭菇菌絲體胞內多糖提取率最高的復合酶的添加量，既為本品種的最佳復合酶的添加量；4)確定超聲波-復合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合在超聲波輔助作用下進行猴頭菇發酵菌絲體多糖的復合酶解提取，在步驟2)和3)的料液比和復合酶添加量的條件下，以超聲波功率(因素A)、酶解時間(因素B)、酶解溫度(因素C)、酶解pH值(因素C)為分析對象，進行4因素3水平正交實驗，獲得最佳提取工藝組合，根據前期實驗結果，因素A的實驗范圍值為IOO W - 500 W之間，因素B的實驗范圍值為40 min - 100min之間，因素C的實驗范圍值為3(TC-60 'C之間，因素D的實驗范圍值為4.0-8.0之間，在該提取組合工藝條件下，進行菌絲體多糖提取，浸提液蒸發濃縮5 15倍后，加入4倍體積的95%乙醇沉淀，2000rmp離心后去除上清液，真空干燥至恒重，稱量，通過比較，確定猴頭菇菌絲體胞內多糖提取率最高的工藝組合，既為本菌絲體干粉的最佳提取工藝組合。
全文摘要
一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖的工藝組合，料液比按質量比為1∶10-1∶60，復合酶加入量在原料質量的0.5％-5.0％之間，超聲波功率范圍值為100W-500W之間，酶解時間范圍值為40min-100min之間，酶解溫度范圍值為30℃-60℃之間，酶解pH值范圍值為4.0-8.0之間。所述的一種提取猴頭菇菌絲體胞內多糖人工藝組合的確定方法為選取優質的菌絲體深層發酵所得的菌絲體干粉；確定料液比；確定復合酶的添加量；確定超聲波-復合酶解法提取本菌絲體干粉多糖的最佳提取工藝組合。
文檔編號C08B37/00GK101560262SQ20091009921
公開日2009年10月21日 申請日期2009年6月1日 優先權日2009年6月1日
發明者李衛旗 申請人:浙江大學