專利名稱：胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種轉基因載體及其制備方法，更具體地說，涉及一種改性聚乙烯醇轉基因載體及其制備方法。
背景技術：
基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正、補償基因的缺陷或異常，從而達到治療目的的方法。通過基因治療可以使某些通過其他手段無法治愈的疾病得到有效地治療甚至預防。基因工程病毒最早被用作基因載體。早期研究證明了病毒載體的高效率，然而，其副作用也十分的明顯。人們認識到病毒載體可能通過插入誘變引發癌癥，因為基因隨機嵌入寄主染色體可能會擾亂重要的正常的基因的表達。此外，基因載體本身也會引發免疫響應從而產生嚴重的后果。這些為題促使了人們對于更加安全的低病原性和致免疫性的非病毒基因載體的研究，這些研究包括脂質體載體，無機材料和基于高分子材料的非病毒載體。除了更加安全之外，這些非病毒載體具有更加豐富的物理化學結構來提供多樣化的功能。然而非病毒載體普遍有著轉染效率低的缺點。陽尚子聞聚物作為非病毒載體的一部分，它除了存在非病毒載體的特點(低毒性，低免疫原性和低致癌性)以外，還有自身的優勢，即易制備和攜帶目的基因能力高，這些更加有利于其作為轉基因載體的應用。常見的陽離子高聚物能夠通過強靜電作用有效縮合DNA，形成較穩定的聚電解質復合物(PECs)。這些PECs易于細胞內化，從內涵體中逃逸，并能有效保護DNA免受DNA酶的降解。但是陽離子高聚物作為基因載體應用時，仍呈現出了一些問題，例如生物相容性差、有毒性、以及轉染效率低等。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體及制備方法和應用。該共聚物具有轉基因的能力，實現對于DNA的運輸和表達。本發明制備方法簡單，合成條件溫和。本發明的目的通過下述技術方案予以實現胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體，以聚乙烯醇為主鏈，具體結構如下所示
權利要求
1.胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體，其特征在于，以聚乙烯醇為主鏈，具體結構如下所示
2.一種制備胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體的方法，其特征在于，按照下述步驟進行首先，即步驟(1)，將聚乙烯醇和對甲苯磺酰氯進行反應得到聚乙烯對甲苯磺酸酯；其次，即步驟(2)，將聚乙烯對甲苯磺酸酯和過量的乙二胺反應，以得到乙二胺修飾的聚乙烯醇； 然后，即步驟(3)，將乙二胺修飾聚乙烯醇和IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽放入容器中，加入蒸餾水進行溶解，室溫下進行反應，得到胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
3.根據權利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(I)具體來說，向容器中加入聚乙烯醇和吡啶，85°C下預反應兩小時，再向該燒瓶中加入雙倍體積的吡啶，反應體系降溫至5°C左右；冷卻后，再向容器中加入I. 5倍體積的對甲苯磺酰氯，溶液變為淡黃色；反應體系在5 10°C下反應24h ;結束后，向反應瓶中加入等體積丙酮，使得非均相反應體系中的不溶物充分溶解，將溶液加入約10倍體積的蒸餾水中產生白色沉淀，減壓抽濾，棄掉液體；重復這一步驟，將濾得固體再次溶于丙酮并在水中沉淀，減壓抽濾得到產物并進行真空干燥，即得到聚乙烯對甲苯磺酸酯。
4.根據權利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體來說，將得到的聚乙烯對甲苯磺酸酯加入容器中，加入二甲基亞砜使其溶解，并加入過量的乙二胺，在70°C下反應48h;冷卻后，加入鹽酸調節pH至中性，將反應液在去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500Da)，每8h換一次水，冷凍干燥，得到乙二胺修飾的聚乙烯醇。
5.根據權利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體來說，將乙二胺修飾聚乙烯醇和IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽放入容器中，加入蒸餾水進行溶解，20-25度反應24h，再將反應液在去離子水中透析3天(透析袋截留分子量3500Da)，每8h換一次水，冷凍干燥，得到胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
6.根據權利要求2所述的一種制備胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體的方法，其特征在于，在完成步驟(2)后，可對乙二胺修飾的聚乙烯醇進行核磁氫譜測試，通過測試結果確定乙二胺的接枝率，并根據氨基摩爾量加入不同量的IH-吡唑-I-甲咪鹽酸鹽進行反應，進而得到不同胍基化程度不同的胍基化聚乙烯醇非病毒基因載體。
7.如權利要求I所述的胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體在基因治療領域的應用。
全文摘要
本發明公開一種胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體及制備方法和應用。它是通過對甲苯磺酰氯活化聚乙烯醇得到聚乙烯對甲苯磺酸酯，再通過乙二胺引入氨基，最后再對氨基進行胍基化，其制備方法簡便，條件溫和。本發明提供的胍基化聚乙烯醇轉基因非病毒載體可用作基因載體，轉染效率高，細胞毒性低，是一種有效的非病毒基因載體。
文檔編號C08F8/30GK102718903SQ20121014298
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者劉文廣, 劉璐, 楊建海 申請人:天津大學