一種重組仙臺病毒的純化方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，設及一種可滿足重組仙臺病毒載體疫苗規模化生 產的仙臺病毒純化方法。
【背景技術】
[0002] 仙臺病毒基因組是一條負鏈RNA，長度為15384個核巧酸，共包括6個基因。核蛋 白 NPOiucleoprotein)、憐酸化蛋白 P (地OS地oprotein)、聚合酶大亞基 LQarge protein) 和RNA共同構成核蛋白復合物RNP。基質蛋白！(matrix protein)用于病毒顆粒的組裝。 血凝素神經氨酸酶HN化emagglutinin-neuraminidase)和融合蛋白F(fusion protein)是 位于病毒胞膜上的糖蛋白，主要參與病毒粒子與宿主細胞的吸附和侵入等過程。
[0003] Leader(Id)和traileHtr)分別是仙臺病毒基因組中特有的前導序列和末端 序列。六個基因頭尾相連排列在基因組中，每一個基因作為一個表達單元（開放式閱讀 框），其中又可W分為幾個獨立的區域，分別是基因起始區域GS (Gene Start)、不轉錄區域 UTR (Untranslate region)和基因結束區域 GE (Gene Elnd), IQntergenic motif)是重復 的3bp片段排列在基因和基因的連接處。
[0004] 仙臺病毒的包裝過程：pSeV質粒進入細胞后，在輔助病毒乃巧-3(化erst, T. R. et al, Proc.化tl. Acad. Sci. USA 83:8122-8126, 1986)T7 聚合酶的作用下開始復制正鏈 RNA， 在輔助質粒pTM-N、pTM-P和pTM-L合成的N、P和L蛋白的作用下復制成負鏈RNA，也就是 仙臺病毒基因組，然后開始表達M蛋白，HN蛋白，F蛋白，并最終包裝成完整的病毒顆粒，W 出芽形式形成具有感染能力的仙臺病毒。
[0005] 隨著反向遺傳學技術的發展，仙臺病毒被開發為胞質表達傳播缺陷性的病毒載 體，臨床前研究已證實其攜帶外源基因對某些疾病，如呼吸道疾病、缺血性損傷和腫瘤等具 有很好的治療作用。
[0006] 由于仙臺病毒屬于負單鏈RNA病毒，病毒的復制和組裝等全部生活周期均在細胞 質中完成，復制時也沒有DNA鏈合成過程，而僅W其本身為模板進行正、負鏈RNA的合成和 轉錄翻譯，尚沒有發現其具有整合進入細胞核DNA中的機制和跡象，因此使用起來有較大 的安全保障，解決了長期W來基因治療中產生的安全性問題；其次，由于該病毒外膜含有仙 臺病毒所特有的F蛋白，因此可W高效地將其RNP轉入細胞，復制轉錄后產生足夠的目的蛋 白產物，來達到治療的目的；另外，由于其感染效率高，使用劑量小，因此治療過程中由病毒 本身引起的副作用要比其它載體系統小得多，安全性更高；目前已經發現，仙臺病毒可W感 染包括肌細胞、神經細胞和上皮細胞在內的幾乎所有類型的細胞，運一特點使其應用面進 一步拓寬，可被廣泛用于基因治療和基因免疫等各個領域。
[0007] 在臨床前研究中，重組仙臺病毒載體在重度下肢缺血基因治療制劑、阿爾茨海默 病（早老性癡呆癥）疫苗和艾滋病疫苗中都表現出了極好的治療效果。
[0008] 重組病毒在應用之前，都要在宿主細胞中增殖之后，從宿主細胞中裂解并進行純 化。選擇一種合適的純化方法對獲得高純度的重組病毒至關重要。
[0009] 本發明提供一種重組仙臺病毒純化方法，該方法可滿足規模化生產重組仙臺病毒 載體疫苗，為大規模生產安全、有效的重組仙臺病毒載體疫苗奠定了理論基礎。
【發明內容】
[0010] 一種重組仙臺病毒的純化方法，其特征在于包括W下步驟：
[0011] (1)真空過濾病毒初始液 陽〇1引 似親和層析
[0013] (3)超濾
[0014] (4)核酸酶處理
[0015] (5)凝膠過濾層析；
[0016] (6)測定病毒滴度及進行SDS-PAGE電泳。
[0017] 其中，真空過濾病毒初始液選擇0. 45 y m濾膜過濾。
[0018] 濾膜過濾后，將包含病毒的濾液進行親和層析。親和層析優選使用橫酸化纖維素 進行。該層析介質配基為橫酸基多糖，可W和仙臺病毒表面HN蛋白特異性結合，在低離子 強度下可W吸附大部分仙臺病毒，并可在高離子強度下將其洗脫下來，同時對病毒活性影 響不大。收集的病毒培養液W低離子強度的憐酸鹽緩沖液稀釋后直接上親和層析柱，低離 子強度的憐酸鹽緩沖液優選含75mM化Cl溶液。用低離子強度的憐酸鹽緩沖液沖洗柱子后， 再W高離子強度的憐酸鹽緩沖液洗脫，優選為含IM化Cl的憐酸鹽緩沖液，收集洗脫液。
[0019] 然后將病毒洗脫液進行超濾濃縮，超濾膜包優選截留分子量為500K的超濾膜包。
[0020] 超濾濃縮后用核酸酶處理濃縮液，W去除濃縮液中的宿主DNA雜質。
[0021] 本發明所述核酸酶是Benzonase。
[0022] 核酸酶處理病毒液后，繼續進行凝膠過濾，凝膠過濾柱優選為Se地arose 4 FF層 析柱，收集病毒峰即為病毒終液。
[0023] 病毒終液滴度測定采用血凝試驗（HA)法和細胞感染單位（cell infectious unit, CIU)法。
[0024] HA測定法：仙臺病毒外膜表面存在可與紅細胞表面唾液酸殘基結合的HN蛋白，該 蛋白同時兼具唾液酸酶活性，可裂解細胞表面糖蛋白上的唾液酸殘基，但在低溫下HN主要 表現出的是唾液酸的結合活性，因此可W用來測定病毒的血凝滴度。在一定范圍內，測定孔 中細胞密度小于或等于病毒濃度時可出現完全血凝，一旦病毒數目低于細胞數目，則出現 不完全血凝。因此進行滴毒測定時可W將出現完全血凝的孔定為血凝終點，此孔中的病毒 粒子數與細胞數相等，由此可W計算出樣品中病毒粒子的密度。
[00巧]如附圖1所示，血球完全凝集者為陽性（全黑色圓圈），本發明的純化方法純化的 病毒終液的病毒粒子密度為：8X107X2048 = 1.64xl〇iiVP/ml 陽0%] CIU測定方法：純化的病毒液為非傳播型缺陷病毒，可W感染宿主細胞化C-MK2， 在其中復制并產生無感染能力的子代病毒粒子。感染后的細胞W間接免疫法染色后，通過 巧光顯微計數確定被檢樣品中有活性的病毒粒子數目。采用CIU分別測定剛從細胞中裂解 得到的病毒初液和經本發明所述純化方法純化得到的病毒終液的滴度，病毒初液的滴度為 2. 31E+11，病毒終液的滴度為1. 45E+11，用本發明的純化方法的純化效率達到62. 45%。
[0027] 同時，本發明還對純化的病毒終液進行SDS-PAGE電泳，結果可觀察到仙臺病毒典 型的7條條帶。
【附圖說明】
[00測圖1顯示的是本發明純化得到的重組仙臺病毒SDS-PAGE結果，泳道1代表分子量 標準（購于Promega)，泳道2代表純化的重組仙臺病毒。
[0029] 圖2顯示的是HAU法測病毒滴度結果圖，全黑圈代表血球完全凝集，圓圈中有點的 代表不完全凝集或不凝集。
【具體實施方式】 陽〇3〇] 實施例1
[0031] 真空過濾病毒初始液
[0032] 1.將收集的仙臺病毒上清液3000ml在真空條件下進行過濾，濾膜孔徑為 0. 45 Ji m ；
[0033] 2.收集濾液，將濾液用IOmM pH7. 2的憐酸鹽溶液稀釋2倍至6000ml。
[0034] 實施例2 陽0對親和層析
[0036] 1.用400ml憐酸鹽緩沖液（包含1. 5M化Cl溶液）洗涂親和層析柱，保持流速為 37ml/min ；
[0037] 2.在4°C下用400ml蒸饋水洗涂親和層析柱；
[0038] 3.在4°C條件下，用400ml 0.1 M化OH溶液清洗層析柱；
[0039] 4.在4°C下用400ml蒸饋水洗涂親和層析柱；
[0040] 5.用柱管中的循環水冷卻層析柱，然后用冰冷的洗涂溶液（含有75mM化Cl的憐 酸鹽緩沖液）洗涂；
[0041] 6.將過濾得到的病毒液上樣；
[0042] 7.用650ml冰冷的洗涂溶液洗涂親和層析柱；
[00創 8.用360ml冰冷的洗脫液（含有IM化Cl的憐酸鹽緩沖液）洗脫； W44] 9.收集波長280皿峰值處的洗脫液，體積約為150-200ml。 W45] 實施例3 陽046] 超濾
[0047] 1.用500ml 0.1 M的化OH清洗超濾系統，然后用相同體積的蒸饋水和憐酸緩沖液 DPBS (不含 Ca27Mg2〇 洗涂；
[0048] 2.調節壓力累的壓力為20psi，并開啟壓力累；
[0049] 3.收集超濾后的病毒液；
[0050] 4.關閉壓力累，在小瓶中加入180ml SmM MgCVDPBS溶液；
[0051] 5.重復步驟2-3,收集病毒液。 陽0巧 實施例4
[0053] 核酸酶處理
[0054] 將核酸酶加入超濾后的病毒液中，使核酸酶的濃度為100U/ml，37°C消化30min 陽0對實施例5
[0056] 凝膠過濾
[0057] 1.用4°C冷水循環冷卻凝膠過濾柱，并用500ml 4°C蒸饋水洗涂柱子，保持流速為 5ml/min ；
[0058] 2.用500ml 0.1 M化OH溶液清洗層析柱，4°C過夜； W59] 3.用1000 ml冰冷的DPBS平衡層析柱； W60] 4.上樣；
[0061] 5.用1000 ml冰冷的DPBS溶液洗脫病毒液；
[0062] 6.冰上收集第一個洗脫峰，用0. 22 y m的微孔濾膜過濾病毒洗脫液； 陽06引 7.將病毒液分裝為IOml/瓶，用干冰/乙醇迅速降溫，并-80°C保存。
[0064] 實施例6 陽0化]病毒滴度測定
[0066] 6. IHA 測定法
[0067] 1.將待檢樣品從-80°C冰箱中取出，立即放于37°C水浴鍋中，待冰完全融化前取 出，放于4°C冰箱中待用。
[0068] 2.取U型底96孔板放在生物安全柜中，從第一孔加 PBS SOul/孔，共16個孔。
[0069] 3.取待檢樣品50ul加在第一孔，用加樣器反復混勻，再取50ul加到下一孔中，如 此依次稀釋到第15孔，在第15孔中取出50ul棄掉；第16孔設為陰性對照。
[0070] 4.向各孔中加入新鮮配制的雞紅細胞，8X107cells/ml，50ul/孔。順序為先加陰 性孔（第16孔），再依從稀到濃的順序加入雞紅細胞，蓋上蓋子，輕輕拍打板子側面，使之混 勻。 陽07U 5. 4°C放置1小時，觀察結果，照化記錄。
[0072] 6.結果判定：血球完全凝集者判為陽性，凝集終點為最后一個完全凝集的孔，病 毒滴度按W下公式計算：
[0073] 病毒滴度=凝集終點孔的病毒稀釋度
[0074] 病毒粒子密度=8 X IO^X病毒滴度 陽0巧]6. 2CIU測定法
[0076] 1. W 2 X IO6AScm2培養瓶接種LLC-MK2細胞，培養S天后，消化細胞，于試驗前72 小時接種細胞于六孔板。 陽077] 2.將待檢樣品從-80°C冰箱中取出，立即放于37°C水浴鍋中搖動，待冰即將完全 融化前取出，放于4°C冰箱中待用。
[0078] 3.取無菌EP管7支，分別標記。按下表向各管中加入病毒稀釋液，并參考W下方 式將樣品用含有1 % BSA的DPBS (預冷）稀釋2 X IO6倍。 陽0巧1
[0080] 4.取出六孔板，鏡檢確認細胞已長滿，形態良好，符合實驗要求。
[0081] 5.吸去培養液，每孔加入1ml DPBS洗一遍，吸干DPBS ; 陽0間 6.每孔中加7號管樣品各100 y 1，搖勻，置37°C，5%的％培養箱培養1小時；
[0083] 7.吸去病毒上清，加入DPBS洗一遍，吸干DPBS ;
[0084] 8.加入2ml的MEM，37°C，5 %的C〇2培養箱培養48小時； 陽0財 9.固定：取出6孔板，吸去培養液，用DPBS洗一遍，吸干，每孔中加入1ml DPBS(37°C溫浴）和lna-20°C預冷的甲醇，常溫下預固定Imin后，吸去預固定液。再向每孔 加入lna-20°C預冷的甲醇，4°C固定10分鐘，吸去甲醇，再用DPBS (lml/孔）洗一遍，室溫風 干5min，待用。
[0086] 10.加一抗：將孔中細胞W DPBS(37°C溫浴，Iml/孔）潤濕后，甩出，每孔加入 0. 5ml兔抗仙臺病毒抗體，37°C培養1小時；
[0087] 11.加二抗：吸去孔中一抗溶液，W DPBS-0. 1% Triton X-IOO 洗孔 3 次，Iml/ 孔， 每次解育3分鐘。吸出DPBS-0. 1%化iton X-100。每孔加入0. 5ml FITC標記的羊抗兔 IgG, 37°C培養1小時，培養期間用錫錐紙包住避光，； 陽0蝴 12.洗涂：吸去孔中二抗溶液，W DPBS-0. 1 % Triton X-IOO洗孔3次，Iml/孔，每 次解育3分鐘；
[0089] 13.甩去孔中DPBS-0. 1% Triton X-100,每孔加入1ml DPBS，用錫錐紙包住避光。
[0090] 14.顯微鏡計數：在5 X物鏡下分別計數各孔中有巧光的細胞數，每個有巧光的細 胞代表一個CIU，按W下公式計算樣品的CIU濃度： W91]樣品 CIU 濃度=AX10X2Xl〇6(CIU/mU 陽09引其中，A為6個孔中的有巧光的細胞平均數。 陽〇9引 實施例7
[0094] SDS-PAGE 電泳 陽0巧]采用10% SDS-PAGE法進行，加樣量為5. OX IO8CIU, SDS-PAGE電泳后，用考馬斯 亮藍染色，脫色，判斷電泳后是否含有仙臺病毒的7條特征條帶。實驗結果如圖1所示，經 SDS-PAGE電泳后，可觀察到仙臺病毒典型的7條條帶。
【主權項】
1. 一種重組仙臺病毒的純化方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 真空過濾病毒初始液； (2) 親和層析； (3) 超濾； (4) 核酸酶處理； (5) 凝膠過濾層析； (6) 測定病毒滴度及進行SDS-PAGE電泳。2. 權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述親和層析選用磺酸化纖維素進行，低 離子強度的磷酸鹽緩沖液為75mM NaCl溶液，高離子強度的磷酸鹽洗脫液為1M NaCl溶液。3. 權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述超濾中超濾膜包為截留分子量為 500K的超濾膜包。4. 權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述核酸酶為Benzonase。5. 權利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述凝膠過濾層析的過濾柱為Sepharose 4FF 柱。6. 權利要求1所述的純化方法在重組仙臺病毒載體疫苗生產中的應用。
【專利摘要】本發明主要涉及一種仙臺病毒純化方法，適合用于重組仙臺病毒載體疫苗規模化生產，其特征在于，該方法主要包括真空過濾、親和層析、超濾、核酸酶處理和凝膠過濾層析步驟。該方法具有操作簡單、質量穩定、收率高等特點。
【IPC分類】C12R1/93, A61K39/155, A61P31/14, C12N7/02
【公開號】CN105713882
【申請號】CN201410734206
【發明人】張鋒, 唐仁陶, 楊延新, 于崇勛, 王明曉, 李銀貴
【申請人】石藥集團中奇制藥技術（石家莊）有限公司