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用于保存體液的穩定組合物和方法與流程

文檔序號:34656502發布日期:2023-06-30 09:27閱讀:39887來源:國知局
用于保存體液的穩定組合物和方法與流程

本發明屬于用于在環境溫度下保存體液的穩定組合物和方法。


背景技術:

1、尿液是大多數動物新陳代謝的復雜液體副產品,用于各種分析測試。在人類中,尿液主要由水以及有機溶質組成,所述有機溶質包含尿素、肌酸酐、尿酸和痕量的酶、碳水化合物、激素、脂肪酸、色素、粘蛋白和無機離子。甚至來自健康個體的尿液還含有紅細胞、白細胞、尿路上皮細胞、腎細胞、前列腺細胞和細菌。由于細胞和無細胞物質從泌尿生殖器官直接脫落到這種樣本類型中,尿液代表了用于泌尿病理學研究的生物標志物的有價值的來源。來自孕婦的尿液也是胎兒dna的有用的來源(nby?tsui、p?jiang、kck?chow、x?su、tyleung、h?sun、kca?chan、rwk?chiu和ymd?lo(2012).《通過成對末端大規模平行測序對孕婦的尿液中的胎兒dna進行高分辨率大小分析(high?resolution?size?analysis?of?fetaldna?in?the?urine?of?pregnant?women?by?paired-end?massively?parallelsequencing)》.《公共科學圖書館·綜合(plos?one)》7(10):e48319),用于無創產前診斷和預后測試。

2、尿無細胞dna(ucfdna)來源于從泌尿生殖道脫落到尿液中的細胞,或者來源于通過腎小球濾過的循環中的無細胞dna(cfdna)。cfdna在健康個體和患疾病(例如,糖尿病、心血管疾病、器官移植、中風、癲癇、自身免疫性疾病、敗血癥和創傷)人群的各種細胞外體液(包含尿液)中以片段化核酸的形式存在,用作液體活檢的重要工具(r?meddeb、episareva、ar?thierry(2019)《關于分析循環無細胞dna的分析前條件的指南(guidelinesfor?the?preanalytical?conditions?for?analyzing?circulating?cell-free?dna)》.《臨床化學(clin?chem)》65(5):623-633.doi:10.1373/clinchem.2018.298323;cmstewart、pd?kothari、f?mouliere、r?mair、s?somnay、r?benayed、a?zehir、b?weigelt、s-jdawson、me?arcila、mf?berger、dwy?tsui(2018)《無細胞dna對于分子病理學的價值(thevalue?of?cell-free?dna?for?molecular?pathology)》.《病理學雜志(j?pathol)》244(5):616-627.doi:10.1002/path.5048)。ucfdna被認為具有成為用于癌癥篩查、診斷、預后和監測癌癥進展和治療效果的有用且超無創工具的潛力(t?lu和j?li(2017)《尿無細胞dna在癌癥中的臨床應用:當前的見解和充滿希望的未來(clinical?applications?ofurinary?cell-free?dna?in?cancer:current?insights?and?promising?future)》.《美國癌癥研究雜志(am?j?cancer?res)》7(11):2318-2332;s?van?keer、j?pattyn、waa?tjalma、x?van?ostade、m?ieven、p?van?damme、a?vorsters(2017)《首段尿:用于對高風險人類乳頭瘤病毒感染婦女進行鑒別分類的潛在生物標志物來源(first-void?urine:a?potentialbiomarker?source?for?triage?of?high-risk?human?papillomavirus?infectedwomen)》.《歐洲婦產科學和生殖生物學雜志(eur?j?obstetrics&gynecology?andreproductive?biology)》216:1-11)。例如,最近有報道稱,首段尿相較于隨后部分含有顯著更多的高風險人類乳頭瘤病毒(4.8至160倍)和人類dna(a?vorsters、p?van?damme、gclifford(2014)《hpv的尿檢:使用首段尿的根本原因(urine?testing?for?hpv:rationalefor?using?first?void)》.《英國醫學雜志(bmj)》349:g6252)。

3、盡管在各種臨床領域,尤其是腫瘤學和產前診斷領域,對無細胞dna(cfdna)分析的興趣越來越大,但關于樣本處理的研究報道很少,并且沒有可用的分析共識。尿液中天然存在的有核細胞可以將基因組dna釋放到尿液中,導致樣本處理和儲存過程中dna背景增加。此外,酶降解有可能掩蓋真實的cfdna水平,因為考慮到它們的分子量相對較小。因此,尿液標本需要特殊處理,例如在收集后的短時間內(2至4小時)進行處理,收集后冷藏,或使用穩定化合物進行保存。鑒于樣本的收集性質,優選使用保存劑來保持樣本收集后的尿液中的cfdna的原始比例和完整性。

4、ucfdna作為一種無創液體活檢形式具有巨大的潛力。dna可以存在于尿液的細胞部分和無細胞部分,并且用于收集和處理dna的程序將極大地影響生物標志物分析的結果(lk?larsen、ge?lind、p?guldberg、c?dahl(2019)《在尿液中對泌尿系統癌癥的基于dna甲基化的檢測:生物標志物的概述以及對生物標志物設計、dna來源和檢測技術的考慮(dna-methylation-based?detection?of?urological?cancer?in?urine:overview?ofbiomarkers?and?considerations?on?biomarker?design,source?of?dna,and?detectiontechnologies)》.《國際分子科學雜志(int?j?mol?sci)》20,2657)。由于尿液中的細胞和dna在儲存時容易降解(tht?cheng、p?jiang、jcw?tam、x?sun、w-s?lee、scy?yu、jtc?teoh、pkf?chiu、c-f?ng、k-m?chow、c-c?szeto、kca?chan、rwk?chiu、ymd?lo(2017)《全基因組亞硫酸氫鹽測序揭示了尿cfdna的來源和時間依賴性片段化(whole-genome?bisulfitesequencing?reveals?the?origin?and?time-dependent?fragmentation?of?urinarycfdna)》.《臨床生物化學(clin?biochem)》50(9):496-501.doi:10.1016/j.clinbiochem.2017.02.017),當尿液樣本沒有被立即處理時,適當的儲存很重要。人類尿液是核酸水解酶(核酸酶)發揮功能的合適環境。具體而言,dna酶i是尿液中的主要dna水解酶,并且其在尿液中的活性比其在血清中的活性高100倍以上(oe?bryzgunova、pplaktionov(2015)《尿液中的細胞外核酸:來源、結構、診斷潛力(extracellular?nucleicacids?in?urine:sources,structure,diagnostic?potential)》.《自然學報(actanaturae)》第7(3)卷:48-54.doi:10.32607/20758251-2015-7-3-48-54)。ucfdna在體溫下的半衰期為約2.6至5.1小時(tht?cheng等人(2017)同上)。目前,沒有一個登記的癌癥體外診斷(ivd)是純粹基于ucfdna的(wj?locke、d?guanzon、c?ma、yj?liew、kr?duesing、kycfung、jp?ross(2019)《dna甲基化癌癥生物標志物:應用至臨床(dna?methylation?cancerbiomarkers:translation?to?the?clinic)》.《遺傳學前沿(front?genet)》10:1150.doi:10.3389/fgene.2019.01150)。一個主要原因是因為保存ucfdna的工作流程尚未標準化。因此,為了有效且高效地使用任何生物化學和分子遺傳測試,樣本收集過程、樣本運輸、樣本處理和樣本儲存/穩定性都應優化和標準化。

5、在健康個體中,cfdna來源于有核細胞的凋亡(m?stroun、j?lyautey、c?lederrey、a?olson-sand、p?anker(2001)《關于循環dna凋亡和活性dna釋放的可能來源和機制(aboutthe?possible?origin?and?mechanism?of?circulating?dna?apoptosis?and?active?dnarelease)》.《臨床化學學報(clin?chim?acta)》313(1-2):139-142)。在惡性腫瘤中,總cfdna的腫瘤源性部分被稱為循環腫瘤dna(ctdna),可能通過凋亡、壞死和活性分泌的組合而來源于腫瘤細胞(m?stroun等人(2001)同上;s?jahr、h?hentze、s?englisch、d?hardt、fofackelmayer、rd?hesch、r?knippers(2001)《癌癥患者的血漿中的dna片段:其凋亡和壞死細胞來源的定量和證據(dna?fragments?in?the?blood?plasma?of?cancer?patients:quantitations?and?evidence?for?their?origin?from?apoptotic?and?necroticcells)》.《癌癥研究(cancer?res)》61(4):1659-1665;oe?bryzgunova等人(2015)同上)。ctdna含有腫瘤特異性突變、拷貝數的變化和dna甲基化狀態的改變(g?santoni、mbmorelli、c?amantini、n?battelli(2018)《膀胱癌中的尿標志物的最新消息(urinarymarkers?in?bladder?cancer:an?update)》.《腫瘤學前沿(front?oncol)》8:362.doi:10.3389/fonc.2018.00362)。ctdna水平通常隨著腫瘤體積而增加,可以用于預測對靶向免疫療法的反應,監測腫瘤異質性,并揭示不斷擴大的耐藥腫瘤克隆(rj?diefenbach、jhlee、rf?kefford、h?rizos(2018)《用于純化循環游離dna的商品化試劑盒的評價(evaluation?of?commercial?kits?for?purification?of?circulating?free?dna)》.《癌癥遺傳學(cancer?genetics)》228-229:21-27.doi:10.1016/j.cancergen.2018.08.005)。

6、癌癥診斷學已經開始擺脫對用于癌癥檢測、診斷和治療監測的直接腫瘤組織活檢的單一依賴。下一代測序和基因組生物信息學分析帶來了從組織學診斷的微觀水平到癌癥診斷的分子基因組水平的新范式轉變。新型無創癌癥診斷平臺,例如來自體液(即血液、血漿、尿液等)的液體活檢,可用于獲取ctdna或用于測定ctdna的循環腫瘤細胞、蛋白質組學物質、代謝組學物質和外泌體(x?wu、l?zhu和pc?ma.《超越組織的下一代新型無創癌癥分子診斷平臺(next-generation?novel?non-invasive?cancer?molecular?diagnosticsplatforms?beyond?tissues)》.《美國臨床腫瘤學會教育書籍(am?soc?clin?oncol?educbook)》.2018年5月23日;(38):964-977.doi:10.1200/edbk_199767)以及其它分析物的信息。

7、分子生物標志物被廣泛研究,并且可能有助于癌癥患者治療反應的早期檢測、監測和預測(l?cerchietti和a?melnick(2017)《基于dna甲基化的生物標志物(dnamethylation-based?biomarkers)》.《臨床腫瘤學雜志(j?clin?oncol)》35(7):793-795)。這些生物標志物代表了與癌癥發展和進展相關聯的遺傳和表觀遺傳事件。dna超甲基化是表觀遺傳過程的一個實例。檢測如尿液和血液等體液中的超甲基化dna作為腫瘤學生物標志物是令人感興趣的。癌癥護理的一個重要發展是“液體活檢”,它涉及對從原發性或轉移性腫瘤脫落到體液中的腫瘤細胞的遺傳物質的分析。液體活檢通常涉及源于如血液、尿液、唾液和腦脊液等生物流體的cfdna、rna(mirna、lncrna和mrna)、蛋白質、肽、外泌體或細胞的提取和分析(ad?meo、j?bartlett、y?cheng、md?pasic、gm?yousef(2017)《液體活檢:泌尿系統惡性腫瘤向精確醫學邁進的一步(liquid?biopsy:a?step?forward?towardsprecision?medicine?in?urologic?malignancies)》.《癌癥分子學(mol?cancer)》16:80.doi:10.1186/s12943-017-0644-5)。在各種液體活檢樣本中,尿液和唾液容易獲得,不需要專家進行樣本收集,并且能夠通過連續采樣實現疾病的實時監測。

8、mandel和metais于1948年首次觀察到血漿中的無細胞循環dna(p?mandel、pmetais(1948)《人類血漿中的核酸(les?acides?nucleiques?du?plasma?sanguine?chezl'homme)》.《巴黎科學院報告(c?r?acad?sci?paris)》:241-243)。在癌癥患者的血清和血漿中表現出游離dna水平增加(sa?leon、b?shapiro、dm?sklaroff、mj?yaros(1977)《癌癥患者的血清中的游離dna及治療效果(free?dna?in?the?serum?of?cancer?patients?andthe?effect?of?therapy)》.《癌癥研究(cancer?res)》37:646-650;s?jahr等人(2001)同上)。來自jahr等人(2001,同上)的數據與凋亡和壞死細胞是癌癥患者的血漿dna的主要來源的可能性一致。在從癌癥患者的血漿中提取的遺傳物質中發現了腫瘤dna的特性。這些特征包含鏈穩定性降低以及特定癌基因、腫瘤抑制基因和微衛星改變的存在(p?anker、hmulcahy、xq?chen、m?stroun(1999)《癌癥患者的血液(血漿/血清)中的循環腫瘤dna的檢測(detection?of?circulating?tumour?dna?in?the?blood(plasma/serum)of?cancerpatients)》.《癌癥與轉移評論(cancer?and?metastasis?reviews)》18:65-73.doi.https://doi.org/10.1023/a:1006260319913)。在許多不同癌癥中獲得的結果表明,類似于尿液dna,血漿dna可能是開發癌癥診斷、預后和隨訪測試的合適靶標。

9、腎臟疾病的新生物標志物的研究目前是一個緊迫的問題,因為腎臟疾病影響著高達1/10的美國人口(j?coresh、e?selvin、la?stevens、j?manzi、jw?kusek、p?eggers、f?vanlente、as?levey(2007)《美國慢性腎病的患病率(prevalence?of?chronic?kidneydisease?in?the?united?states)》.《美國醫學會雜志(jama)》298(17):2038-2047)。用于細胞間通訊的尿細胞外囊泡(uev)代表了生物標志物發現的理想平臺(kc?miranda、dtbond、m?mckee、j?skog、tg?paunescu、n?da?silva、d?brown、lm?russo(2010)《尿外泌體/微囊泡內的核酸是腎臟疾病的潛在生物標志物(nucleic?acids?within?urinary?exosomes/microvesicles?are?potential?biomarkers?for?renal?disease)》.《國際腎臟病學(kidney?int)》78(2):191-199.doi:10.1038/ki.2010.106)。uev是載有rna和蛋白質的小(20至1,000nm)球形結構,其由健康和異常細胞沿著整個泌尿生殖道不斷釋放(a?gamez-valero、si?lozano-ramos、i?bancu、r?lauzurica-valdemoros、fe?borras(2015)《尿細胞外囊泡作為腎病生物標志物的來源(urinary?extracellular?vesicles?as?source?ofbiomarkers?in?kidney?diseases)》.《免疫學前沿(front?immunol)》6.doi:http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2015.00006)。術語uev是指質膜源性(例如,微囊泡、外泌體樣囊泡、核外顆粒體和逆轉錄病毒樣顆粒)和核內體源性囊泡或外泌體。uev似乎反映了其來源細胞的生理狀況(gamez-valero等人(2015),同上;d?tataruch-weinert、l?musante、okretz、h?holthofer(2016)《用于rna提取的尿細胞外囊泡:無原核生物污染的方案的優化(urinary?extracellular?vesicles?for?rna?extraction:optimization?of?a?protocoldevoid?of?prokaryote?contamination)》.《細胞外囊泡雜志(j?extracellularvesicles)》5:30281–http://dx.doi.org/10.3402/jev.v5.30281)。此外,所分泌的囊泡通過其被稱為“外泌體穿梭rna”的mirna、mrna和trna介導細胞間通訊的特定方面(h?valadi、k?ekstrom、a?bossios、m?sjostrand、jj?lee、lo?lotvall(2007)《外泌體介導的mrna和微小rna轉移是細胞間遺傳交換的一種新機制(exosome-mediated?transfer?of?mrnas?andmicrornas?is?a?novel?mechanism?of?genetic?exchange?between?cells)》.《自然細胞生物學(nature?cell?biology)》9:654-659)。取決于尿液收集方法、uev富集和rna提取方法,在所報告的rna圖譜中觀察到顯著的可變性(d?tataruch-weinert等人(2016),同上)。

10、最近的研究表明,ev可能是及時診斷和監測泌尿生殖系統惡性腫瘤的關鍵。尿液外泌體是ev的一個亞類,是含有蛋白質、mrna和微小rna(mirna)的小囊泡,并且由腎單位和泌尿生殖道所有部分的細胞釋放。前列腺細胞產生的外泌體與前列腺分泌物一起通過前列腺射精管,直接排入尿道并進入尿液中,其在尿液中可以很容易地被檢測到(oebryzgunova、mm?zaripov、te?skvortsova、ea?lekchnov、ae?grigor'eva、iazaporozhchenko、es?morozkin、ei?ryabchikova、yb?yurchenko、ve?voitsitskiy、pplaktionov(2016)《健康個體和前列腺癌患者的尿液中的細胞外囊泡的比較研究(comparative?study?of?extracellular?vesicles?from?the?urine?of?healthyindividuals?and?prostate?cancer?patients)》.《公共科學圖書館·綜合(plos?one)》11(6):e0157566.doi:10.1371/journal.pone.0157566)。nilsson等人(j?nilsson、j?skog、anordstrand、v?baranov、l?mincheva-nilsson、xo?breakefield、a?widmark(2009)《前列腺癌源性尿液外泌體:前列腺癌生物標志物的新方法(prostate?cancer-derived?urineexosomes:a?novel?approach?to?biomarkers?for?prostate?cancer)》.《英國癌癥雜志(br?j?cancer)》100:1603-1607.doi:10.1038/sj.bjc.6605058)能夠在從前列腺癌患者的尿液中分離的外泌體中檢測兩種已知的前列腺癌mrna生物標志物pca3和tmprss2-erg,這表明了ev用于前列腺癌診斷的潛力。這項研究和其它研究支持了從尿液中分離的外泌體中的rna作為前列腺癌的診斷標志物的用途,并提供了一種替代的、敏感的且獨特的新型癌癥生物標志物篩選。

11、對于泌尿系統癌癥,在許多情況下,尿液是優選的液體活檢來源,因為它含有脫落的腫瘤細胞和無細胞腫瘤dna,并且可以容易地、無創地且重復地獲得(lk?larsen、gelind、p?guldberg、c?dahl(2019)《在尿液中對泌尿系統癌癥的基于dna甲基化的檢測:生物標志物的概述以及對生物標志物設計、dna來源和檢測技術的考慮(dna-methylation-based?detection?of?urological?cancer?in?urine:overview?of?biomarkers?andconsiderations?on?biomarker?design,source?of?dna,and?detectiontechnologies)》.《國際分子科學雜志(int?j?mol?sci)》20,2657)。與血液相比,尿液被認為是早期檢測或監測泌尿生殖道癌癥復發的更敏感的替代方案(sy?lin、ja?linehan、tgwilson、dsb?hoon(2017)《前列腺癌、膀胱癌和腎癌的尿無細胞核酸生物標志物的新興應用(emerging?utility?of?urinary?cell-free?nucleic?acid?biomarkers?for?prostate,bladder,and?renal?cancers)》.《歐洲泌尿學焦點(eur?urol?focus)》3(2-3):265-272.doi:10.1016/j.euf.2017.03.009)。此外,不需要有資格的人員來獲得樣本,樣本允許在家中收集。然而,尿超甲基化dna在臨床實踐中的應用受到保存尿核酸的挑戰的限制。因此,尿液需要以確保核酸保存的方式儲存和運輸,以允許下游分析(j?bosschieter、sbach、iv?bijnsdorp、li?segerink、wf?rurup、ap?van?splunter、i?bahce、pw?novianti、gkazemier、rja?van?moorselaar、rdm?steenbergen、ja?nieuwenhuijzen(2018)《dna甲基化分析前的尿液收集和儲存方案(a?protocol?for?urine?collection?and?storage?priorto?dna?methylation?analysis)》.《公共科學圖書館·綜合(plos?one)》13(8):e0200906)。

12、需要用于在環境溫度下保存如尿液等體液的穩定組合物。

13、提供此背景信息是為了揭示申請人認為可能與本發明相關的信息。絕非旨在承認,或不應理解為前述信息中的任何信息構成針對本發明的現有技術。


技術實現思路

1、盡管存在多種用于如體液等生物樣本中的核酸穩定的商業產品,但這些產品主要用于穩定dna或rna,而不是同時穩定兩者。還沒有報道過有效穩定如尿液等體液中的細胞和無細胞核酸的組合物。提供一種收集裝置和位于其中的組合物將是有益的,所述收集裝置和組合物防止完整細菌和人類細胞的裂解,從而阻止不需要的核酸釋放到生物樣本中,否則這將污染體內尿信號。所述組合物將另外防止膜囊泡的釋放。這是至關重要的,因為無細胞rna被包裹在膜囊泡中,包含微囊泡和細胞外囊泡(包含但不限于外泌體)。優選地,所述組合物將在室溫下保持如尿液等體液中的無細胞和細胞核酸(dna和rna)的穩定性和完整性至少7天,從而防止基于化學和酶的降解。本技術公開了這種組合物。

2、一方面,提供了一種用于在環境溫度下保存體液的水性穩定組合物,所述組合物包括:選自單糖、二糖或其組合的糖;緩沖劑;c1-c6烷醇;硼酸、硼酸鹽或其組合;和螯合劑;其中所述組合物具有4.5至5.2的ph。

3、另一方面,提供了一種用于保存體液的方法,所述方法包括:a)獲得所述體液的樣本;b)使所述體液與水性穩定組合物接觸以形成混合物;所述組合物包括:選自單糖、二糖或其組合的糖;緩沖劑;c1-c6烷醇;硼酸、硼酸鹽或其組合;和螯合劑;其中所述組合物具有4.5至5.2的ph;c)混合(b)的所述混合物以形成均勻混合物;和d)在環境溫度下儲存所述均勻混合物。

4、又一方面,提供了一種水性組合物,所述組合物包括:選自單糖、二糖或其組合的糖;緩沖劑;c1-c6烷醇;硼酸、硼酸鹽或其組合;螯合劑;和體液。

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