用于保存體液的穩定組合物和方法與流程

clifford(2014)《hpv的尿檢：使用首段尿的根本原因(urine testing for hpv:rationale for using first void)》.《英國醫學雜志(bmj)》349:g6252)。
4.盡管在各種臨床領域，尤其是腫瘤學和產前診斷領域，對無細胞dna(cfdna)分析的興趣越來越大，但關于樣本處理的研究報道很少，并且沒有可用的分析共識。尿液中天然存在的有核細胞可以將基因組dna釋放到尿液中，導致樣本處理和儲存過程中dna背景增加。此外，酶降解有可能掩蓋真實的cfdna水平，因為考慮到它們的分子量相對較小。因此，尿液標本需要特殊處理，例如在收集后的短時間內(2至4小時)進行處理，收集后冷藏，或使用穩定化合物進行保存。鑒于樣本的收集性質，優選使用保存劑來保持樣本收集后的尿液中的cfdna的原始比例和完整性。
5.ucfdna作為一種無創液體活檢形式具有巨大的潛力。dna可以存在于尿液的細胞部分和無細胞部分，并且用于收集和處理dna的程序將極大地影響生物標志物分析的結果(lk larsen、ge lind、p guldberg、c dahl(2019)《在尿液中對泌尿系統癌癥的基于dna甲基化的檢測：生物標志物的概述以及對生物標志物設計、dna來源和檢測技術的考慮(dna-methylation-based detection of urological cancer in urine:overview of biomarkers and considerations on biomarker design,source of dna,and detection technologies)》.《國際分子科學雜志(int j mol sci)》20,2657)。由于尿液中的細胞和dna在儲存時容易降解(tht cheng、p jiang、jcw tam、x sun、w-s lee、scy yu、jtc teoh、pkf chiu、c-f ng、k-m chow、c-c szeto、kca chan、rwk chiu、ymd lo(2017)《全基因組亞硫酸氫鹽測序揭示了尿cfdna的來源和時間依賴性片段化(whole-genome bisulfite sequencing reveals the origin and time-dependent fragmentation of urinary cfdna)》.《臨床生物化學(clin biochem)》50(9):496-501.doi:10.1016/j.clinbiochem.2017.02.017)，當尿液樣本沒有被立即處理時，適當的儲存很重要。人類尿液是核酸水解酶(核酸酶)發揮功能的合適環境。具體而言，dna酶i是尿液中的主要dna水解酶，并且其在尿液中的活性比其在血清中的活性高100倍以上(oe bryzgunova、pp laktionov(2015)《尿液中的細胞外核酸：來源、結構、診斷潛力(extracellular nucleic acids in urine:sources,structure,diagnostic potential)》.《自然學報(acta naturae)》第7(3)卷:48-54.doi:10.32607/20758251-2015-7-3-48-54)。ucfdna在體溫下的半衰期為約2.6至5.1小時(tht cheng等人(2017)同上)。目前，沒有一個登記的癌癥體外診斷(ivd)是純粹基于ucfdna的(wj locke、d guanzon、c ma、yj liew、kr duesing、kyc fung、jp ross(2019)《dna甲基化癌癥生物標志物：應用至臨床(dna methylation cancer biomarkers:translation to the clinic)》.《遺傳學前沿(front genet)》10:1150.doi:10.3389/fgene.2019.01150)。一個主要原因是因為保存ucfdna的工作流程尚未標準化。因此，為了有效且高效地使用任何生物化學和分子遺傳測試，樣本收集過程、樣本運輸、樣本處理和樣本儲存/穩定性都應優化和標準化。
6.在健康個體中，cfdna來源于有核細胞的凋亡(m stroun、j lyautey、c lederrey、a olson-sand、p anker(2001)《關于循環dna凋亡和活性dna釋放的可能來源和機制(about the possible origin and mechanism of circulating dna apoptosis and active dna release)》.《臨床化學學報(clin chim acta)》313(1-2):139-142)。在惡性腫瘤中，總cfdna的腫瘤源性部分被稱為循環腫瘤dna(ctdna)，可能通過凋亡、壞死和活性分泌的組合
而來源于腫瘤細胞(m stroun等人(2001)同上；s jahr、h hentze、s englisch、d hardt、fo fackelmayer、rd hesch、r knippers(2001)《癌癥患者的血漿中的dna片段：其凋亡和壞死細胞來源的定量和證據(dna fragments in the blood plasma of cancer patients:quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells)》.《癌癥研究(cancer res)》61(4):1659-1665；oe bryzgunova等人(2015)同上)。ctdna含有腫瘤特異性突變、拷貝數的變化和dna甲基化狀態的改變(g santoni、mb morelli、c amantini、n battelli(2018)《膀胱癌中的尿標志物的最新消息(urinary markers in bladder cancer:an update)》.《腫瘤學前沿(front oncol)》8:362.doi:10.3389/fonc.2018.00362)。ctdna水平通常隨著腫瘤體積而增加，可以用于預測對靶向免疫療法的反應，監測腫瘤異質性，并揭示不斷擴大的耐藥腫瘤克隆(rj diefenbach、jh lee、rf kefford、h rizos(2018)《用于純化循環游離dna的商品化試劑盒的評價(evaluation of commercial kits for purification of circulating free dna)》.《癌癥遺傳學(cancer genetics)》228-229:21-27.doi:10.1016/j.cancergen.2018.08.005)。
7.癌癥診斷學已經開始擺脫對用于癌癥檢測、診斷和治療監測的直接腫瘤組織活檢的單一依賴。下一代測序和基因組生物信息學分析帶來了從組織學診斷的微觀水平到癌癥診斷的分子基因組水平的新范式轉變。新型無創癌癥診斷平臺，例如來自體液(即血液、血漿、尿液等)的液體活檢，可用于獲取ctdna或用于測定ctdna的循環腫瘤細胞、蛋白質組學物質、代謝組學物質和外泌體(x wu、l zhu和pc ma.《超越組織的下一代新型無創癌癥分子診斷平臺(next-generation novel non-invasive cancer molecular diagnostics platforms beyond tissues)》.《美國臨床腫瘤學會教育書籍(am soc clin oncol educ book)》.2018年5月23日；(38):964-977.doi:10.1200/edbk_199767)以及其它分析物的信息。
8.分子生物標志物被廣泛研究，并且可能有助于癌癥患者治療反應的早期檢測、監測和預測(l cerchietti和a melnick(2017)《基于dna甲基化的生物標志物(dna methylation-based biomarkers)》.《臨床腫瘤學雜志(j clin oncol)》35(7):793-795)。這些生物標志物代表了與癌癥發展和進展相關聯的遺傳和表觀遺傳事件。dna超甲基化是表觀遺傳過程的一個實例。檢測如尿液和血液等體液中的超甲基化dna作為腫瘤學生物標志物是令人感興趣的。癌癥護理的一個重要發展是“液體活檢”，它涉及對從原發性或轉移性腫瘤脫落到體液中的腫瘤細胞的遺傳物質的分析。液體活檢通常涉及源于如血液、尿液、唾液和腦脊液等生物流體的cfdna、rna(mirna、lncrna和mrna)、蛋白質、肽、外泌體或細胞的提取和分析(ad meo、j bartlett、y cheng、md pasic、gm yousef(2017)《液體活檢：泌尿系統惡性腫瘤向精確醫學邁進的一步(liquid biopsy:a step forward towards precision medicine in urologic malignancies)》.《癌癥分子學(mol cancer)》16:80.doi:10.1186/s12943-017-0644-5)。在各種液體活檢樣本中，尿液和唾液容易獲得，不需要專家進行樣本收集，并且能夠通過連續采樣實現疾病的實時監測。
9.mandel和metais于1948年首次觀察到血漿中的無細胞循環dna(p mandel、pmetais(1948)《人類血漿中的核酸(les acides nucleiques du plasma sanguine chez l'homme)》.《巴黎科學院報告(c r acad sci paris)》:241-243)。在癌癥患者的血清和血漿中表現出游離dna水平增加(sa leon、b shapiro、dm sklaroff、mj yaros(1977)《癌癥患
者的血清中的游離dna及治療效果(free dna in the serum of cancer patients and the effect of therapy)》.《癌癥研究(cancer res)》37:646-650；s jahr等人(2001)同上)。來自jahr等人(2001，同上)的數據與凋亡和壞死細胞是癌癥患者的血漿dna的主要來源的可能性一致。在從癌癥患者的血漿中提取的遺傳物質中發現了腫瘤dna的特性。這些特征包含鏈穩定性降低以及特定癌基因、腫瘤抑制基因和微衛星改變的存在(p anker、h mulcahy、xq chen、m stroun(1999)《癌癥患者的血液(血漿/血清)中的循環腫瘤dna的檢測(detection of circulating tumour dna in the blood(plasma/serum)of cancer patients)》.《癌癥與轉移評論(cancer and metastasis reviews)》18:65-73.doi.https://doi.org/10.1023/a:1006260319913)。在許多不同癌癥中獲得的結果表明，類似于尿液dna，血漿dna可能是開發癌癥診斷、預后和隨訪測試的合適靶標。
10.腎臟疾病的新生物標志物的研究目前是一個緊迫的問題，因為腎臟疾病影響著高達1/10的美國人口(j coresh、e selvin、la stevens、j manzi、jw kusek、p eggers、f van lente、as levey(2007)《美國慢性腎病的患病率(prevalence of chronic kidney disease in the united states)》.《美國醫學會雜志(jama)》298(17):2038-2047)。用于細胞間通訊的尿細胞外囊泡(uev)代表了生物標志物發現的理想平臺(kc miranda、dt bond、m mckee、j skog、tg paunescu、n da silva、d brown、lm russo(2010)《尿外泌體/微囊泡內的核酸是腎臟疾病的潛在生物標志物(nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease)》.《國際腎臟病學(kidney int)》78(2):191-199.doi:10.1038/ki.2010.106)。uev是載有rna和蛋白質的小(20至1,000nm)球形結構，其由健康和異常細胞沿著整個泌尿生殖道不斷釋放(a gamez-valero、si lozano-ramos、i bancu、r lauzurica-valdemoros、fe borras(2015)《尿細胞外囊泡作為腎病生物標志物的來源(urinary extracellular vesicles as source of biomarkers in kidney diseases)》.《免疫學前沿(front immunol)》6.doi:http://dx.doi.org/10.3389/fimmu.2015.00006)。術語uev是指質膜源性(例如，微囊泡、外泌體樣囊泡、核外顆粒體和逆轉錄病毒樣顆粒)和核內體源性囊泡或外泌體。uev似乎反映了其來源細胞的生理狀況(gamez-valero等人(2015),同上；d tataruch-weinert、l musante、o kretz、h holthofer(2016)《用于rna提取的尿細胞外囊泡：無原核生物污染的方案的優化(urinary extracellular vesicles for rna extraction:optimization of a protocol devoid of prokaryote contamination)》.《細胞外囊泡雜志(j extracellular vesicles)》5:30281
–
http://dx.doi.org/10.3402/jev.v5.30281)。此外，所分泌的囊泡通過其被稱為“外泌體穿梭rna”的mirna、mrna和trna介導細胞間通訊的特定方面(h valadi、k ekstrom、a bossios、m sjostrand、jj lee、lo lotvall(2007)《外泌體介導的mrna和微小rna轉移是細胞間遺傳交換的一種新機制(exosome-mediated transfer of mrnas and micrornas is a novel mechanism of genetic exchange between cells)》.《自然細胞生物學(nature cell biology)》9:654-659)。取決于尿液收集方法、uev富集和rna提取方法，在所報告的rna圖譜中觀察到顯著的可變性(d tataruch-weinert等人(2016),同上)。
11.最近的研究表明，ev可能是及時診斷和監測泌尿生殖系統惡性腫瘤的關鍵。尿液外泌體是ev的一個亞類，是含有蛋白質、mrna和微小rna(mirna)的小囊泡，并且由腎單位和泌尿生殖道所有部分的細胞釋放。前列腺細胞產生的外泌體與前列腺分泌物一起通過前列
腺射精管，直接排入尿道并進入尿液中，其在尿液中可以很容易地被檢測到(oe bryzgunova、mm zaripov、te skvortsova、ea lekchnov、ae grigor'eva、ia zaporozhchenko、es morozkin、ei ryabchikova、yb yurchenko、ve voitsitskiy、pp laktionov(2016)《健康個體和前列腺癌患者的尿液中的細胞外囊泡的比較研究(comparative study of extracellular vesicles from the urine of healthy individuals and prostate cancer patients)》.《公共科學圖書館
·
綜合(plos one)》11(6):e0157566.doi:10.1371/journal.pone.0157566)。nilsson等人(j nilsson、j skog、a nordstrand、v baranov、l mincheva-nilsson、xo breakefield、a widmark(2009)《前列腺癌源性尿液外泌體：前列腺癌生物標志物的新方法(prostate cancer-derived urine exosomes:a novel approach to biomarkers for prostate cancer)》.《英國癌癥雜志(br j cancer)》100:1603-1607.doi:10.1038/sj.bjc.6605058)能夠在從前列腺癌患者的尿液中分離的外泌體中檢測兩種已知的前列腺癌mrna生物標志物pca3和tmprss2-erg，這表明了ev用于前列腺癌診斷的潛力。這項研究和其它研究支持了從尿液中分離的外泌體中的rna作為前列腺癌的診斷標志物的用途，并提供了一種替代的、敏感的且獨特的新型癌癥生物標志物篩選。
12.對于泌尿系統癌癥，在許多情況下，尿液是優選的液體活檢來源，因為它含有脫落的腫瘤細胞和無細胞腫瘤dna，并且可以容易地、無創地且重復地獲得(lk larsen、ge lind、p guldberg、c dahl(2019)《在尿液中對泌尿系統癌癥的基于dna甲基化的檢測：生物標志物的概述以及對生物標志物設計、dna來源和檢測技術的考慮(dna-methylation-based detection of urological cancer in urine:overview of biomarkers and considerations on biomarker design,source of dna,and detection technologies)》.《國際分子科學雜志(int j mol sci)》20,2657)。與血液相比，尿液被認為是早期檢測或監測泌尿生殖道癌癥復發的更敏感的替代方案(sy lin、ja linehan、tg wilson、dsb hoon(2017)《前列腺癌、膀胱癌和腎癌的尿無細胞核酸生物標志物的新興應用(emerging utility of urinary cell-free nucleic acid biomarkers for prostate,bladder,and renal cancers)》.《歐洲泌尿學焦點(eur urol focus)》3(2-3):265-272.doi:10.1016/j.euf.2017.03.009)。此外，不需要有資格的人員來獲得樣本，樣本允許在家中收集。然而，尿超甲基化dna在臨床實踐中的應用受到保存尿核酸的挑戰的限制。因此，尿液需要以確保核酸保存的方式儲存和運輸，以允許下游分析(j bosschieter、s bach、iv bijnsdorp、li segerink、wf rurup、ap van splunter、i bahce、pw novianti、g kazemier、rja van moorselaar、rdm steenbergen、ja nieuwenhuijzen(2018)《dna甲基化分析前的尿液收集和儲存方案(a protocol for urine collection and storage prior to dna methylation analysis)》.《公共科學圖書館
·
綜合(plos one)》13(8):e0200906)。
13.需要用于在環境溫度下保存如尿液等體液的穩定組合物。
14.提供此背景信息是為了揭示申請人認為可能與本發明相關的信息。絕非旨在承認，或不應理解為前述信息中的任何信息構成針對本發明的現有技術。


技術實現要素：

15.盡管存在多種用于如體液等生物樣本中的核酸穩定的商業產品，但這些產品主要用于穩定dna或rna，而不是同時穩定兩者。還沒有報道過有效穩定如尿液等體液中的細胞和無細胞核酸的組合物。提供一種收集裝置和位于其中的組合物將是有益的，所述收集裝置和組合物防止完整細菌和人類細胞的裂解，從而阻止不需要的核酸釋放到生物樣本中，否則這將污染體內尿信號。所述組合物將另外防止膜囊泡的釋放。這是至關重要的，因為無細胞rna被包裹在膜囊泡中，包含微囊泡和細胞外囊泡(包含但不限于外泌體)。優選地，所述組合物將在室溫下保持如尿液等體液中的無細胞和細胞核酸(dna和rna)的穩定性和完整性至少7天，從而防止基于化學和酶的降解。本技術公開了這種組合物。
16.一方面，提供了一種用于在環境溫度下保存體液的水性穩定組合物，所述組合物包括：選自單糖、二糖或其組合的糖；緩沖劑；c
1-c6烷醇；硼酸、硼酸鹽或其組合；和螯合劑；其中所述組合物具有4.5至5.2的ph。
17.另一方面，提供了一種用于保存體液的方法，所述方法包括：a)獲得所述體液的樣本；b)使所述體液與水性穩定組合物接觸以形成混合物；所述組合物包括：選自單糖、二糖或其組合的糖；緩沖劑；c
1-c6烷醇；硼酸、硼酸鹽或其組合；和螯合劑；其中所述組合物具有4.5至5.2的ph；c)混合(b)的所述混合物以形成均勻混合物；和d)在環境溫度下儲存所述均勻混合物。
18.又一方面，提供了一種水性組合物，所述組合物包括：選自單糖、二糖或其組合的糖；緩沖劑；c
1-c6烷醇；硼酸、硼酸鹽或其組合；螯合劑；和體液。
附圖說明
19.為了更好地理解本發明，包含得到最終產品的發展進程，將參考結合附圖使用的以下描述，其中：
20.圖1是示出了來自女性和男性供體的尿無細胞dna(ucfdna)的圖表，其示出了尿液樣本中的ucfdna的量具有樣本和性別依賴性。
21.圖2a是示出了由于細菌生長，未經穩定的晨尿首段(fmfv)尿液樣本的濁度增加的圖表(如圖2b進一步證明)。
22.圖2b是示出了δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]通過細菌16s和β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在rt(室溫)下7天后的在未經穩定的尿液樣本中的細菌和人類無細胞dna(cfdna)含量的定量。
[0023]
圖2c和2d示出了安捷倫(agilent)4200tapestation分析的結果，其示出了在室溫下7天后人類無細胞dna含量的大幅下降。
[0024]
圖3a、3b和3c是以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]分別示出(i)穩定性和(ii)中性的圖表，所述穩定性和中性通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0025]
圖4a和4b是示出了δc
t
[c
t(t)-c
t(t0 na)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t)-c
t(t0 na)
]通過β-珠
蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在室溫下儲存7天后的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t)
表示第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 na)
表示第0天的未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0026]
圖5a分別以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出了(i)穩定性和(ii)中性，所述穩定性和中性通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。圖5b示出了這些未經保存處理的和含有化學物質f(chem f)的尿液樣本的代表性tapestation圖譜分析，其示出了cfdna在未經保存處理的樣本中降解，并且在本技術的水性穩定組合物中穩定。圖5c、5d和5e是分別以δc
t
[c
t(t)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出(i)穩定性和(ii)中性的圖表，所述穩定性和中性通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7或14天后的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t)
分別表示第0天和第7天或第14天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0027]
圖6(i)a和b是示出了δc
t
[c
t(t)-c
t(t0na)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t)-c
t(t0na)
]通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的添加前列腺癌細胞(s)的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t)
表示第0天或第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 na)
表示第0天的未經保存處理的加標標本(na)的qpcr循環閾值。圖6(i)c示出了未經保存處理的和含有化學物質f(chem f)的尿液樣本的代表性tapestation圖譜分析。圖6(ii)a是示出了δc
t
[c
t(t)-c
t(t0na)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t)-c
t(t0na)
]通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的添加前列腺癌細胞(s)的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t)
表示第0天或第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 na)
表示第0天的未經保存處理的加標標本(na)的qpcr循環閾值。圖6(ii)b是示出了使用ddpcr測定確定的這些樣本中的一些樣本的每單位體積的β-珠蛋白基因的拷貝數的圖表。總的來說，圖6(i)和(ii)表明，本技術的水性穩定組合物在室溫下以濃度依賴方式保持前列腺癌細胞的完整性至少7天。
[0028]
圖7是示出了δc
t
[c
t(t)-c
t(t0 na)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t)-c
t(t0 na)
]通過β-珠蛋白qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物以及購自施特雷克(streck)的市售組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的添加有核白血細胞(s)的尿液樣本中的人類cfdna含量的定量。c
t(t)
表示第0天或第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 na)
表示第0天的未經保存處理的加標標本(na)的qpcr循環閾值。
[0029]
圖8a示出了hpaii和mspi限制性核酸內切酶消化圖譜，其使用cpg甲基轉移酶證實了體外質粒dna甲基化。圖8b和8c示出了甲基化質粒的pcr擴增的tapestation結果，表明本組合物中的dna甲基化在rt下保持7天。
[0030]
圖9a和9b是示出了δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]的圖表，所述δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]通過氨芐青霉素抗性基因(ampr)和細菌16s qpcr測定確定，所述測定用于在室溫下儲存7天后的添加
純化hpv16質粒dna的未經保存處理的和含有化學物質f(chem f)的尿液樣本中的hpv質粒dna和細菌dna含量的相應定量。c
t(t7)
表示第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0)
表示第0天的qpcr循環閾值。
[0031]
圖10a分別以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出了(i)穩定性和(ii)中性，所述穩定性和中性通過β-肌動蛋白rt-qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的人類ev rna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。圖10b示出了第0天和第7天的來自未經保存處理的和含有化學物質f(chem f)的尿液標本的細胞外囊泡(ev)rna的代表性電泳圖跡線。圖10c和10d分別以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出了(i)穩定性和(ii)中性，所述穩定性和中性通過β-肌動蛋白rt-qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的人類ev rna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0032]
圖11是分別以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出了(i)穩定性和(ii)中性的圖表，所述穩定性和中性通過β-肌動蛋白rt-qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的人類無細胞rna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0033]
圖12a和12b是分別以δc
t
[c
t(t7)-c
t(t0)
]和δc
t
[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]示出了(i)穩定性和(ii)中性的圖表，所述穩定性和中性通過β-肌動蛋白rt-qpcr測定確定，所述測定用于在各種條件下(包含與本技術的水性穩定組合物混合)在第0天以及在rt下儲存7天后的尿液樣本中的細胞rna含量的定量。c
t(t0)
和c
t(t7)
分別表示第0天和第7天的qpcr循環閾值。c
t(t0 chem)
和c
t(t0 na)
分別表示第0天的含化學物質的尿液標本和未經保存處理的標本(na)的qpcr循環閾值。
[0034]
圖13a示出了在與本技術的水性穩定組合物混合的未經保存處理的(na)和含有化學物質f(chem f)的尿液標本中的第0天和第7天提取的細胞dna的tapestation圖譜。圖13b示出了pcr擴增的gapdh產物的tapestation圖譜。圖13c示出了通過細菌16s qpcr測定確定的細菌dna含量％。
[0035]
圖14示出了在與本技術的水性穩定組合物混合的未經保存處理的(te)和含有化學物質f的唾液標本中的第0天和第7天提取的cfdna的tapestation圖譜。te代表1x tris-edta緩沖液。
具體實施方式
[0036]
定義
[0037]
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域中的普通技術人員通常所理解相同的含義。
[0038]
如本說明書和權利要求書中所使用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式“一個/一種(a/an)”和“所述”包含多個提及物。
[0039]
如本文使用，術語“包括”將被理解為意指下面的列表是非窮舉的，并且可以包含或不包含任何其它合適的項目，例如一個或多個另外的適當特征、組分、成分和/或元素。
[0040]
如本文使用，例如“基本上”、“約”和“大約”的程度術語意指被修飾術語的不顯著改變最終結果的合理偏差量。這些程度術語應被解釋為包含被修飾術語的至少
±
10％的偏差，如果這種偏差不會否定它所修飾的詞的含義。
[0041]
如本文使用，術語“體液”將被理解為意指來自人類或動物的天然存在的流體，包含但不限于尿液、唾液、痰、血清、血漿、血液、咽、鼻/鼻咽和竇分泌物、粘液、胃液、胰液、骨髓穿刺液、腦脊液、糞便、精液、哺乳或月經產物、宮頸分泌物、陰道液、眼淚或淋巴液。在一個實施例中，體液選自尿液或唾液。在另一個實施例中，體液是尿液。
[0042]
如本文使用，術語“環境溫度”是指體液(例如，尿液樣本)和本文所述的水性穩定組合物的混合物從收集時起、在運輸過程中(可能涉及相對極端的溫度，但通常時間較短(例如，《5天))以及在分析前的長期儲存過程中可能遇到的溫度的范圍。在一個實施例中，環境溫度為約-20℃至約50℃。在另一個實施例中，環境溫度為室溫(rt)，其范圍為約15℃至約25℃。
[0043]
如本文使用，術語“單糖”將被理解為意指不能通過水解分解成更簡單的糖的糖，被分類為醛糖或酮糖，并且每個分子含有一個或多個羥基。在一個實施例中，單糖選自果糖、葡萄糖、甘露糖或半乳糖。在另一個實施例中，單糖是果糖、葡萄糖或其組合。
[0044]
如本文使用，術語“二糖”將被理解為意指其中兩個單糖單元通過糖苷鍵連接的化合物。在一個實施例中，二糖選自蔗糖、海藻糖和乳糖。在另一個實施例中，二糖是蔗糖。
[0045]
已經發現，根據本技術的包括二糖的組合物可能更難制備，因為這種溶液可能具有非常高的粘度，這可能會由于混合困難而導致不適當的組分混合和/或向標本(即體液)中的加入。總的來說，由于樣本的可加工性，對于本技術的組合物和方法，單糖比二糖更優選。
[0046]
如本文使用，術語“螯合劑(chelator/chelating agent)”將被理解為意指將與某些金屬離子(例如，ca
2+
和mg
2+
)形成可溶的、穩定的絡合物的化學物質，其螯合了這些離子，使得它們不能正常地與其它組分反應，例如脫氧核糖核酸酶(dna酶)或核酸內切酶(例如，i型、ii型和iii型限制性核酸內切酶)和核酸外切酶(例如，3'至5'核酸外切酶)、在各種體液樣本中大量存在的酶。在本組合物中，螯合劑參與抑制生物樣本中的dna酶和微生物生長。螯合劑可以是例如乙二醇四乙酸(egta)、(2-羥乙基)乙二胺三乙酸(hedta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、次氮基三乙酸(nta)、乙二胺三乙酸(edta)、1,2-環己二胺四乙酸(cdta)、n,n-雙(羧甲基)甘氨酸、三乙烯四胺(teta)、四氮雜環十二烷四乙酸(dota)、去鐵胺(desferioximine)、無水檸檬酸鹽、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣、檸檬酸銨、檸檬酸氫銨、檸檬酸、檸檬酸二銨、檸檬酸鐵銨和檸檬酸鋰。這些螯合劑可以單獨使用或兩種或多種組合使用。
[0047]
如本文使用，術語“c
1-c6烷醇”將被理解為意指直鏈或支鏈的，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、正丁醇、戊醇、己醇或其任何組合。在本組合物的一個實施例中，優選的醇是乙醇。
[0048]
在一個實施例中，提供了一種用于在環境溫度下保存體液的水性穩定組合物，所
述組合物包括：選自單糖、二糖或其組合的糖；緩沖劑；c
1-c6烷醇；硼酸、硼酸鹽或其組合；和螯合劑；其中所述組合物具有4.5至5.2的ph。
[0049]
在一個實施例中，所述水性組合物包括硼酸；硼酸鹽，諸如例如硼酸二氫鹽、硼酸氫鹽、二硼酸鹽、三硼酸鹽、四硼酸鹽、偏硼酸鹽、羥基硼酸鹽、硼酸鹽；或其組合。在另一個實施例中，所述水性組合物包括硼酸、硼酸鈉或其組合。在又一個實施例中，所述水性組合物包括硼酸。在一個實施例中，所述硼酸、所述硼酸鹽或所述其組合以約0.5％至約5％(wt/vol)；或約1％至約3％(wt/vol)；或約2％至約2.5％(wt/vol)、或約2.2％(wt/vol)的量存在于所述水性穩定組合物中。
[0050]
在一個實施例中，所述糖是單糖，諸如例如果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或其組合。在另一個實施例中，所述單糖是果糖、葡萄糖或其組合。在另一個實施例中，所述糖是二糖，諸如例如海藻糖、乳糖或蔗糖或其組合。在另一個實施例中，所述二糖是蔗糖。在一個實施例中，所述糖以約5％至約45％(wt/vol)、約5％至約40％(wt/vol)、或約10％至約30％(wt/vol)、或約18％至約22％(wt/vol)、或約20％(wt/vol)的量存在于所述水性穩定組合物中。
[0051]
通常，可以使用一種或多種合適的緩沖劑將本水性穩定組合物的ph保持在期望范圍內。根據一個實施例，所述組合物包括一種、兩種或更多種緩沖劑(非限制性實例是乙酸鹽緩沖液和檸檬酸鹽緩沖液，例如乙酸鈉、乙酸鉀、乙酸銨、檸檬酸鈉和檸檬酸銨)，其在25℃下的對數酸離解常數pka值為3至6.5，以將ph保持在4.5至5.2的優選范圍內。在一個實施例中，所述緩沖劑是乙酸鈉。
[0052]
酸離解常數ka是溶液中的酸強度的定量度量。ka值越大，溶液中分子的離解越多，因此酸越強。由于ka值跨越了許多數量級，所以在實踐中更常用酸離解常數的對數量度pka。pka值越大，在任何給定ph值下的離解程度越小，即酸越弱。在活生物體中，酸堿穩態和酶動力學取決于細胞內和體內的多種酸和堿的pka值。在化學中，pka值的知識對于制備緩沖溶液來說是必要的，也是定量理解酸或堿與金屬離子之間形成絡合物的相互作用的先決條件。本領域技術人員將理解，給定化合物/緩沖液只有當其濃度足夠時，并且當溶液的ph接近其pka(在約一個ph單位內)時，才能緩沖溶液的ph。在一個實施例中，本組合物的ph在4.5至5.2的范圍內。在一個優選實施例中，所述組合物的ph為約5.0。例如，所述水性穩定組合物中的緩沖劑的量可以為約150mm至約1.75m、或約150mm至約1.5m、或約500mm至約1.2m、或約0.7m至約0.8m、或約0.75m。
[0053]
在一個實施例中，所述水性穩定組合物中的所述c
1-c6烷醇選自甲醇或乙醇。在另一個實施例中，所述c
1-c6烷醇是乙醇。在又一個實施例中，所述c
1-c6烷醇以約5％至約50％(vol/vol)、或約10％至約30％(vol/vol)、或約20％至約25％(vol/vol)、或約23％(vol/vol)的量存在于所述水性穩定組合物中。
[0054]
乙醇導致蛋白質脫水或水活性降低，隨后是蛋白質之間的靜電吸引、聚集和不溶。盡管不希望受理論束縛，但本發明人相信，在所使用的百分比下，乙醇在本組合物中沒有或幾乎沒有固定性；相反，它對整體穩定性很重要，并且增強了本組合物中可能包含的其它化學化合物的功能。此外，對于易燃液體的裝運/運輸，理想的是將如乙醇等有機溶劑在溶液中保持為低于24體積％，以免違反危險貨物運輸(tdg)條例(聯合國(un)編號1170)；否則，含》24％的溶液將被歸類為3類(易燃液體)，強制需要特殊包裝，并且運輸復雜性和成本也
會增加。因此，包括約23％(vol/vol)或更低濃度的水性穩定組合物是特別有利的。
[0055]
在另一個實施例中，所述水性穩定組合物中的所述螯合劑選自例如乙二胺三乙酸(edta)、1,2-環己二胺四乙酸(cdta)、二乙烯三胺五乙酸(dtpa)、四氮雜環十二烷四乙酸(dota)、四氮雜環十四烷四乙酸(teta)、去鐵胺或其螯合劑類似物。在另一個實施例中，所述螯合劑是cdta。在另一個實施例中，所述螯合劑以約10mm至約120mm、或約10mm至約100mm、或約30mm至約70mm、或約40mm至約60mm、或約50mm的量存在于所述水性穩定組合物中。
[0056]
在所述水性穩定組合物的一個實施例中，所述組合物包括包括以下、由以下組成或基本上由以下組成：所述糖(例如，果糖、葡萄糖、蔗糖或其組合；優選果糖、葡萄糖或其組合)，其量為約5％至約45％(wt/vol)、約5％至約40％(wt/vol)、或約10％至約30％(wt/vol)、或約18％至約22％(wt/vol)、或約20％(wt/vol)；所述緩沖劑(諸如例如乙酸鈉)，其量為約150mm至約1.75m、或約150mm至約1.5m、或約500mm至約1.2m、或約0.7m至約0.8m、或約0.75m；所述c
1-c6烷醇(例如，甲醇、乙醇或其組合；優選乙醇)，其量為約5％至約50％(vol/vol)、或約10％至約30％(vol/vol)、或約20％至約25％(vol/vol)、或約23％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸鹽或所述其組合(優選硼酸)，其量為約0.5％至約5％(wt/vol)；或約1％至約3％(wt/vol)；或約2％至約2.5％(wt/vol)、或約2.2％(wt/vol)；和所述螯合劑(例如，cdta)，其量為約10mm至約120mm、或約10mm至約100mm、或約30mm至約70mm、或約40mm至約60mm、或約50mm。
[0057]
在一個實施例中，所述水性穩定組合物穩定所述體液中含有的細胞(例如，癌細胞或有核血細胞)、細胞外囊泡、核酸(例如，細胞dna和rna，例如無細胞dna(cfdna)、無細胞rna(cfrna)和細胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，細菌或病毒)。
[0058]
在另一個實施例中，提供了一種用于保存體液的方法，所述方法包括：a)獲得所述體液的樣本；b)使所述體液與如上定義的所述水性穩定組合物接觸以形成混合物；c)混合(b)的所述混合物以形成均勻混合物；和d)在環境溫度下儲存所述均勻混合物。在一個實施例中，保存所述體液包括穩定所述體液中含有的細胞(例如，癌細胞或有核血細胞)、細胞外囊泡、核酸(例如，dna和rna，例如無細胞dna(cfdna)、無細胞rna(cfrna)和細胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，細菌或病毒)。在另一個實施例中，所述體液中含有的所述細胞、核酸、細胞外囊泡和/或微生物在環境溫度下穩定至少7天。在另一個實施例中，所述體液中含有的所述細胞、核酸、細胞外囊泡和/或微生物在環境溫度下穩定至少14天。在另一個實施例中，所述體液是尿液或唾液。在另一個實施例中，所述體液是尿液。
[0059]
在又一個實施例中，提供了一種水性組合物，所述組合物包括：選自單糖、二糖或其組合的糖；緩沖劑；c
1-c6烷醇；硼酸、硼酸鹽或其組合；螯合劑；和體液。在一個實施例中，所述體液是尿液。在另一個實施例中，所述體液是尿液，并且包括所述體液的所述水性組合物的ph在5和5.5之間。在另一個實施例中，所述糖的存在量為約1.5％至約15％(wt/vol)、或約2％至約10％(wt/vol)、或約5％至約7％(wt/vol)、或約6％(wt/vol)；所述緩沖劑的存在量為約50mm至約500mm、或約200mm至約400mm、或約220mm至約240mm、或約230mm、或約225mm；所述c
1-c6烷醇的存在量為約2％至約40％(vol/vol)、或約3％至約20％(vol/vol)、或約5％至約10％(vol/vol)、或約6.5％(vol/vol)、或約6.9％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸鹽或所述其組合的存在量為約0.1％至約2％(wt/vol)；或約0.2％至約1.5％(wt/
vol)；或約0.5％至約1.0％(wt/vol)、或約0.7％(wt/vol)、或約0.6％(wt/vol)；并且所述螯合劑的存在量為約2.5mm至約50mm、或約5mm至約25mm、或約10mm至約20mm、或約16mm、或約15mm。
[0060]
在一個實施例中，所述體液是尿液，并且使用用于捕獲預定體積的預定部分尿液(例如，首段)的裝置來收集所述尿液樣本，所述裝置例如在題為“液體采樣器、成套部件和組裝方法(liquid sampler,kit of parts,and method for assembly)”的wo2014037152中描述的裝置。在一個實施例中，可以使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯(novosanis))。水性穩定組合物可以在收集時存在于裝置中，或者尿液可以在收集后立即與水性穩定組合物接觸。含有尿液樣本和水性穩定組合物的儲器可以用合適的蓋子密封，并且合并的樣本和穩定組合物可以輕輕混合，例如通過將管倒置。尿液樣本也可以收集在標準尿液標本容器中(例如，vwr；目錄號10804-050)，然后與穩定組合物混合。可替代地，所收集的尿液可以置于冰袋上運輸到實驗室，可以在實驗室中將其與本穩定組合物混合。
[0061]
在另一個實施例中，所述體液是唾液，并且使用裝置來收集所述唾液樣本，所述裝置諸如例如在題為“用于可釋放地儲存物質的容器系統(container system for releasably storing a substance)”的wo2007/068094、題為“樣本接收裝置(sample receiving device)”的wo2010/020043和題為“封閉物、容納設備及其使用方法(closure,containing apparatus,and method of using same)”的wo2010/130055中描述的裝置。
[0062]
在另一個實施例中，所述體液是糞便，并且使用裝置來收集所述糞便樣本，所述裝置例如在題為“用于從生物樣本中收集、運輸和儲存生物分子的裝置(device for collecting,transporting and storing biomolecules from a biological sample)”的wo2015172250中描述的裝置。
[0063]
在另一個實施例中，所述體液樣本可以收集在標準的市售實驗室或運輸管(例如，10ml圓底管(92x15.3mm)，目錄號60.610；莎斯特(sarstedt)或更大的管，取決于樣本類型和大小)中。含有體液樣本和水性穩定組合物的管可以用合適的蓋子密封，并且合并的樣本和穩定組合物可以輕輕混合，例如通過將試倒置。
[0064]
體液應優選在收集時立即與穩定組合物混合。否則，在與組合物混合之前，樣本應置于冰袋上儲存和/或運輸或冷藏。
[0065]
如技術人員將了解，本文所述的水性穩定組合物(“化學物質”)可以以各種比例與所述體液樣本組合。例如，當所述體液是尿液時，希望避免過度稀釋樣本，從而減少所收集的分析物；因此，化學物質與尿液的比例可以在例如0.25:1至0.75:1的范圍內，例如0.25:1、0.30:1、0.35:1、0.40:1、0.45:1、0.50:1、0.55:1、0.60:1、0.65:1、0.70:1或0.75:1。在一個實施例中，化學物質與尿液的比例為0.40:1至0.45:1。
[0066]
對于如糞便等其它體液，為了確保充分混合，可以使用更高的化學物質與樣本的比例。
[0067]
在一個實施例中，在使所述體液與所述水性穩定組合物接觸并混合以形成均勻混合物的步驟之后，所述均勻混合物包括：所述糖(例如，果糖、葡萄糖、蔗糖或其組合；優選果糖、葡萄糖或其組合)，其量為約1.5％至約15％(wt/vol)、或約2％至約10％(wt/vol)、或約5％至約7％(wt/vol)、或約6％(wt/vol)；所述緩沖劑(諸如例如乙酸鈉)，其量為約50mm至約500mm、或約200mm至約400mm、或約220mm至約240mm、或約230mm、或約225mm；所述c
1-c6烷
醇(例如，甲醇、乙醇或其組合；優選乙醇)，其量為約2％至約40％(vol/vol)、或約3％至約20％(vol/vol)、或約5％至約10％(vol/vol)、或約6.5％(vol/vol)、或約6.9％(vol/vol)；所述硼酸、所述硼酸鹽或所述其組合(優選硼酸)，其量為約0.1％至約2.2％(wt/vol)；或約0.2％至約1.5％(wt/vol)；或約0.5％至約1.0％(wt/vol)、或約0.7％(wt/vol)或約0.6％(wt/vol)；和所述螯合劑(優選cdta)，其量為約2.5mm至約50mm、或約5mm至約25mm、或約10mm至約20mm、或約16mm、或約15mm。
[0068]
如上所述，在一個實施例中，所述水性穩定組合物穩定所述體液中含有的細胞(例如，癌細胞或有核血細胞)、細胞外囊泡、核酸(例如，dna和rna，例如無細胞dna(cfdna)、無細胞rna(cfrna)和細胞外囊泡rna(ev rna))和/或微生物(例如，細菌或病毒)。在一個實施例中，所述水性穩定組合物在環境溫度下穩定所述體液的這些組分至少7天。在另一個實施例中，所述水性穩定組合物在環境溫度下穩定所述體液的這些組分至少14天。這種穩定可以通過本領域技術人員已知的方法來評定，例如經由監測無細胞核酸的降解(在材料和方法部分以及下面的實例中進一步描述)。
[0069]
δc
t
對應于給定基因的量或表達的相對變化。δc
t
對應于c
t(t)-c
t(t0)
，其中c
t(t)
代表第7天或第14天的循環閾值，而c
t(t0)
表示第0天的循環閾值。反應的循環閾值(c
t
)值被定義為當pcr產物的熒光可以在背景信號之上被檢測到時的循環數。在本研究中，當以c
t(t7或t14)-c
t(t0)
計算時，本δc
t
表示在室溫下儲存指定時間后的未經保存處理的和經保存處理的樣本中的不同分析物的穩定性的變化。當以c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
計算時，δc
t
表示中性(在收集時(即第0天)的在尿液樣本中加入給定化學物質的情況下的分析物相對于未經保存處理的尿液樣本的基礎濃度的變化)。不變的δc
t
值或接近0的δc
t
值表明穩定性，因為這意味著分析物的濃度未隨著時間的推移而顯著變化(因此表明組合物中的分析物在測試條件下的穩定性)。例如，在本無細胞dna研究中，在rt下保存7天的未經保存處理的樣本中，δc
t
值的范圍為+2至+14。δc
t
值的這種顯著增加(中值：》+5)表明未經保存處理的樣本中的無細胞dna的降解。另一方面，在室溫下在本水性穩定組合物中儲存后的無細胞dna檢測的δc
t
中值幾乎為零，表明無細胞dna穩定性和含量的保持，也間接表示了細胞穩定性和完整性。對于無細胞rna，未經保存處理的樣本中的δc
t
中值+2.5表明無細胞rna降解，而相對較低的δc
t
中值1.3表明與未經保存處理的樣本相比，經保存處理的樣本中的無細胞rna含量的穩定性更好。對于細胞rna穩定性，未經保存處理的樣本中的δc
t
中值+7.0表明細胞rna的顯著降解。另一方面，經保存處理的樣本中的小于2的δc
t
中值表明細胞rna穩定性。類似地，對于ev rna，未經保存處理的樣本中的大于+3的δc
t
中值表明ev rna的不穩定性和檢測受損，而經保存處理的樣本中的δc
t
中值0.5表明優異的ev rna穩定性和檢測。這僅僅是評定體液中的細胞、細胞外囊泡、核酸和/或微生物的穩定的一種示例性方法，并且評定這種穩定的其它方法是技術人員已知的和/或在材料和方法部分和下面描述的實例中進一步詳細概述。
[0070]
如以下實例7中所進一步詳細描述，含有福爾馬林/甲醛基固定劑的保存劑/組合物可以用于固定生物樣本或標本中的細胞，并防止細胞核酸泄漏到細胞外空間中。這種組合物可以含有甲醛，或者可替代地含有能夠釋放醛的化合物，例如甲醛釋放劑/甲醛供體/甲醛釋放保存劑，所述甲醛釋放保存劑是緩慢釋放甲醛的化學化合物。值得注意的是，當與從冷凍組織中分離的dna相比時，福爾馬林固定的組織表現出高頻率的不可再現的序列改
變(srinivasan m、sedmak d、jewell s(2002)《固定劑和組織處理對核酸的含量和完整性的影響(effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids)》.《美國病理學雜志(am j pathol)》161(6):1961-1971)。甲醛是最常用的固定劑的主要成分，其會導致dna-蛋白質和rna-蛋白質交聯的產生。此外，在沒有緩沖固定劑溶液的情況下，核酸將會斷裂。以上兩種情形都給基于pcr的分析帶來了挑戰(gilbert mtp、haselkorn t、bunce m、sanchez jj、lucas sb、jewell ld、van marck e、worobey m(2007)《從固定的石蠟包埋組織中分離核酸—什么時候哪種方法有用？(the isolation of nucleic acids from fixed,paraffin-embedded tissues
–
which methods are useful when？)》《公共科學圖書館
·
綜合(plos one)》2(6):e537.doi:10.1371/journal.pone.0000537；wong sq、li j、tan ay-c、vedururu r、pang j-mb、do h、ellul j、doig k、bell a、macarthur ga、fox sb、thomas dm、fellowes a、parisot jp、dobrovic a(2014)《通過大規模平行測序檢測熱點區域突變的福爾馬林固定腫瘤前瞻性系列中的序列偽影(sequence artifacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing)》.《bmc醫學基因組學(bmc medical genomics)》7:23.doi:10.1186/1755-8794-7-23)。具體而言，這種對dna的化學損傷降低了taq dna聚合酶保真度和pcr擴增效率(sikorsky ja、primerano da、fenger tw、denvir j(2007)《dna損傷降低了taq dna聚合酶保真度和pcr擴增效率(dna damage reduces taq dna polymerase fidelity and pcr amplification efficiency)》.《生物化學和生物物理研究通訊(biochem biophys res commun)》355(2):431-437)。因此，福爾馬林/甲醛基固定劑對于分子分析并不理想。因此，本文公開的用于在環境溫度下保存體液的水性穩定組合物和方法的優點在于，本技術的組合物和方法不需要使用甲醛或能夠釋放醛的化合物/組分，例如甲醛釋放劑、甲醛供體或甲醛釋放保存劑。
[0071]
實例
[0072]
材料和方法
[0073]
無細胞核酸提取：
[0074]
根據制造商的方案，使用qiaamp循環核酸提取試劑盒(凱杰(qiagen)；目錄號55114)進行無細胞核酸提取。在室溫(rt)下，將晨尿首段(fmfv)人類尿液、隨機午尿首段(fv)尿液樣本和唾液樣本以3000g至3800g離心10至20分鐘，并將澄清的上清液(2至4ml)用于無細胞核酸提取。根據制造商的說明，使用hs d5000膠條(安捷倫，目錄號5067-5592)和試劑(安捷倫，目錄號5067-5593)在4200安捷倫tapestation平臺上評定所提取的無細胞核酸圖譜。
[0075]
尿細胞外囊泡(ev)rna提取：
[0076]
使用exorneasy maxi試劑盒(凱杰，目錄號77164)或超濾進行尿液ev rna提取。通過在rt下以3000
×
g離心10分鐘對尿液樣本進行預澄清，隨后使用0.80μm注射器過濾器(minisart目錄號16592，或-aa，目錄號slaa033sb)進行過濾，然后根據制造商的說明，進行ev分離和》200個核苷酸(nt)長的rna的提取(補充信息：使用exorneasy血清/血漿midi/maxi試劑盒從尿液中純化外泌體rna，包含mirna)。使用帶有ultracel-100再生纖維素膜的amicon ultra-15離心單元(密理博-西格瑪(millipore-sigma)；目錄號ufc910024)，如下進行使用超濾的ev和ev rna分離：
[0077]
1.在室溫(rt)下以4000g離心5分鐘，用1x pbs ph 7.4(賽默飛世爾科技(thermo fisher scientific)；目錄號10010023)洗滌空ultracel-100 15ml柱。
[0078]
2.通過在rt下以4000g離心10分鐘，使用ultracel-100柱濃縮經預澄清和過濾的尿液樣本，并丟棄所得濾液。
[0079]
3.通過在rt下以4000g離心5分鐘，用1x pbs ph 7.4(賽默飛世爾科技；目錄號10010023)洗滌含保留的濃縮尿液的ultracel-100 15ml柱過濾器。
[0080]
3.將700μl qiazol裂解試劑(凱杰，目錄號79306)直接加入到經洗滌的ultracel-100過濾器中，用于裂解所捕獲的ev以進行ev rna提取。將過濾柱轉移到新的50ml falcon管；渦旋10秒，在rt下孵育5分鐘，隨后在rt下以4000g離心5分鐘。
[0081]
4.收集所得濾液和過濾器上保留的回憶性(reminiscent)裂解物，以進行ev rna分離。加入100μl氯仿并劇烈渦旋。在rt下靜置2至5分鐘。
[0082]
5.在4℃下以12,000x g離心15分鐘。將～400μl水相轉移到新管。
[0083]
6.加入400μl(等體積)70％乙醇，并適當混合，然后將混合物轉移到凱杰rneasy minelute柱。在rt下以8,000x g離心30秒。丟棄濾液。
[0084]
7.向柱加入700μl緩沖液rwt(凱杰)。在rt下以8,000x g離心30秒。丟棄濾液。
[0085]
8.向柱加入500μl緩沖液rpe(凱杰)。在rt下以8,000x g離心30秒。丟棄濾液。
[0086]
9.向柱加入500μl緩沖液rpe(凱杰)。在rt下以8,000x g離心2分鐘。丟棄濾液，并將空柱轉移到新的2ml收集管(凱杰)。在蓋子打開的情況下，將柱以最大速度離心5分鐘，以干燥膜。
[0087]
10.向經干燥的離心柱的中心加入20μl無rna酶的水。讓柱在rt下靜置1分鐘，隨后在rt下以最大速度離心1分鐘。
[0088]
11.將所收集的rna樣本在-80℃下儲存，直到進行定量和下游處理。
[0089]
12.根據制造商的說明，使用安捷倫rna 6000pico試劑盒(目錄號5067-1513)在安捷倫2100生物分析儀上對所提取的ev rna樣本進行定量，和/或使用quant-it ribogreen rna測定試劑盒(賽默飛世爾科技，目錄號r11490)進行ribogreen定量分析，用于下游cdna制備。
[0090]
16s qpcr測定：
[0091]
使用2x itaq universal sybr mastermix(伯樂(bio-rad)；目錄號1725121)對從尿液樣本中提取的核酸進行qpcr測定，以進行細菌dna含量的定量。細菌16s rrna的引物和qpcr條件如下：bacrrna173-正向引物5'attaccgcggctgctgg 3'(seq id no:1)，bacrrna173-反向引物5'cctacgggaggcagcag 3'(seq id no:2)(dc emery、dk shoemark、te blatstone、cm waterfall、ja coghill、ta cerajewska、m davies、nx west、sj allen(2017)《16s rrna下一代測序分析顯示了阿爾茨海默病死后大腦中的細菌(16s rrna next generation sequencing analysis shows bacteria in alzheimer's post-mortem brain)》.《衰老神經科學的前沿(frontiers in aging neuroscience)》9:195.doi:10.3389/friagi.2017.00195)。擴增混合物(20μl)含有：10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl無核酸酶的水(購自英杰(invitrogen)的nfw，目錄號10977023)和2μl所提取的尿無細胞核酸。在每次qpcr運行中，使用連續稀釋(1、1:10、1:100和1:1000)的大腸桿菌gdna標準品和非模板對照(2μl無rna酶/dna酶的水)。在伯
樂c1000觸摸熱循環儀(#1851196)上進行pcr反應，并且條件如下：95℃：5分鐘，[95℃：20秒，56℃：30秒]
×
45個循環。通過以0.5℃的增量將樣本從65℃加熱到95℃并在每次增量時讀板5秒鐘來獲得熔解曲線。使用代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的“δc
t”進行細菌無細胞dna或細胞dna定量分析。“c
t(t7)”和“c
t(t0)”分別代表第7天和第0天的qpcr循環閾值。
[0092]
人類β-珠蛋白qpcr測定：
[0093]
使用2x itaq universal sybr mastermix(伯樂；目錄號1725121)對從尿液樣本中提取的核酸進行qpcr測定，以進行人類無細胞dna含量的定量。人類β-珠蛋白qpcr測定的引物和pcr條件在文獻中有所描述(m jung、s klotzek、m lewandowski、m fleischhacker、k jung(2003)《血液樣本儲存過程中的血清和血漿中的dna的濃度變化(changes in concentration of dna in serum and plasma during storage of blood samples)》.《臨床化學(clinical chem)》49(6):1028-1029)并且如下：正向引物：5
′
acacaactgtgttcactagc 3
′
(seq id no:3)，反向引物：5
′
caacttcatccacgttcacc 3
′
(seq id no:4)。擴增混合物(20μl)含有：10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl無核酸酶的水(英杰，目錄號10977023)和2μl所提取的尿無細胞核酸。在每次qpcr運行中，使用連續稀釋(1、1:10、1:100和1:1000)的人類gdna標準品和非模板對照(2μl無rna酶/dna酶的水)。在伯樂c1000觸摸熱循環儀(#1851196)上進行pcr反應，并且條件如下：95℃：5分鐘，[(95℃：20秒，56℃：30秒)
×
45個循環]。通過以0.5℃的增量將樣本從65℃加熱到95℃并在每次增量時讀板5秒鐘來獲得熔解曲線。對于穩定性評定：使用代表[c
t(t)-c
t(t0)
]的“δc
t”進行人類無細胞dna定量分析。“c
t(t)”代表第7天或第14天的qpcr循環閾值，而“c
t(t0)”代表未經保存處理的和含有化學物質的尿液樣本的第0天的qpcr循環閾值。相對于未經保存處理的第0天(na)樣本的無細胞dna定量通過以[c
t(t)-c
t(t0 na)
]進行δc
t
計算來進行定量，其中c
t(t0 na)
代表第0天的未經保存處理的樣本的qpcr循環閾值。此外，為了評定中性(即在收集時的在尿液樣本中加入給定化學物質的情況下的無細胞dna的基礎濃度的變化)，以[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]進行δc
t
計算，其中c
t(t0 chem)
代表含化學物質/穩定溶液的第0天尿液樣本的qpcr循環閾值。
[0094]
體外dna甲基化測定：
[0095]
本測定如文獻(c ernst、po mcgowan、v deleva、mj meaney、m szyf、g turecki(2008)《ph對dna甲基化狀態的影響：體外和死后大腦研究(the effects of ph on dna methylation state:in vitro and post-mortem brain studies)》.《神經科學方法雜志(j neurosci methods)》174(1):123-125)中所述來進行。pgl3-堿性質粒(普洛麥格(promega)；目錄號e1751)含有25個ccgg位點。根據制造商的方案，用cpg甲基轉移酶(紐英倫生物技術(new england biolabs)；目錄號m0226s)處理1μg質粒，所述甲基轉移酶是一種甲基化cpg二核苷酸中的所有胞嘧啶核苷酸的酶。為了證實甲基化狀態，用hpaii和mspi對甲基化質粒(pgl3-ch3)進行限制性核酸內切酶消化。這兩種酶都識別了相同的位點(ccgg)。盡管hpaii在內部c甲基化時被阻止切割dna，但mspi對內部c的甲基化狀態也不敏感。使用齊莫研究(zymo research)的dna clean&concentrator-5試劑盒(目錄號d4013)對體外甲基化pgl3質粒進行柱純化。將等量的純化質粒添加到1x te緩沖液ph 8.0(陽性對照)中或添加到含有本發明的組合物的男性合并和女性合并fmfv尿液樣本中，并將反應管在rt下保持7天。孵育后，使用凱杰epitec亞硫酸氫鹽試劑盒(目錄號59104)對dna樣本進行
亞硫酸氫鹽轉化。亞硫酸氫鹽處理將造成未甲基化質粒(胞嘧啶到尿嘧啶的轉化)和甲基化質粒(甲基化胞嘧啶將對轉化保持免疫)之間的序列差異(y li和to tollefsbol(2011)《dna甲基化檢測：亞硫酸氫鹽基因組測序分析(dna methylation detection:bisulfite genomic sequencing analysis)》.《分子生物學方法(methods mol biol)》791:11-21.doi:10.1007/978-1-61779-316-5_2)。使用甲基化質粒特異性引物的pcr實驗將產生278bp的擴增子。如ernst等人(2008)同上中所述使用引物(正向引物：5'-aagatgtttttttgtgattggt-3'(seq id no:5)；反向引物：5'-ttcctatttttactcacccaaa-3'(seq id no:6))。
[0096]
hpv質粒添加測定：
[0097]
在lb培養基中培養大腸桿菌dh5α菌株hpv16質粒(人類乳頭瘤病毒；16型克隆)(atcc目錄號45113)，以使用zymopure ii質粒maxi prep樣本試劑盒(齊莫研究，目錄號d4202和d4203)提取hpv16質粒。在有和沒有本發明的保存劑化學物質的情況下，將所提取/純化的質粒以一定的濃度(1至10ng/ml)添加到女性合并和男性合并晨尿首段尿液樣本中。對添加質粒的尿液樣本的每份200μl等分試樣進行處理，以使用qiaamp dna迷你試劑盒在qiacube connect上進行總dna提取。針對hpv16質粒主鏈上發現的氨芐青霉素抗性基因(ampr)使用qpcr測定來對每個反應管中以及不同天(t0和t7)的質粒dna的量進行定量。amp
r qpcr引物和條件如下：正向引物(fp)：5
′
agccataccaaacgacgag 3
′
(seq id no:7)；反向引物(rp)：5
′
agcaataaaccagccagcc 3
′
(seq id no:8)。擴增混合物(20μl)含有10μl 2x itaq universal sybr mastermix、10μm正向和反向引物各1μl、6μl無核酸酶的水(英杰，目錄號10977023)和2μl所提取的尿核酸。在每次qpcr運行中，使用連續稀釋(1、1:10、1:100、1:1000)的hpv16質粒標準品和非模板對照(2μl無rna酶/dna酶的水)。在伯樂c1000觸摸熱循環儀(#1851196)上進行pcr反應，并且條件如下：95℃：5分鐘，[(95℃：20秒，55℃：30秒)
×
45個循環]。通過以0.5℃的增量將樣本從65℃加熱到95℃并在每次增量時讀板5秒鐘來獲得熔解曲線。使用代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的“δc
t”進行hpv質粒dna定量分析。“c
t(t7)”和“c
t(t0)”分別代表第7天和第0天的qpcr循環閾值。
[0098]
尿無細胞和細胞rna提取：
[0099]
通過以下對來自尿液沉淀的總細胞rna進行提取：1)根據制造商的說明，使用凱杰rneasy plus迷你試劑盒(目錄號74134)并在30μl無rna酶的水中洗脫，和/或2)使用trizol ls試劑(西格瑪(sigma)，目錄號t3934)，如下所述：
[0100]
在每個時間點，將樣本以3800x g離心20分鐘。在每個時間點，將沉淀重懸于750μl tri試劑ls(和250μl水)中。在-80℃下冷凍之前，允許樣本靜置5分鐘。將樣本在rt下解凍，并進行如下處理：
[0101]
1.加入200μl氯仿并劇烈渦旋。在rt下靜置2至15分鐘。
[0102]
2.在4℃下以12,000x g離心15分鐘(水相的體積為tri試劑體積的約70％)。將500μl水相轉移到新管。
[0103]
3.加入50μl 10x dna酶緩沖液和1μl無rna酶的dna酶(盧西根(lucigen)，目錄號d9905k)。在37℃下孵育15分鐘。
[0104]
4.加入500μl(等體積)酸性酚氯仿并劇烈渦旋。靜置5分鐘，隨后在4℃下以12,000x g離心10分鐘。將水相轉移到新管中，并加入1μl 20μg/μl糖原和500μl異丙醇。在rt下
靜置10分鐘。
[0105]
5.在4℃下以12,000x g離心8分鐘。去除上清液并用1ml 75％乙醇洗滌沉淀。渦旋樣本，然后以12,000x g離心5分鐘。去除上清液，并風干沉淀5至10分鐘。
[0106]
6.將沉淀重懸于30μl無rna酶的水中。
[0107]
使用凱杰循環核酸試劑盒(目錄號55114)從上清液中提取總無細胞核酸，并在30至50μl試劑盒緩沖液ave中洗脫。使用pico6000 rna測定(目錄號5067-1513)在2100安捷倫生物分析儀上進行rna圖譜分析。使用基于taqman的rt-qpcr測定對購自賽默飛世爾科技的β-肌動蛋白(actb:hs00357333_g1)(目錄號4331182)進行mrna靶標分析。對于無細胞rna定量研究，在cdna合成之前，使用dna酶i消化進行無細胞dna去除，隨后按照qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰；目錄號55114)中描述的說明使用rneasy minelute純化試劑盒(凱杰；目錄號74204)進行純化。
[0108]
細胞、無細胞和ev rna的rt-qpcr測定：
[0109]
根據制造商的方案，使用隨機六聚體和m-mlv逆轉錄酶(賽默飛世爾科技；目錄號28025-013)用等量(ng)的從每個樣本中提取的rna制備cdna；根據制造商的方案，使用2μl純cdna用taqman基因表達master mix ii和ung(賽默飛世爾科技；目錄號4440038)進行β-肌動蛋白taqman測定，并且每個樣本以一式兩份或三份運行。最初，使用由血液rna制備的cdna的連續稀釋來測試actb taqman測定的效率。在伯樂c1000觸摸熱循環儀(目錄號1851196)中進行pcr反應，并且條件如下：50℃：2分鐘，95℃：10分鐘，[95℃：15秒，60℃：1分鐘]
×
45個循環。rna穩定性定量被表示為代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的“δc
t”。“c
t(t7)”和“c
t(t0)”分別代表第7天和第0天的qpcr循環閾值。此外，為了評定中性(在收集時的在尿液樣本中加入給定化學物質的情況下的分析物的基礎濃度的變化)，以[c
t(t0 chem)-c
t(t0 na)
]進行δc
t
計算，其中c
t(t0 chem)
代表含化學物質/穩定溶液的第0天尿液樣本的qpcr循環閾值。
[0110]
針對靶β-珠蛋白基因的dna樣本的微滴式數字pcr(ddpcr)分析：
[0111]
ddpcr的各個反應含有100nm的最終引物濃度以及最終體積為23μl的2x qx200 ddpcr evagreen supermix(伯樂；目錄號1864034)。將20μl反應混合物轉移到含65μl evagreen用微滴生成油(伯樂；目錄號1864006)的dg8小柱(伯樂；目錄號1864008)，用dg8墊圈(伯樂；目錄號1863009)覆蓋并用伯樂qx200微滴生成器轉化成微滴。然后，將微滴轉移到96孔板(伯樂；目錄號12001925)并使用伯樂px1 pcr平板密封器(目錄號1814000)在180℃下用可刺穿箔熱封(伯樂；目錄號1814040)熱密封6秒。然后，將樣本在伯樂c1000觸摸熱循環儀(目錄號1851196)中循環，使用3步循環程序：95℃5分鐘，隨后95℃30秒x50個循環，退火溫度設置為58℃下1分鐘和72℃下30秒，隨后各自(4℃5分鐘、90℃5分鐘)x1個循環，并保持在12℃。β-珠蛋白ddpcr測定中使用的引物與上述β-珠蛋白qpcr測定所使用相同(正向引物：5
′
acacaactgtgttcactagc 3
′
(seq id no:3)，反向引物：5
′
caacttcatccacgttcacc 3
′
(seq id no:4))。所有升溫速率都設置為2攝氏度/秒。然后，將循環的平板轉移并在qx200微滴閱讀器(伯樂；目錄號1864003)上讀取；用quanta-soft軟件(伯樂；目錄號1864011)對數據進行分析。對于分析而言，豐度以濃度(每μl拷貝數)報告，并且對于給定樣本，總接受微滴超過10,000個微滴。
[0112]
尿細胞dna提取和定量：
[0113]
根據制造商的說明，使用qiaamp dna迷你試劑盒(凱杰；目錄號51306)來自尿液沉
淀的總細胞dna進行提取，并在50μl洗脫緩沖液或無核酸酶的水(nfw)中洗脫。在每個時間點，將樣本以3800x g離心20分鐘。將尿液沉淀在-80℃下冷凍保存，直至提取。將沉淀在rt下解凍，并重懸于200μl 1x pbs中，隨后進行總dna提取。使用quant-it
tm picogreen
tm dsdna試劑(賽默飛世爾科技；目錄號p7581)進行總細胞dna定量。根據說明，使用基因組dna膠條在安捷倫4200tapestation上評定總基因組dna圖譜。使用gapdh pcr對～1kb的擴增子產物進行人類基因組dna的靶向擴增。gapdh qpcr測定的引物和pcr條件如下：正向引物：5'-gtc aac gga ttt ggt cgt att g-3'(seq id no:9)；反向引物：5'-ctc tct tcc tct tgt gct ctt g-3'(seq id no:10)。95℃，5分鐘，[95℃，30秒；56℃，30秒；72℃，60秒]x25個循環；72℃，10分鐘4℃，保持。每個反應設置如下：
[0114][0115][0116]
在下面的實例中，糖占組合物的百分比以wt/vol計，烷醇(例如，甲醇或乙醇)占組合物的百分比以vol/vol計，并且硼酸的百分比以wt/vol計。
[0117]
實例1—尿無細胞dna含量具有樣本和性別依賴性
[0118]
從健康的女性和男性供體中收集大約20至30ml的晨尿首段(fmfv)尿液到尿液標本杯中；置于冰袋上運輸和儲存，直到下游處理。在尿液收集的3小時內，將標本的每份4.5ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰；目錄號55114；參見材料和方法)，從每份4.0ml的即刻所得上清液或-80℃下儲存的冷凍上清液等分試樣中提取無細胞核酸。隨后，使用pico-green定量測定來測量尿無細胞dna(ucf-dna)濃度。女性供體的平均尿無細胞dna濃度為約15ng/ml，而男性為大約3ng/ml(參見圖1)。文獻中還報道了女性尿液中存在比男性尿液中更高的無細胞dna量(streleckiene g、reid hm、arnold n、bauerschlag d、forster m.《定量尿液中的無細胞dna：商業試劑盒之間的比較，性別和個體間差異的影響(quantifying cell free dna in urine:comparison between commercial kits,impact of gender and inter-individual variation)》.《生物技術(biotechniques)》.2018,64(5):225-230。
[0119]
實例2—人類無細胞dna在室溫下儲存的不穩定尿液中降解
[0120]
在不存在保存劑或穩定劑(na)的情況下，室溫下儲存的尿液會發生可見的和分子上的變化。在本實例中，從健康的女性供體收集20至30ml晨尿首段(fmfv)尿液，并在室溫下儲存7天。在此期間，這種代表性尿液樣本變得越來越渾濁(圖2a)，如通過細菌計數(od
600nm
)的增加所測量。這一觀察結果得到了定量細菌16s qpcr測定(圖2b，參見材料和方法)的進
一步證實，所述測定示出了細菌16s dna的δc
t
的急劇降低，表明由于細菌細胞的過度生長和裂解，細菌無細胞dna含量增加。相比之下，β-珠蛋白dna的δc
t
急劇增加，表明人類無細胞dna含量顯著減少(圖2b至d)，如通過β-珠蛋白無細胞dna qpcr測定(圖2b；參見材料和方法)和安捷倫4200tapestation分析(參見圖2c至d中的箭頭，參見材料和方法)所測量。兩種方法比較了從第0天和第7天的尿液等分試樣中提取的無細胞dna，清楚地示出了在室溫下7天后的無細胞dna含量的大幅下降(圖2b至d)。
[0121]
實例3—在用于無細胞dna的本尿液穩定組合物中可以使用不同的糖(單糖/二糖)
[0122]
五名健康的男性和女性供體提供了60至70ml晨尿首段(fmfv)尿液標本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，1)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存標本，每份20ml，并且2)將每份12ml的尿液標本與4ml儲備溶液[表1(i)]和4ml 95％乙醇混合，所述儲備溶液含有不同的糖，即葡萄糖(chem g)、蔗糖(chem s)和果糖(chem f)。在本實例中，與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在下面描述[參見表1(ii)]。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。
[0123]
在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有不同化學物質的標本的每份4.5ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。在離心后，從每個標本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞dna。來自每個標本的兩微升純化無細胞dna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(參見材料和方法)。圖3a和3b示出了β-珠蛋白dna的δc
t
的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低。相比之下，在室溫下7天后的含不同的糖的標本中的人類無細胞dna水平沒有顯著變化，如幾乎為零的δc
t
中值所示[圖3a(i)和3b(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的無細胞dna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖3a(ii)和3b(ii)]。
[0124]
在另一個實驗設置中，健康的男性和女性供體使用colli-裝置(諾沃桑尼斯)提供了隨機首段(fv)尿液標本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將男性和女性尿液樣本合并，以分別產生男性合并標本和女性合并標本。將每個合并標本的等分試樣在以下條件下儲存：1)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下，和2)以尿液/化學物質比1:0.43與含有不同的糖的化學物質[表2(i)]混合，所述不同的糖即葡萄糖(化學物質g)和果糖(化學物質f)。在本實例中，與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在下面描述[參見表2(ii)]。所有標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。
[0125]
在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有不同化學物質的標本的每份2.5ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后使用0.8μm注射器過濾器(minisart目錄號16592，或-aa，目錄號slaa033sb)進行過濾。使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)，將2.0ml預澄清上清液用于無細胞dna(cfdna)提取。圖3c(i)示出了β-珠蛋白dna的δc
t
(中值：+5.8)的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δc
t
沒有顯著變化，表明在室溫下7天后的含有化學物質f(chem f)和化學物質g(chem g)的標本中的人類無細胞dna含量沒有變化[圖3c(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的無細胞dna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖3c(ii)]。
[0126]
含二糖蔗糖的本組合物難以制備，因為溶液的粘度非常高，導致不適當的組分混合。由于混合困難，高粘度可能會進一步導致穩定溶液向標本中的不適當加入。因此，為了避免在穩定溶液的制備和測試中出現這些基本難題，決定將重點放在有效的含有單糖的組合物上，同時仍然保持了無細胞dna含量的足夠穩定(圖3b和3c)。總的來說，由于樣本的可加工性，對于本發明，單糖比二糖更優選。
[0127]
表1(i)：與尿液混合前的不同儲備溶液的組合物。
[0128]
組合物化學物質g(葡萄糖)化學物質s(蔗糖)化學物質f(果糖)乙酸鈉1750mm1750mm1750mm硼酸5％5％5％cdta119mm119mm119mm糖45％45％45％ph4.7至5.04.7至5.04.7至5.0
[0129]
表1(ii)：與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物。
[0130]
組合物化學物質g(葡萄糖)化學物質s(蔗糖)化學物質f(果糖)乙酸鈉350mm350mm350mm硼酸1％1％1％cdta23.8mm23.8mm23.8mm糖9％9％9％乙醇19％19％19％
[0131]
表2(i)：與尿液混合前的不同儲備溶液的組合物。
[0132]
組合物化學物質g(葡萄糖)化學物質f(果糖)乙酸鈉750mm750mm硼酸2.2％2.2％cdta50mm50mm糖20％20％乙醇23％23％ph5.0至5.25.0至5.2
[0133]
表2(ii)：與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物。
[0134]
組合物化學物質g(葡萄糖)化學物質f(果糖)乙酸鈉225mm225mm硼酸0.7％0.7％cdta15mm15mm糖6％6％乙醇6.9％6.9％
[0135]
實例4：糖、醇、緩沖液和較低ph的存在調節了本組合物的穩定效果。
[0136]
六名健康的女性供體提供了30ml晨尿首段尿(fmfv)標本，并且將她們的尿液樣本合并在一起以產生兩個不同的合并尿液標本；1)在不存在穩定組合物(na)的情況下儲存合并標本，每份15ml，并且2)將每份11ml的合并尿液標本與3ml儲備溶液混合(含本組合物的
不同迭代；以下表3)和1ml 95％乙醇/甲醇，如表4中所述。與合并尿液混合后的最終組合物在以下表5中描述。所有標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。為了進行比較，將25ml合并尿液與5ml施特雷克的尿液固定劑(參考組合物)混合，所述固定劑在商業上被稱為“無細胞dna尿液保存劑”(目錄號230216)，并在室溫下儲存至少7天。這種參考組合物包括甲醛釋放劑咪唑烷基脲以及k3edta和甘氨酸。
[0137]
在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有化學物質的合并標本的每份4.5ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。在離心后，從每個標本中回收4.0ml上清液，并在-80℃下儲存。為了評定在有和沒有穩定組合物的情況下的無細胞dna的穩定性，使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)對來自未經保存處理的和含有不同化學成分的第0天和第7天的尿液樣本的冷凍上清液進行無細胞dna提取。來自每個標本的兩微升純化無細胞dna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(參見材料和方法)。
[0138]
圖4(a和b)示出了β-珠蛋白dna的δc
t
的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低(na t7；圖4a和4b)。將合并尿液標本中的一個用于研究不同醇(乙醇和甲醇)對本組合物的穩定效率的影響。圖4a表明，本組合物中的乙醇也可以用甲醇代替；然而，與乙醇相比，甲醇在所使用的濃度下是有毒的，并且對于家庭收集來說不太理想。此外，據發現，在室溫下7天后，含本組合物(chem f，ph 4.7至5.0)的尿液標本中的人類無細胞dna與被稱為“無細胞dna尿液保存劑”的施特雷克的尿液固定劑相似(圖4b)，表明本組合物與這種參考組合物一樣有效，如本組合物和參考組合物的相似δc
t
值所示。乙醇、緩沖鹽(例如，乙酸鈉)、糖、乙醇及糖和乙醇及鹽的去除以及ph升高(≥5.5)使化學物質f組合物在保存無細胞dna含量方面的有效性降低，如δc
t
值的降低所指示。這種δc
t
的降低表明，與含乙醇的化學物質f的完全組合物(ph 4.7至5.0)相比，在不同的化學物質迭代中，尿液樣本中的無細胞dna含量的增加在室溫下保持7天(圖4b)。最后，數據表明本組合物的理想ph范圍是4.7至5.0(+/-0.2)。
[0139]
表3：與尿液混合前的儲備溶液的組合物。
[0140][0141][0142]
表4：尿液樣本中的不同迭代的加入。
[0143] 尿液(ml)儲備溶液(ml)95％乙醇/甲醇(ml)chem f(ph 4.7至8.5)1131chem f，不含果糖1131chem f，不含緩沖液1131chem f，不含乙醇123-chem f，不含果糖及乙醇123-chem f，不含緩沖液及乙醇123-chem f，含甲醇1131
[0144]
表5：與尿液混合后的最終組合物。
[0145]
組合物chem fchem f，不含果糖chem f，不含緩沖液乙酸鈉350mm350mm-硼酸1％1％1％cdta23.8mm23.8mm23.8mm果糖9％-9％
[0146]
實例5：用于在室溫下保存尿液中的核酸的穩定組合物。
[0147]
總共十一名健康的供體(男性和女性)提供了40至60ml晨尿首段(fmfv)尿液標本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，i)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存標本，每份20ml，并且2)將每份12ml的尿液標本與穩定溶液[4ml儲備溶液；表6(i)和4ml 95％乙醇]混合。在本實例中，與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在下面描述[參見表6(ii)]。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。在第0天和第7天，將未經保存處理的和含穩定溶液的標本的每份4.5ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。在離心后，從每個標本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞dna。來自每個標本的兩微升純化cfdna用作β-珠蛋白qpcr分析的模板(參見材料和方法)。圖5a示出了β-珠蛋白dna的δc
t
的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低(圖5a)。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δc
t
沒有顯著變化，表明在室溫下7天后的含有chem f的標本中的人類無細胞dna水平沒有變化[圖5a(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的無細胞dna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖5a(ii)]。使用hsd5000膠條(安捷倫科技)的代表性tapestation圖譜分析(圖5b)表明，在未經保存處理的第0天的等分試樣、化學物質f(chem f)第0天和第7天的等分試樣中存在無細胞核酸；無細胞核酸在未經保存處理的第7天的等分試樣中降解。
[0148]
在另一個實驗設置中，合并來自男性和女性健康供體的尿液樣本以產生男性和女性合并尿液標本。將每個樣本的等分試樣在以下條件下儲存：1)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的條件下，2)以1:0.43的比例與儲備溶液[表7(i)]混合，和3)與諾根(norgen)尿液收集和保存管(目錄號18111)混合。在本實例中，與尿液混合后的穩定溶液“化學物質f(chem f)”的最終組合物在下面描述[參見表7(ii)]。所有標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有穩定溶液的尿液標本的每份2.5ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后使用0.8μm注射器過濾器(minisart目錄號16592，或-aa，目錄號slaa033sb)。在離心后，從每個標本中回收2.0ml上清液，并使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞dna(cfdna)。圖5c(i)示出了β-珠蛋白dna的δc
t
的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低[圖5c(i)]。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δc
t
沒有顯著變化，表明在室溫下7天后的含有化學物質f(chem f)的標本中的人類無細胞dna水平沒有變化[圖5c(i)]。另一方面，含有諾根尿液保存劑的樣本表現出β-珠蛋白dna的δc
t
的顯著增加，表明在標本在室溫下儲存7天后，人類無細胞dna含量急劇降低[圖5c(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的無細胞dna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖5c(ii)]。
[0149]
在另一個實驗設置中，將使用colli-裝置(諾沃桑尼斯)收集的來自健康男性和女性供體的首段尿液樣本合并以分別產生男性和女性合并尿液標本。將每個標本的等分試樣在以下條件下儲存：1)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的條件下，2)以1:0.43的比例與儲備溶液(表7i)混合，和3)與諾根尿液收集和保存管(諾根生物科技；目錄號18111)混合。在本實例中，與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在下面描述(參見表7ii)。所有標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少14天。在第0天和第14天，將未經保存處理的和含有穩定溶液的尿液標本的每份2.5ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后使用0.8μm注射器過濾器(minisart目錄號16592，或-aa，目錄號slaa033sb)。在離心后，從每個標本中回收2.0ml上清液，并使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞dna(cfdna)。圖5d(i)和5e(i)示出了β-珠蛋白dna的δc
t
的急劇增加，表明在未經保存處理的標本在室溫下儲存14天后，人類無細胞dna含量急劇降低。相比之下，β-珠蛋白dna水平的δc
t
沒有顯著變化，表明在室溫下14天后的含有chem f的標本中的人類無細胞dna水平沒有變化[圖5d(i)、5e(i)]。另一方面，含有諾根尿液保存劑的樣本表現出β-珠蛋白的δc
t
的降低[圖5d(i)]或β-珠蛋白dna的δc
t
的增加[圖5e(i)]，表明在室溫下儲存14天時，女性和男性尿液標本中的人類無細胞dna含量分別增加或降低。此外，與加入時(第0天)的chem f樣本相比，含有諾根尿液保存劑的女性尿液樣本的中性表現出了變化[圖5d(ii)]。
[0150]
表6(i)：與尿液混合前的儲備溶液的組合物。
[0151]
組合物儲備溶液乙酸鈉1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0
[0152]
表6(ii)：與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物。
[0153]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇19％
[0154]
表7(i)：與尿液混合前的儲備溶液的組合物。
[0155]
組合物儲備溶液乙酸鈉750mm硼酸2.2％cdta50mm果糖20％乙醇23％
ph5.0至5.2
[0156]
表7(ii)：與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物。
[0157][0158][0159]
實例6：穩定組合物在室溫下保持前列腺癌細胞的完整性7天。
[0160]
來自男性供體的尿液可能含有脫落的前列腺上皮細胞，這是上皮細胞在正常周轉期間從前列腺脫落的結果。此外，還可以通過進行前列腺按摩對前列腺進行物理操縱來增加這種向尿液中的分泌，特別是在前列腺癌患者中。因此，為了測試含有穩定溶液的尿液樣本中的細胞的穩定性和完整性，前列腺癌細胞被用作感興趣的細胞類型之一。
[0161]
在存在穩定組合物化學物質f的情況下，使用無細胞dna含量隨時間的變化來測量細胞完整性。在一個實驗設置[實例6(i)]中，將來自3名健康男性和3名女性供體的晨尿首段尿液(fmfv)標本合并以產生一個女性合并(fp)和一個男性合并(mp)尿液標本。除了男性尿液之外，還將女性尿液樣本包含在這項研究中，以測試癌細胞在更濃縮、含高生物量的尿液基質中的穩定性。將合并標本在室溫下以3,000g離心10至20分鐘，隨后用0.2微米過濾器過濾所得上清液。將這些預澄清無細胞尿液標本等分，然后添加前列腺癌細胞(lncap克隆fgc；atcc crl-1740
tm
)。
[0162]
為了測試化學物質f對所添加的前列腺癌細胞的穩定性的濃度依賴性影響，加入不同量(ml)的儲備溶液(參見表8)和固定量的95％乙醇，以獲得在與含有所添加的前列腺癌細胞的預澄清尿液混合后的化學物質f中的各種組分的不同最終濃度(參見表9)。如表10中所述，將儲備溶液和乙醇與含有所添加的前列腺癌細胞的預澄清尿液混合。
[0163]
在另一個實驗設置[實例(6ii)]中，將來自三名健康女性的晨尿首段尿液(fmfv)標本合并以產生一個女性合并(fp)尿液標本。將合并標本在室溫下以3,000g離心10至20分鐘，隨后用0.2微米過濾器過濾所得上清液。將這些預澄清無細胞尿液標本等分，然后添加前列腺癌細胞(lncap克隆fgc；atcc crl-1740
tm
)。在本實驗設置中，95％乙醇的量(ml)也隨著儲備溶液的量(ml)(表8)的變化而變化，以獲得在與含有所添加的前列腺癌細胞的預澄清尿液混合后的化學物質f中的組分的不同最終濃度，如表11中所指定。如表12中所述，將儲備溶液和乙醇量與含有所添加的前列腺癌細胞的預澄清尿液混合。
[0164]
在兩個實驗設置中，將標本與組合物一起孵育30至60分鐘(第0天)，或在使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)進行無細胞dna提取之前7天執行此操作。使用β-珠蛋白qpcr測定對所提取的人類無細胞dna進行定量(圖6(i)(a和b)和圖6(ii)a；參見材料和方法)，并相對于第0天的未經保存處理的尿液(na)歸一化。
[0165]
圖6(i)表明，在存在含相對恒定量的乙醇的化學物質f的情況下，所添加的人類前列腺細胞沒有以濃度依賴方式將基因組dna泄漏到上清液中。與0.5x和0.8x化學物質f的無顯著變化相比，不加入化學物質f(na)導致δc
t
顯著增加，從而證明男性和女性合并標本中的無細胞dna含量降低[圖6(i)a和b]。另一方面，0.25x濃度表現出mp尿液樣本中的δc
t
降
低(意味著由于細胞穩定性受損導致基因組dna泄漏而引起cfdna含量增加)或fp尿液樣本中的δc
t
增加(意味著由于化學穩定性受損導致更多cfdna降解而引起cfdna含量降低)。這種差異可能取決于尿液基質。由于女性尿液樣本中存在高生物量，0.25x稀釋濃度的組分無法抑制尿液dna酶對無細胞dna的降解，因此降解速率快于保存速率，從而導致總cfdna含量損失。另一方面，由于男性尿液基質含有低生物量，0.25x濃度的化學物質組分仍可以抑制尿液dna酶對無細胞dna的降解，因此保存速率快于降解速率，從而導致無細胞dna含量的總體增加。總的來說，在fp和mp尿液樣本中，化學物質f對無細胞dna圖譜和細胞穩定性有濃度依賴性影響。fp標本的代表性tapestation圖譜分析(圖6(i)c)也示出了相較于0.8x和0.5x稀釋的化學物質f(圖6(i)c)的第0天(圖6(i)c中的黑色跡線)和第7天(圖6(i)c中的灰色跡線)之間的在不存在化學物質f(na)和0.25x化學物質f的情況下的無細胞核酸圖譜的顯著差異。
[0166]
圖6(ii)a還表明，在存在含不同量的乙醇的化學物質f的情況下，所添加的前列腺癌細胞沒有以濃度依賴方式將基因組dna泄漏到上清液中，其中1x最有效，而0.25x最無效。0.25x化學物質f導致δc
t
的初始下降，意味著第0天cfdna含量增加，隨后δc
t
增加，表明第7天無細胞dna含量減少(圖6(ii)a)。β-珠蛋白qpcr測定結果(圖6(ii)a)得到β-珠蛋白微滴式數字pcr測定(圖6(ii)b)的進一步證實，所述β-珠蛋白微滴式數字pcr測定還揭示，1x化學物質f溶液保持了每單位體積β-珠蛋白基因的拷貝數，而0.25x化學物質f導致在第0天的初始增加，隨后在室溫下在加標尿液標本中7天后每單位體積β-珠蛋白基因的拷貝數顯著減少(圖6(ii)b)。總的來說，數據表明，本發明的組合物在室溫下以濃度依賴方式保持前列腺癌細胞的完整性至少7天。
[0167]
表8：儲備溶液的組合物
[0168][0169][0170]
表9：與添加前列腺癌細胞的預澄清尿液混合后的0.8x、0.5x和0.25x化學物質f的最終組合物。
[0171]
組合物0.8x化學物質f0.5x化學物質f0.25x化學物質f乙酸鈉280mm175mm87.5mm硼酸0.8％0.5％0.25％cdta19mm11.9mm5.95mm果糖7.2％4.5％2.25％乙醇13.2％13.7％14.1％
[0172]
表10：加入到添加前列腺癌細胞的預澄清尿液中的儲備溶液和乙醇的量。
fixed,paraffin-embedded tissues
–
which methods are useful when？)》《公共科學圖書館
·
綜合(plos one)》2(6):e537.doi:10.1371/journal.pone.0000537；wong sq、li j、tan ay-c、vedururu r、pang j-mb、do h、ellul j、doig k、bell a、macarthur ga、fox sb、thomas dm、fellowes a、parisot jp、dobrovic a(2014)《通過大規模平行測序檢測熱點區域突變的福爾馬林固定腫瘤前瞻性系列中的序列偽影(sequence artifacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing)》.《bmc醫學基因組學(bmc medical genomics)》7:23.doi:10.1186/1755-8794-7-23)。具體而言，這種對dna的化學損傷降低了taq dna聚合酶保真度和pcr擴增效率(sikorsky ja、primerano da、fenger tw、denvir j(2007)《dna損傷降低了taq dna聚合酶保真度和pcr擴增效率(dna damage reduces taq dna polymerase fidelity and pcr amplification efficiency)》.《生物化學和生物物理研究通訊(biochem biophys res commun)》355(2):431-437)。因此，福爾馬林/甲醛基固定劑對于分子分析并不理想。
[0181]
在本實例中，與施特雷克的無細胞dna尿液保存劑中的甲醛釋放保存劑相比(如實例4中所述)，在存在本保存劑的情況下，評定添加到尿液樣本中的分離白血細胞的細胞穩定性。在紅血細胞的選擇性裂解后，由1ml全血制備白血細胞。將經沉淀和洗滌的白血細胞添加到尿液樣本中，并且使用cfdna含量來測量白血細胞的穩定性/完整性。將來自女性和男性供體的fmfv尿液樣本合并在一起，以分別產生兩個女性合并和兩個男性合并尿液樣本。通過以3,000g離心10至20分鐘，隨后用0.2微米過濾器過濾上清液，對樣本進行“預澄清”。將預澄清尿液樣本等分，并添加白血細胞，隨后以如表13(參見下文)中提及的最終濃度加入本化學物質或施特雷克的無細胞dna尿液保存劑。表15(參見下文)中描述了加入到添加有核白血細胞的預澄清尿液樣本中的儲備溶液(表14)和乙醇的量。將樣本在室溫下孵育30至60分鐘(第0天)，或在根據制造商的方案使用qiaamp循環核酸提取試劑盒進行cfdna提取之前7天執行此操作。使用β-珠蛋白qpcr測定對所提取的cfdna進行定量(參見材料和方法)。
[0182]
數據(參見圖7)表明，在存在本發明的組合物化學物質f的情況下，在室溫下7天后，所添加的白血細胞沒有將基因組dna泄漏到上清液中，其中δc
t
中值幾乎為零，表明隨著時間的推移保存了cfdna并保留了細胞穩定性和完整性。就在室溫下穩定cfdna而言，本發明的組合物在功能上等同于施特雷克的甲醛釋放化學物質，而沒有交聯dna的風險。
[0183]
表13：與添加有核白血細胞的尿液混合后的本組合物的最終濃度。
[0184]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇11.875％
[0185]
表14：儲備溶液的組合物
[0186]
組合物儲備溶液乙酸鈉1750mm
硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0
[0187]
表15：加入到添加有核白血細胞的預澄清尿液中的儲備溶液和乙醇的量。
[0188][0189]
實例8：本組合物在室溫下在女性和男性合并尿液樣本中保持dna甲基化狀態7天。
[0190]
dna甲基化是將甲基加入到dna分子上的過程，是細胞用來控制基因表達的幾種表觀遺傳機制之一。它在如基因表達、胚胎發育、細胞增殖、分化和染色體穩定性等許多生物學過程中起著關鍵作用。異常的dna甲基化通常與dna穩態的喪失和基因組不穩定性相關聯，導致如癌癥等疾病的發展(y li、to tollefsbol(2011)《dna甲基化檢測：亞硫酸氫鹽基因組測序分析(dna methylation detection:bisulfite genomic sequencing analysis)》.《分子生物學方法(methods mol biol)》791:11-21)。
[0191]
在涉及dna甲基化作為表觀遺傳生物標志物的研究中，理想的尿液保存劑溶液必須保持dna的甲基化狀態。因此，為了檢查化學物質f對dna甲基化狀態的影響，使用含有25個ccgg位點的pgl3-堿性質粒進行了體外dna甲基化測定。所述測定涉及如材料和方法部分中描述的以下步驟。1)質粒的體外甲基化，隨后使用限制性核酸內切酶消化確認甲基化(圖8a)。2)對照1x te緩沖液或化學物質f(1x)中孵育的甲基化質粒的亞硫酸氫鹽處理(參見以下表16)，隨后使用如材料和方法部分中描述的引物進行甲基化質粒的純化和pcr擴增。加入到尿液樣本中的儲備溶液(表17)和95％乙醇的量在表18中描述。1x te緩沖液以及化學物質f溶液(圖8b和8c)中孵育的甲基化質粒的～278個堿基對pcr產物的存在，表明用化學物質f處理的女性合并(fp)和男性合并(mp)尿液樣本中的dna的甲基化狀態在室溫下保持了7天。
[0192]
表16：與尿液混合后的組合物的最終濃度。
[0193]
組合物化學物質f乙酸鈉350mm硼酸1％cdta23.8mm果糖9％乙醇19％
[0194]
表17：儲備溶液：
[0195]
[0196][0197]
表18：
[0198]
與尿液混合后的最終濃度儲備溶液(μl)95％乙醇(μl)添加甲基化質粒的尿液(μl)1x chem f101030
[0199]
實例9：在室溫下儲存7天后，本發明的組合物在晨尿首段尿液樣本中保留了人類乳頭瘤病毒(hpv)。
[0200]
宮頸癌由某些類型的生殖器hpv的性獲得性感染引起，根據其與宮頸癌的相關性將hpv分為高風險和低風險(n、bosch fx、de sanjose s、herrero r、castellsaque x、shah kv、snijders pj、meijer cj(2003)《與宮頸癌相關聯的人類乳頭瘤病毒類型的流行病學分類(epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer)》.《新英格蘭醫學雜志(n engl j med)》348(6):518-527.doi:10.1056/nejmoa021641)。hpv16、18、31、33、35、45、52、58、39、51、56和59被歸類為高風險hpv基因型(bouvard v、baan r、straif k、grosse y、secretan b、el ghissassi f、benbrahim-tallaa l、guha n、freeman c、galichet l、cogliano v(2009)《人類致癌物評論b輯：生物試劑(a review of human carcinogens-part b:biological agents)》.《柳葉刀
·
腫瘤學(the lancet oncology)》10:321-322)，根據who，其中兩種hpv類型(16和18)是宮頸癌和癌前宮頸病變的主要原因(70％)。
[0201]
基于有關hpv檢測的文獻，尿液的無創性為宮頸標本中的hpv檢測提供了一種簡單可行的替代方案(vorsters、p van damme、g clifford(2014)《hpv的尿檢：使用首段尿的根本原因(urine testing for hpv:rationale for using first void)》.《英國醫學雜志(bmj)》349:g6252；bernal,s.等人,《用尿液和宮頸樣本檢測人類乳頭瘤病毒(hpv)與cobas 4800hpv測試的比較(comparison of urine and cervical samples for detecting human papillomavirus(hpv)with the cobas 4800hpv test)》,《臨床病毒學雜志(journal of clinical virology)》61(2014)548-552；enerly,e.等人,《尿液樣本中的人類乳頭瘤病毒的患病率的監測：綜述(monitoring human papillomavirus prevalence in urine samples:a review)》,《臨床流行病學(clinical epidemiology)》2013:5 67
–
79)。在本研究中，評估了本組合物對添加外源hpv環狀dna(hpv 16)的尿液的穩定性的影響。與內源性病毒顆粒的混合群體相比，本系統提出了最具挑戰性的情形(未受保護的環狀dna漂浮在尿液空間/基質中)，所述內源性病毒顆粒的混合群體既以受保護的狀態(宮頸細胞內和/或被宿主蛋白覆蓋的顆粒)，也以未受保護的狀態存在于hpv16感染患者的尿液樣本中。
[0202]
健康的男性和女性供體提供晨尿首段(fmfv)尿液標本，這些標本置于冰袋上運輸到實驗室，并合并在一起以產生兩個男性合并和兩個女性合并尿液樣本。在有和沒有本發明的組合物化學物質f(ph 4.7至5.0)的情況下，將純化hpv16質粒dna(參見材料和方法)以1至10ng/ml的濃度添加到大約1ml合并fmfv尿液樣本中，并在室溫下儲存至多7天。與尿液樣本組合后的穩定組合物“化學物質f(chem f)”中的各種組分的最終濃度在表19(下文)中描述。在第0天和第7天，對添加hpv16質粒的尿液樣本的每份200μl等分試樣進行處理，以根
noerholm、s belzer、j skog、mw kattan、a partin、g andriole、g brown、jt wei、im thompson、p cvarroll(2016)《一種在初始活檢時預測高級別前列腺癌的新型尿外泌體基因表達測定(a novel urine exosome gene expression assay to predict high-grade prostate cancer at initial biopsy)》.《美國醫學會雜志腫瘤學(jama oncol)》2(7):882-889.doi:10.1001/jamaoncol.2016.0097)。在樣本收集和運輸到實驗室時的微生物增殖的可能性以及宿主細胞和細胞外囊泡(ev)的不穩定性質推動了對家庭采樣的尿液樣本的穩定的需求，因為對于大規模募集而言，多站點收集和診所收集的負擔越來越高，并導致收集和處理之間的時間存在可變性。因此，針對家庭取樣的尿液穩定的發展為待用于液體活檢分析的各種尿液源性生物標志物(例如，前列腺癌中的尿ev rna)開辟了新的應用。
[0209]
在一個實驗設置中，在標準尿液收集杯中從健康的男性和女性供體收集晨尿首段尿液樣本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將樣本合并在一起，以形成合并尿液標本(mp，男性合并；fp，女性合并)。i)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存30ml合并尿液，并且2)將24ml合并尿液標本與穩定組合物[4ml儲備溶液(表20)和2ml 95％乙醇]混合并儲存。儲備溶液的組合物在表20中描述。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液“化學物質f(chem f)”的最終組合物在表21中描述。在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有chem f的標本的每份10ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后進行0.8μm過濾。用exorneasy maxi試劑盒(凱杰，參見材料和方法)使用離心和過濾后的從每個標本中回收的預澄清上清液進行ev rna提取。使用2100安捷倫生物分析儀和/或ribogreen定量測量所提取的rna樣本的濃度。使用m-mlv逆轉錄試劑盒制備cdna，并使用β-肌動蛋白(actb)taqman測定進行qpcr(參見材料和方法)。對于cdna合成而言，針對給定尿液樣本，使用等量(ng)的未經保存處理和穩定條件的總提取rna。
[0210]
在另一個實驗設置中，男性和女性健康供體使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)提供了隨機(午尿)首段尿液樣本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將樣本合并在一起，以形成合并尿液標本(mp，男性合并；fp，女性合并)。i)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存40ml合并尿液，并且2)將28ml合并尿液標本與12ml化學物質f(chem f)穩定組合物混合并儲存。穩定溶液的組合物在表22i中描述。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液“chem f”的最終組合物在表22ii中描述。在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有chem f的標本的每份17ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后進行0.8μm過濾。在離心和過濾后，從每個標本中回收16ml預澄清上清液，并使用exorneasy maxi試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取ev rna。使用2100安捷倫生物分析儀和/或ribogreen定量測量所提取的rna樣本的濃度(參見材料和方法)。所提取的ev rna的圖譜也在2100安捷倫生物分析儀上測定。對于cdna合成而言，針對給定尿液樣本，使用等量(ng)的未經保存處理和穩定條件的總提取rna。使用m-mlv逆轉錄試劑盒制備cdna，并使用β-肌動蛋白taqman測定進行qpcr(參見材料和方法)。β-肌動蛋白已被認為是使用qpcr測定進行外泌體mrna定量的管家基因(h jiang、z li、x li、j xia(2015)《腫瘤細胞源性外泌體在多器官腫瘤發生中對信使rna進行的細胞間轉移(intercellular transfer of messenger rnas in multiorgan tumorigenesis by tumor cell-derived exosomes)》.《分子醫學報告(mol med rep)》11:4657-4663.doi:
10.3892/mmr.2015.3312；kc miranda、dt bond、m mckee、j skog、tg paunescu、n da silva、d brown、lm russo(2010)《尿外泌體/微囊泡內的核酸是腎臟疾病的潛在生物標志物(nucleic acids within urinary exosomes/microvesicles are potential biomarkers for renal disease)》.《國際腎臟病學(kidney int)》78(2):191-199.doi:10.1038/ki.2010.106；s haque、sr vaiselbuh(2018)《外泌體分子診斷學：通過兩步聚合酶鏈反應將外泌體直接轉化為cdna用于基因擴增(exosomes molecular diagnostics:direct conversion of exosomes into the cdna for gene amplification by two-step polymerase chain reaction)》.《生物方法雜志(j biol methods)》5(3):e96.doi:10.14440/jbm.2018.249；l dong、w lin、p qi、m xu、z wu、s ni、d haung、w-w weng、c tan、w sheng、x zhou、x du(2016)《血清細胞外囊泡中的循環長rna：它們的表征及其作為結直腸癌診斷生物標志物的潛在應用(circulating long rnas in serum extracellular vesicles:their characterization and potential application as biomarkers for diagnosis of colorectal cancer)》.《癌癥流行病學、生物標志物和預防(cancer epidemiol biomarkers prev)》25(7):1158-1166.doi:10.1158/1055-9965.epi-16-0006)。
[0211]
來自兩個實驗設置的總共7個樣本(3個女性合并和4個男性合并尿液樣本)的總體數據被合并并呈現在圖10a中。圖10a示出了在rt下儲存7天后的未經保存處理的和含有穩定溶液的尿液標本中的β-肌動蛋白(actb)rna含量的代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的δc
t
。β-肌動蛋白(actb)rna的δc
t
的增加(δc
t
中值≥+2；圖10a)表明了在室溫下儲存7天的未經保存處理的標本中的ev rna含量的損失。然而，含有chem f的尿液標本中的β-肌動蛋白rna的δc
t
變化不明顯(δc
t
中值幾乎為0；圖10a)，表明在室溫下7天后的ev rna含量的穩定。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的ev rna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖10a(ii)]。圖10b示出了第0天和第7天的來自未經保存處理的和含有chem f的尿液標本的ev rna的代表性電泳圖跡線。電泳圖跡線清楚地表明了第7天的未經保存處理的尿液標本中的ev rna圖譜的顯著變化，這不同于含有chem f的第0天和第7天的標本，后者表現出與未經保存處理的第0天的標本相似的ev rna圖譜。
[0212]
在另一個實驗設置中，男性和女性健康供體使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)提供了隨機(午尿)首段尿液樣本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將樣本合并在一起，以形成合并尿液標本(mp，男性合并；fp，女性合并)。將合并尿液的等分試樣在以下條件下儲存：1)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下，2)以尿液/化學物質比1:0.43與含有不同的糖的儲備溶液[表22(i)]混合并儲存。所有標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在表22(iv)中描述。在第0天和第7天，將未經保存處理的、含有chem f和含有施特雷克保存劑的尿液標本的每份8.5ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后進行0.8μm過濾(minisart目錄號16592，或目錄號16592，或-aa，目錄號slaa033sb)。在離心和過濾后，從每個樣本中回收8ml預澄清上清液，并使用超濾提取ev rna(參見材料和方法中的ev rna提取)。使用ribogreen定量測量所提取的rna樣本的濃度(參見材料和方法)。對于cdna合成而言，針對給定尿液樣本，使用等量(ng)的未經保存處理和穩定條件的總提取rna。使用m-mlv逆轉錄試劑盒制備cdna，并使用β-肌動蛋白taqman測定進行qpcr(參見材料和方法)。
[0213]
圖10c(i)示出了在rt下儲存7天后的未經保存處理的和含有穩定溶液的尿液標本中的β-肌動蛋白(actb)rna含量的代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的δc
t
δc
t
。β-肌動蛋白(actb)rna的δc
t
的增加[δc
t
中值》+3.5，圖10c(i)]表明了室溫下儲存7天的未經保存處理的標本中的ev rna含量的損失。含有chem f和chem g的標本表現出β-肌動蛋白rna的δc
t
中值分別為1.5和1.1，表明在室溫下7天后的ev rna含量的有效穩定[圖10c(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的ev rna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖10c(ii)]。
[0214]
在另一個實驗設置中，男性和女性健康供體使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)提供了隨機(午尿)首段尿液樣本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將樣本合并在一起，以形成合并尿液標本(mp，男性合并；fp，女性合并)。將合并尿液的等分試樣在以下條件下儲存：1)在不存在穩定組合物(na，未經保存處理)的情況下，2)以尿液/化學物質比1:0.43與化學物質f穩定組合物混合，和3)與5ml施特雷克的尿液保存劑(目錄號230216)混合并儲存。穩定溶液的組合物在表23(i)中描述。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在表23(ii)中描述。在第0天和第7天，將未經保存處理的、含有chem f和含有施特雷克保存劑的尿液標本的每份11ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后進行0.8μm過濾。在離心和過濾后，從每個標本中回收10ml預澄清上清液，并使用exorneasy maxi試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取ev rna。使用ribogreen定量測量所提取的rna樣本的濃度(參見材料和方法)。對于cdna合成而言，針對給定尿液樣本，使用等量(ng)的未經保存處理和穩定條件的總提取rna。使用m-mlv逆轉錄試劑盒制備cdna，并使用β-肌動蛋白taqman測定進行qpcr(參見材料和方法)。
[0215]
圖10d(i)示出了在rt下儲存7天后的未經保存處理的和含有穩定溶液的尿液標本中的β-肌動蛋白(actb)rna含量的代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的δc
t
。β-肌動蛋白(actb)rna的δc
t
的增加[δc
t
中值≥+3.5，圖10c(i)]表明了室溫下儲存7天的未經保存處理的標本中的ev rna含量的損失。含有chem f的標本表現出β-肌動蛋白rna的δc
t
中值為+1.1，表明在室溫下7天后的ev rna含量的有效穩定。另一方面，盡管在7天穩定性時間點(t7)表現出β-肌動蛋白rna的δc
t
中值為+1.8，但含有施特雷克保存劑的尿液標本在第0天時間點表現出ev rna的顯著損失(δc
t
中值為+3.3)，表明ev rna穩定性和含量的總體損失[圖10d(ii)]。
[0216]
表20：與尿液混合前的本發明組合物。
[0217]
組合物儲備溶液乙酸鈉1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0
[0218]
表21：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0219]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉233.3mm
硼酸0.67％cdta15.9mm果糖6.0％乙醇6.3％
[0220]
表22(i)：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0221]
組合物儲備溶液乙酸鈉771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0
[0222]
表22(ii)：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0223]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％
[0224]
表22(iii)：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0225][0226]
表22(iv)：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0227]
組合物穩定溶液(chem f)穩定溶液(chem g)乙酸鈉225mm225mm硼酸0.7％0.7％cdta15mm15mm糖6％6％乙醇6.9％6.9％
[0228]
表23(i)：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0229]
組合物儲備溶液乙酸鈉750mm
硼酸2.2％cdta50mm果糖20％乙醇23％ph5.0至5.2
[0230]
表23(ii)：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0231]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉225mm硼酸0.7％cdta15mm果糖6％乙醇6.9％
[0232]
實例11：用于在室溫下保存尿液中的無細胞rna(cfrna)的穩定組合物。
[0233]
男性和女性健康供體使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)提供了隨機(午尿)首段尿液樣本。將標本置于冰袋上運輸到實驗室，在實驗室中，將樣本合并在一起，以形成合并尿液標本(mp，男性合并；fp，女性合并)。將合并尿液的等分試樣在以下條件下儲存：在1)不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下，2)以尿液/化學物質比1:0.43與化學物質f穩定組合物混合并儲存。穩定溶液的組合物在表24中描述。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液的最終組合物在表25中描述。在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有chem f的尿液標本的每份2.5ml等分試樣在室溫下以3,000g離心10分鐘，隨后進行0.8μm過濾。在離心和過濾后，從每個標本中回收2ml預澄清上清液，并使用qiaamp循環核酸提取試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞核酸。對所提取的核酸進行dna酶消化以去除dna污染，以進行總無細胞rna的有效純化。使用ribogreen定量測量所提取的rna樣本的濃度(參見材料和方法)。對于cdna合成而言，針對給定尿液樣本，使用等量(ng)的未經保存處理和穩定條件的總提取rna。使用m-mlv逆轉錄試劑盒制備cdna，并使用β-肌動蛋白taqman測定進行qpcr(參見材料和方法)。
[0234]
圖11(i)示出了在rt下儲存7天后的未經保存處理的和含有chem f的尿液標本中的β-肌動蛋白(actb)rna含量的代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的δc
t
。δc
t
中值的增加(+2.5)表明了在未經保存處理的標本在室溫下儲存7天后，無細胞rna含量減少；然而，相比之下，在室溫下7天后的含有化學物質f的標本中的β-肌動蛋白無細胞rna水平的變化較小，如δc
t
中值1.3所示[圖11(i)]。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的無細胞rna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有顯著變化[圖11(ii)]。
[0235]
表24：儲備溶液的組合物
[0236]
組合物儲備溶液乙酸鈉750mm硼酸2.2％cdta50mm果糖20％
乙醇23％ph4.7至5.0
[0237]
表25：與尿液混合后的本組合物的最終濃度。
[0238]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉225mm硼酸0.7％cdta15mm果糖6％乙醇6.9％
[0239]
實例12：用于在室溫下保存尿液中的尿細胞rna的穩定組合物。
[0240]
本實例包含兩項獨立的研究。在第一項研究中，使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)收集來自8名男性和8名女性供體的午尿首段尿液樣本，并將其合并以形成總共4個合并尿液標本(2個男性(mp)和2個女性(fp))。i)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存標本，每份40ml，并且ii)將每份28ml的尿液標本與12ml儲備溶液混合(表26)。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的最終組合物在以下表27中描述。
[0241]
在第二項研究中，4名健康供體提供了30ml晨尿首段(fmfv)尿液標本，并將他們的尿液樣本合并在一起以產生兩個合并尿液標本。i)在不存在穩定組合物(未經保存處理，na)的情況下儲存標本，每份30ml，并且ii)將每份24ml的尿液標本與4ml儲備溶液(表28)和2ml 95％乙醇混合。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的穩定溶液“chem f”的最終組合物在以下表29中描述。為了進行比較，將25ml尿液與5ml施特雷克的尿液固定劑(參考組合物)混合，所述固定劑在商業上被稱為“無細胞dna尿液保存劑”(目錄號230216)，并在室溫下儲存至少7天。所述參考組合物包括甲醛釋放劑咪唑烷基脲以及k3edta和甘氨酸。
[0242]
在第0天和第7天，將未經保存處理的、含有chem f和含有施特雷克的保存劑的尿液標本的每份15至16ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。在離心后，從每個標本中回收總細胞沉淀，并根據制造商的方案使用如材料和方法中描述的trizol ls試劑(研究i)或凱杰rneasy plus迷你試劑盒(研究ii)提取尿細胞rna。使用基于β-肌動蛋白(actb)taqman的rt-qpcr實驗對所提取的細胞rna進行靶向mrna分析，如所述進行(參見材料和方法)。
[0243]
來自第一實驗設置的總共4個樣本(2個女性合并和2個男性合并尿液樣本)的總體數據被合并并呈現在圖12a中。圖12a(i)示出了在rt下儲存7天后的未經保存處理的和含有chem f的尿液標本中的β-肌動蛋白(actb)rna含量的代表[c
t(t7)-c
t(t0)
]的δc
t
。細胞β-肌動蛋白(actb)rna含量的δc
t
急劇增加，表明了在室溫下儲存7天的未經保存處理的標本中的細胞rna含量的顯著損失。然而，與未經保存處理的標本相比，含有chem f的標本中的細胞β-肌動蛋白rna的δc
t
顯著更低(圖12a(i))，這表明了在室溫下7天后的含有穩定溶液的尿液標本中的細胞rna穩定性。此外，在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的細胞rna含量相對于未經保存處理的(na)樣本沒有重大變化[圖12a(ii)]。
[0244]
圖12b(i)進一步示出了細胞β-肌動蛋白(actb)rna含量的δc
t
的急劇增加，表明
了在室溫下儲存7天的未經保存處理的以及含有施特雷克的尿液保存劑的標本中的細胞rna含量的顯著損失。然而，與未經保存處理的和含有斯特瑞克的保存劑的標本相比，含有chem f的標本中的細胞β-肌動蛋白的δc
t
顯著更低[圖12b(i)]。此外，當與含有chem f的標本相比時，含有施特雷克的保存劑的標本表現出在收集時(第0天)的加入化學物質的尿液樣本中的細胞rna含量相對于未經保存處理的(na)樣本的更多變化[圖12b(ii)]。總的來說，本數據表明了在室溫下7天后的含有本穩定組合物的標本中的細胞rna穩定性。
[0245]
表26：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0246]
組合物儲備溶液乙酸鈉771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0
[0247]
表27：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0248]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％乙醇6.7％
[0249]
表28：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0250]
組合物儲備溶液乙酸鈉1750mm硼酸5％cdta119mm果糖45％ph4.7至5.0
[0251]
表29：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0252][0253][0254]
實例13：用于在室溫下保存尿液中尿細胞dna的穩定組合物。
[0255]
在本研究中，使用colli-首段尿液收集裝置(諾沃桑尼斯)收集了來自6名男
性和6名女性健康供體的午尿首段尿液樣本，并將其合并以形成總共4個合并尿液標本[2個男性合并(mp)和2個女性合并(fp)]。i)在不存在穩定組合物(未經保存處理)的情況下儲存標本，每份30ml，并且ii)將每份21ml的尿液標本與9ml儲備溶液(表30)混合。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與尿液混合后的最終組合物在以下表31中描述。
[0256]
在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有chem f的標本的每份15ml等分試樣在室溫下以3000g離心10分鐘。在離心后，從每個標本中回收總細胞沉淀，并根據制造商的方案使用qiaamp dna迷你試劑盒(凱杰)提取尿細胞dna。使用基因組dna膠條在安捷倫4200tapestation上評定所提取的細胞dna的圖譜。使用所提取的dna來擴增～1kb的pcr產物(gapdh基因)，以如所述測量dna穩定性(參見材料和方法)。
[0257]
圖13a示出了未經保存處理的(na)和含有化學物質f的尿液標本中的第0天和第7天提取的細胞dna的tapestation圖譜。在fp樣本中，在室溫下儲存7天的未經保存處理的標本中的高分子量基因組dna有一致的顯著損失。在mp未經保存處理的樣本中，由于細菌生長，一個合并樣本表現出高分子量基因組dna的增加，而第二合并樣本表現出在室溫下7天后的高分子量基因組dna的顯著減少。然而，在室溫下7天后，在含有chem f的fp和mp尿液標本中，高分子量基因組dna的圖譜得以保留(圖13a)；從而表明細胞dna穩定性。接下來，對擴增子大小為～1kb的gapdh基因進行靶向擴增，以確定在第0天和第7天時間點的未經保存處理的和含有chem f的尿液標本中的高分子量dna條帶的穩定性。
[0258]
圖13b示出了gapdh pcr擴增的結果。～1kb的產物的存在有力地表明了在室溫下儲存7天后的含有chem f的fp和mp的尿液標本中的人類細胞dna穩定性。gapdh pcr擴增在未經保存處理的標本中失敗，表明缺乏人類細胞dna穩定性。如材料和方法中所述，對從fp和mp標本中提取的dna進行細菌16s qpcr。細菌16s qpcr表明在rt下保存7天的fp和mp未經保存處理的尿液樣本中的細菌dna含量的百分比急劇增加；這不同于含有化學物質f(chem f)的標本，后者表現出第7天的細菌dna含量相對于第0天沒有顯著變化(圖13c)。總的來說，數據表明在室溫下儲存7天后的含有穩定溶液的尿液標本中保存了人類細胞dna并防止了細菌生長。另一方面，在室溫下儲存7天后，未經保存處理的標本表現出人類細胞dna的完全損失和細菌dna的急劇增加。
[0259]
表30：與尿液混合前的本發明的組合物。
[0260]
組合物儲備溶液乙酸鈉771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0
[0261]
表31：與尿液混合后的本發明的最終組合物。
[0262]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm
果糖5.9％乙醇6.7％
[0263]
實例14：用于保存在室溫下儲存的唾液樣本中的無細胞核酸圖譜的穩定組合物。
[0264]
像尿液一樣，唾液采樣簡單、安全、廉價，是家庭收集的理想選擇。唾液由各種分子(例如，酶、激素、抗體、粘蛋白、生長因子、核酸、外泌體和抗微生物成分)構成，這些分子從滋養唾液腺的脈管系統中過濾、加工和分泌。這些中的許多通過跨細胞或細胞間途徑穿過細胞之間的空間從血液進入唾液。因此，血液中發現的大多數化合物也存在于唾液中。因此，唾液表現出監測健康和疾病的高度潛力(y-h lee和dt wong(2009)《唾液：一種用于疾病的早期檢測的新興生物流體(saliva:an emerging biofluid for early detection of diseases)》.《美國牙科雜志(am j dent)》22(4):241-248；k-a hyun、h gwak、j lee、b kwak、h-i jung(2018)《用于癌癥檢測的唾液外泌體和無細胞dna(salivary exosome and cell-free dna for cancer detection)》.《微型機械(micromachines)》9:340)。
[0265]
在本研究中，從6名健康個體收集原始唾液樣本，并混合在一起以形成合并唾液樣本。i)將7ml合并唾液樣本與3ml 1x te緩沖液(賽默飛世爾科技；目錄號am9858)(未經保存處理)混合，并且ii)將7ml合并唾液與3ml儲備溶液(參見表32)混合。將te緩沖液加入到未經保存處理的標本中，以克服唾液的粘液性質，從而有效分離細胞外和細胞區室。兩種類型的標本在室溫(23
±
3℃)下儲存至少7天。與唾液混合后的最終組合物在以下表33中描述。
[0266]
在第0天和第7天，將未經保存處理的和含有化學物質f(chem f)的標本的每份4.5ml等分試樣在室溫下以3,800g離心20分鐘。在離心后，從每個標本中回收4.0ml上清液，并使用qiaamp循環核酸試劑盒(凱杰，參見材料和方法)提取無細胞核酸。使用hs d5000膠條(安捷倫；目錄號5067-5592)在安捷倫4200tapestation上評定所提取的無細胞核酸的圖譜。圖14示出了未經保存處理的(na)和經保存處理的含有chem f的唾液標本中的第0天和第7天提取的無細胞dna的tapestation圖譜。tapestation數據(圖14)清楚地表明了在室溫下7天后的含穩定溶液的唾液樣本中的無細胞dna圖譜的保存，而與第0天的圖譜相比，在室溫下7天后的未經保存處理的樣本中的無細胞dna圖譜有顯著變化。
[0267]
表32：與唾液混合前的本發明的組合物。
[0268]
組合物儲備溶液乙酸鈉771.2mm硼酸2.2％cdta52.4mm果糖19.8％乙醇22.4％ph5.0
[0269]
表33：與唾液混合后的本發明的最終組合物。
[0270]
組合物穩定溶液(chem f)乙酸鈉231.4mm硼酸0.67％cdta15.7mm果糖5.9％
乙醇6.7％
[0271]
本說明書中提及的所有公開案、專利和專利申請案指示本發明所屬領域的技術人員的技術水平且通過引用并入本文，其程度如同指示每一個別公開案、專利或專利申請案專門且個別地通過引用并入。
[0272]
已如此描述了本發明，將顯而易見的是，本發明可以多種方式變化。此類變化不應視為脫離本發明的精神和范圍，且本領域的技術人員將清楚的是，所有此類修改旨在包含在隨附權利要求的范圍內。權利要求的范圍不應限于為描述而設置的優選實施例，而應被給予與描述整體一致的最廣泛的解釋。